CN108685904A - 醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用 - Google Patents

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郭强
曹震
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Abstract

本发明公开了醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。发明人通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色、免疫荧光、逆转录‑聚合酶链反应和免疫印迹分析，评估了醉椒素(kavain)对破骨细胞分化、破骨细胞骨吸收和成骨细胞分化的影响。结果表明，Kavain通过阻断钙介导的NFAT和MAPK通路的激活而抑制RANKL诱导的破骨发生，而NF‑κB不受影响；Kavain也抑制破骨细胞的骨吸收，但对成骨细胞的分化和增殖无明显影响。此外，Kavain还能抑制破骨细胞的形成，以防止去卵巢(OVX)小鼠的骨丢失。同时，数据显示天然化合物Kavain的破骨细胞特异性作用，表明其在治疗骨质疏松疾病方面的潜在治疗价值。

Description

醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用
技术领域
本发明属于骨疾病治疗技术领域，尤其涉及醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。
背景技术
骨重建共同指骨吸收和骨形成的过程，这两个过程之间的平衡保持正常的骨稳态。若骨吸收超过骨合成则是骨溶解和骨质疏松的病理特征。破骨细胞是行使骨吸收功能的主要细胞，破骨细胞在骨重塑过程中负责骨吸收，破骨细胞数量的增加和骨吸收活性的增强是导致骨质疏松等相关疾病的主要因素。因此，调节破骨细胞的形成和功能是治疗骨质疏松和骨质疏松症的关键，探讨破骨细胞分化和功能的调控机制对骨质疏松的治疗具有重要意义。
破骨细胞是由单核细胞/巨噬细胞造血谱系衍生的巨大的多核细胞。核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M CSF)在破骨细胞分化和成熟中起关键作用。巨噬细胞集落刺激因子激活ERK1/2和磷脂酰化肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)信号在破骨早期发生中的作用。RANKL激活其受体等级并触发多个信号级联，包括核因子κ-B(NF-κB)相关信号级联、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、钙信号通路，这些途径进一步共同调节活化T细胞胞质1核因子的表达(NFATc1)，它可以自我扩增，是参与破骨细胞终末分化的关键转录因子之一。
目前，几种抑制破骨细胞介导的骨吸收的抗骨吸收药物在临床上得到了广泛的应用。然而，骨质疏松症的治疗仍然存在一定的局限性，需要寻找进一步的替代治疗方案。天然化合物及其衍生物在开发新的治疗方法中起着不可或缺的作用。Kavain(醉椒素)是从卡瓦胡椒的根部提取的有效成分，具有抗炎和抗氧化作用，Kavain及其衍生物目前被用于治疗神经疾病，用作松弛剂、镇静剂和抗焦虑药。卡文降低脂多糖(LPS)诱导的肿瘤小鼠巨噬细胞和人外周血单个核细胞中的坏死因子α(TNF-α)分泌。此外，Kavain保护神经细胞免受AM乙型β肽诱导NRF 2激活介导的保护性基因表达诱导神经毒性。Kavain对骨稳态的影响，特别是对破骨细胞和成骨细胞分化的影响尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用，这为骨质疏松治疗提供了新的方案，也为深入开发天然植物卡瓦开辟了新途径。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。
上述骨质疏松由卵巢切除引起。
目前，醉椒素在骨质疏松中的作用还没有被报道。因此，发明人通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色、免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹分析，评估了醉椒素(kavain) 对破骨细胞分化、破骨细胞骨吸收和成骨细胞分化的影响。结果表明，Kavain通过阻断钙介导的NFAT和MAPK通路的激活而抑制RANKL诱导的破骨发生，而NF-κB不受影响； Kavain也抑制破骨细胞的骨吸收，但对成骨细胞的分化和增殖无明显影响。此外，Kavain 还能抑制破骨细胞的形成，以防止去卵巢(OVX)小鼠的骨丢失。同时，数据显示天然化合物Kavain的破骨细胞特异性作用，表明其在治疗骨质疏松疾病方面的潜在治疗价值。
附图说明
图1是kavain抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的研究结果图，图中：(A)在不同浓度的kavain处理后，BMMs TRAcP染色的代表性图像(标尺200μm)；(B)破骨细胞数的定量(TRAP阳性≥3个核)；(C)通过MTS细胞活力测定评估的kavain对BMMs的细胞毒性；(D) 是kavain抑制RANKL诱导的破骨细胞融合的TRAcP图(第一行)和共同聚焦图像(第二行F-actin和DAPI(细胞核)染色，标尺200μm)；(E)单个视野内破骨细胞平均核数；图中数据用均数±标准差表示，治疗组和对照组之间的显著性差异标示为*(p＜0.05)或** (p＜0.01)；
图2是kavain抑制RANKL诱导的破骨细胞羟基磷灰石吸收活性的研究结果图，图中：(A)TRAcP染色的破骨细胞(第一行)和破骨细胞去除后的检测表面的典型图像(第二行，4X；第三行，10X，标尺200μm)；(B)每孔中破骨细胞的数量；(C)每孔骨吸收面积的量化；图中数据用均数±标准差表示，治疗组与对照组的显著性差异为**(p＜0.01)或 ***(p＜0.001)。
图3是kavain抑制破骨细胞标志基因和下游蛋白表达的研究结果图，图中：用 M-CSF(50ng/ml)和GST-rRANKL(100ng/ml)处理BMMs，添加不同浓度kavain并设无药物对照，各基因表达水平以内参Hmbs进行标准化；A、B、C、D分别为检测破骨细胞分化过程中Nfatc 1(A)、Atp6v0d2(B)、Ctsk(C)和Acp 5(D)mRNA的相对水平；(E)添加kavain 并设无药物对照，用GST-rRANKL(100ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)诱导的NFATc 1、integrin β3、CTSK、V-ATPase-D2、MMP9、DC-STAMP和ACTB(β-actin)的Western blot结果；测定NFATc 1、integrinβ3、CTSK、V-ATPase-D2、MMP9和DC-STAMP与ACTB的比值。图中数据用均数±标准差表示，治疗组与对照组的显著性差异为*(p＜0.05)、**(p＜0.01)或 ***(p＜0.001)。
图4是kavain抑制NFATc 1活性和细胞内钙离子水平的研究结果图，图中：(A)转染NFATc 1荧光素酶结构的RANKL刺激RAW 264.7细胞的荧光素酶活性，转染细胞用相应浓度的kavain预处理后，用GST-rRANKL(100ng/ml)刺激24h；(B)只用M-CSF(50ng/ml) 刺激后三个典型细胞的钙离子振荡结果(阴性对照)；(C)，用GST-rRANKL(100ng/ml)和 M-CSF(50ng/ml)刺激后三个典型细胞的钙离子振荡结果(阳性对照)；(D)用 GST-rRANKL(100ng/ml)、M-CSF(50ng/ml)和kavain刺激后三个典型细胞的钙离子振荡结果；(E)平均每个细胞钙离子振荡强度。图中数据用均数±标准差表示，治疗组与对照组的显著性差异为*(p＜0.05)或***(p＜0.001)。
图5是kavain在RANKL诱导破骨细胞生成过程中抑制MAPK通路的研究结果图，图中：用RANKL(100ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)诱导BMMS在kavain存在下60分钟，用P JNK1 /2、JNK、P-ERK1/2、ERK、p-P38和P38的特异性抗体对蛋白印迹进行检测，测定磷酸化蛋白相对于未磷酸化蛋白的相对表达水平；图中的数据用均数±标准差表示，治疗组与对照组比较有显著性差异*(p＜0.05)，**(p＜0.01)or***(p＜0.001)。
图6是kavain可以抑制卵巢切除引起的小鼠骨质疏松，图中(A)三组小鼠(假手术组，卵巢切除组和卵巢切除组+kavain)经MicroCT扫描后的股骨冠状面、股骨远端横截面。绿色虚线框表示用MicroCT重建分析的区域；(B)三组小鼠(假手术组，卵巢切除组和卵巢切除组+kavain)股骨远端干骺端的TRAP染色，标尺200μm和400um；(C)三组小鼠(假手术组，卵巢切除组和卵巢切除组+kavain)股骨远端的骨密度(BMD)和松质骨体积百分比的比较结果；(D)TRAP染色分析三组单位骨表面的破骨细胞数目。图中的数据用均数±标准差表示，治疗组与对照组比较有显著性差异*(p＜0.05)，**(p＜0.01)or ***(p＜0.001)。
图7是kavain影响破骨细胞分化的机制示意图，图中：kavain通过阻断钙介导的NFAT 和MAPK通路的激活而抑制RANKL诱导的破骨发生，而NF-κB不受影响。
图8是Kavain对BMMs的凋亡研究结果图，图中：(A)用不同剂量的kavain处理的完全培养基处理48小时的BMM的细胞凋亡率的FCM分析。(B)细胞凋亡率的定量分析。
图9是kavain对RANKL诱导的NF-κB活化的研究结果图，图中：(A)用NF-κB荧光素酶构建体转染RAW264.7细胞，用指定浓度的kavain预处理转染的细胞，随后用 GST-rRANKL(100ng/mL)刺激6小时后测得荧光活性值。(B)在kavain存在下用RANKL (100ng/mL)和M-CSF(50ng/mL)诱导的来自BMM的IκB-α和ACTB的代表性Western 印迹图像。条带下为测定的IκB-α相对于ACTB的比例。
图10是kavain对成骨细胞的增殖和分化的研究结果图，图中：(A-B)用不同浓度kavain处理24小时和48小时的MC3T3-F1细胞的MTS分析。(C)不同组中MC3T3-F1细胞的代表性ALP染色图像(第7天)。(D)不同组(第0天和第7天)MC3T3一F1细胞中Alp 的相对mRNA表达水平。(E-F)来自MC3T3-F1细胞的Runx2和Collal在不同组(第0天和第7天)中的相对mRNA表达水平。图中的数据代表平均值±标准差。
具体实施方式
一、材料
1.材料
阿尔法改良最小必需培养基(α-MEM)和胎牛血清(FBS)是从热费舍尔科学(Scoresby，澳大利亚)购买。Kavain是由南京大学谭仁祥研究团队提取纯化，在磷酸盐缓冲溶液中以 1mM的浓度储存。抗整合素-β3，MMP 9，DC-STAMP，ctsk，nfATc 1，iκB-α，erk，ink，p38，ph抗体从圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz，CA)获得。(P)ERK、p-p38、p-JNK和β-actin、V-ATP酶D2抗体的制备参考文献(Feng H，Cheng T，Steer JH，Joyce DA，Pavlos NJ，Leong C，Kular J，Liu J，Feng X，Zheng MH，Xu J.2009.Myocyte enhancer factor 2 andmicrophthalmia-associated transcription factor cooperate with NFATcl totransactivate the V-ATPase d2 promoter during RANKL-inducedosteoclastogenesis. The Journal of biological chemistry 284(21)：14667-14676.)。MTS从澳大利亚悉尼的 Promega公司获得荧光素酶分析系统。从R&D系统(明尼阿波利斯，MN)获得重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。白细胞酸pho sphatase染色试剂盒从Sigma-Aldrich(澳大利亚悉尼)获得。重组gst-rRANKL蛋白的表达和纯化参考徐等人的文献(Xu J，Tan JW，Huang L， Gao XH，Laird R，Liu D，Wysocki S，ZhengMH.2000.Cloning，sequencing，and functional characterization of the rathomologue of receptor activator of NF-kappaB ligand.J Bone Miner Res.Nov；15(11)：2178-86.)。
2.细胞培养
RAW264.7小鼠巨噬细胞和MC3T3-F1前成骨细胞来源于美国型培养集落(Manassas， VA)。RAW 264.7和MC3T3-F1分别在α-MEM和添加10％FBS、2mm L-谷氨酰胺、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的条件下培养。取6周龄C57BL/6J小鼠骨髓单核细胞(Bmms)，按西澳大利亚大学动物伦理委员会批准的程序进行安乐死(RA/3/100/1244)，取长骨游离软组织，将骨髓从股骨和胫骨中冲洗，然后在M-CSF(50ng/mL)存在下，在完全培养基中培养。
3.小鼠
12周龄雌性C57BL/6J小鼠由第三军医大学动物中心提供。所用动物规程已获第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。所有动物程序都是严格按照批准的指南进行的。小鼠分为假手术组(n＝4)、去卵巢小鼠组(n＝4)和Kavain组(n＝4)。PBS或Kavain在腹腔注射，每周3次，共6周。最后一次给药后第1天，用颈椎脱位处死所有处理过的小鼠。
二、方法
1.细胞凋亡分析
将bmms以1×105个细胞/孔的密度在6孔培养板上进行处理，在不同浓度的Kavain存在下，用含M-CSF的完整培养基(50ng/mL)处理48小时。应用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(KGA，KeyGEN，Biotech)流式细胞仪检测BMMS细胞凋亡。按照制造商的指示，采用流式细胞术(Becton Dickinson和Beckman-Coulter，San Jose，CA，USA)在488 nm处测定细胞凋亡率。
2.成骨细胞分化试验
将MC3T3-F1细胞接种于6孔培养板中，密度为5×105个/孔，用成骨细胞分化培养基处理。培养基由地塞米松(10nmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和β-甘油磷酸盐(5mmol/L) 组成，每3天更换一次。
3.破骨细胞分化实验
药物浓度筛选试验采用上述分离的BMMS来评价RANKL诱导的破骨作用，BMMS以6×103个细胞/孔的密度种于96孔培养板中。在不同浓度的Kavain存在下，用含M-CSF和 GST-rRANKL(50ng/mL)的完整培养基处理。细胞培养基每2天更换一次细胞培养液每2天更换一次。5天后细胞用4％多聚甲醛固定10min，用pbs洗涤3次，然后用细胞酸性磷酸酶染色试剂盒进行酒石酸抗酸性磷酸酶(TRACP)酶活性的染色，遵循制造商的程序进行。 TRACP阳性多核细胞(＞3核)为破骨细胞。
4.细胞毒性实验
将BMMS和MC3T3-F1接种到96孔板上，每孔6×103个细胞，隔夜进行粘附。第二天，用不同浓度的Kavain孵育细胞。48小时后，加入20μL/孔的mts溶液，与细胞共孵育2h。用全自动定量绘图酶标仪读取490nm处的吸光度(MultiScan谱、热实验室系统、 Chantillv，VA)。
5.免疫荧光染色
BMMS在MCSF(50ng/mL)存在下，密度为6×103细胞/孔，M-CSF和GST-rRANKL(50ng/mL) 刺激细胞3d。然后用不同浓度的Kavain处理破骨前细胞48小时。破骨前细胞先用不同浓度Kavain处理48h，然后用4％多聚甲醛固定，再用0.1％TritonX-100 pbs渗透，然后在PBS中用3％的BSA封闭。然后，将细胞与罗丹明结合的phalloidin在黑暗中孵育45分钟，使F-actin环染色，然后用pbs清洗，细胞用DAPI对细胞核进行染色，并固定在共聚焦显微镜下。
6.羟基磷灰石吸收试验
为检测破骨细胞活性，将bmms培养在6孔胶原涂层板上(每孔1×105个细胞)(bd生物涂层、热Fisher、Scoresby、澳大利亚)，并以50ng/mL gst-rRANKL和50ng/mL M-CSF 刺激，直到成熟的破骨细胞被产生。细胞用细胞解离液轻轻分离(西格玛-奥尔德里奇，澳大利亚悉尼)，同样数量的成熟破骨细胞被播羟基磷灰石涂层96孔板中。成熟的破骨细胞在含GST-rRANKL和M-CSF的培养基中孵育，同时加入或不加Kavain。48小时后，一半数量的孔进行TRACP活性的组织化学染色，以评估每孔多核细胞的数量，剩下的孔被漂白10 分钟以便移除细胞衡量骨吸收区域面积。在标准光学显微镜下拍摄吸收区域后应用ImageJ 软件(NIH、Bethesda、MD)定量测定破骨细胞吸收羟基磷灰石表面的百分比。
7.荧光素酶报告试验
为研究NF-κB和NFATc 1的转录激活作用，将NF-κB应答荧光素酶报告结构或NFATc1应答荧光素酶应答基因稳定转染到RAW 264.7细胞。转染细胞在密度为1.5×105个/孔的48孔板中培养，并经不同浓度的kavain预处理1小时后，用GST rRANKL(50ng/m1)刺激6小时(NF-κB荧光素酶报告基因检测)或24小时(NFAT荧光素酶报告基因)刺激预处理细胞。用荧光素酶报告分析系统(Promega，澳大利亚悉尼)检测荧光素酶活性。
8.细胞内钙振荡的测定
用钙结合染料Fluo4-AM(分子探针，热Fisher科学，Scoresby，澳大利亚)对钙振荡进行了研究。具体是将BMMS接种到48孔板中，浓度为1×104个/孔；第二天，用含有15 μMkavain和gst-r的完整培养基代替培养基作用24h。细胞用分析缓冲液(Hanks平衡盐溶液，加1mm丙磺舒和1％FBS)洗涤，然后用4mm Fluo 4染色液在37℃下孵育45min。在试验缓冲液中放置一次，在室温下孵育20分钟，将细胞在测定缓冲液中洗涤一次，在室温下孵育20分钟，随后在分析缓冲液中进一步洗涤两次，并使用倒置荧光显微镜观察，激发波长488nm。每2秒采集一次图像2min，用Nikon基础研究软件进行钙流量分析。
9.碱性磷酸酶染色
将MC3T3-F1细胞接种于密度为2×104个/孔的48孔板中，用Kavain处理7天，每3天换一次培养基。然后用4％多聚甲醛固定20分钟，用100μL bcp染色(西格玛-奥尔德里奇，澳大利亚悉尼)，在37℃的黑暗中固定30分钟。移除染色液细胞用磷酸盐缓冲液冲洗，用数码相机拍照。
10.蛋白印迹法
BMMS在含M-CSF的6孔板中培养，用50ng/mL GST-rRANKL刺激。用放射免疫沉淀(RIPA) 裂解缓冲液溶解细胞，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质，将其转移到聚偏氟乙烯(PVDF) 膜(GE Healthcare，Silverwater，澳大利亚)上。用5％脱脂乳阻封闭1小时，用各种特异性抗体在4℃处轻轻摇动一夜，用辣根过氧化物酶(HRP)结合的次级抗体对膜进行洗涤和孵育。然后用增强化学发光试剂检测抗体反应性(美国药典生物技术公司，Piscataway， NJ)，在图像量化LAS 4000上显示(GE Healthcare，Silverwater，澳大利亚)。
11.显微CT分析和组织学分析
用比利时Kontich的BrukerMicroCT Skyscan 1272系统对整个股骨进行成像，体素尺寸为10.0μm。扫描采用4％多聚甲醛，X射线管电位为60kV，X射线强度为166个μA，曝光时间为1700ms。小梁骨的阈值为86-255(8位灰度位图)。采用各向同性体素大小为 148μm，对小鼠全身(头骨除外)进行了微CT扫描。重建用NRecon(Ver)完成。利用原始灰度图像(CTvox，Ver)的距离变换方法，从等高线二维图像中获取三维图像。用CT分析仪软件(Ver)进行三维和二维分析。提出的所有图像都代表各自的组。
对于骨的组织学分析，将股骨解剖并固定在4％多聚甲醛PBS中48小时。然后将15％的四氢呋喃EDTA浸泡溶液每日变化2周，然后脱钙股骨。脱钙股骨通过一系列浓度增加的乙醇脱水，在二甲苯中清除两次，嵌在石蜡中。然后将股骨从前、后沿冠状板切成8μm 厚的部分。脱钙股骨段用TRAP染色。
12.统计学方法
另有说明外，所有数据均代表至少三个类似结果的实验一式三份。数据以平均值±SD 表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和学生-Newman-Keuls后测来确定结果间差异的显着性，P＜0.05，差异有显着性(P＜0.05)。
三、结果
1.Kavain抑制RANKL诱导的破骨细胞形成与融合
为探讨Kavain对破骨作用的影响，将BMMS在50ng/mL M-CSF和100ng/mL RANKL 存在下，在不同浓度的Kavain培养基中培养5d。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色结果表明，添加15和20μM Kavain可减少成熟破骨细胞的数量(图1A和B)。用MTS法检测Kavain 诱导的细胞毒性，即使在25μM Kavain存在下，细胞活力也没有明显变化(图1C)。用完全培养基培养BMMS 48h，用流式细胞仪(FCM)检测Kavain对细胞凋亡的影响(图8A)，结果表明，20μM或更低浓度的Kavain对细胞凋亡无明显影响(图8B)。发明人还用TRAP 和免疫荧光染色来评价Kavain对破骨细胞融合的影响。结果表明，15μM Kavain减少了每个破骨细胞的平均核数，表明破骨细胞融合存在损伤(图1D和E)。
2.Kavain抑制破骨细胞羟基磷灰石吸收
为研究Kavain对破骨细胞功能的影响，首先在50ng/mL M-CSF和100ng/mL RANKL存在下，将BMMS镀在六孔板上。分化后(第4天)，同样数量的破骨细胞被种在羟基磷灰石基质上进行骨吸收试验，并用不同浓度的Kavain处理。与对照组相比，Kavain治疗组的羟基磷灰石吸收面积要轻得多(图2A和C)，而破骨细胞数在各组间具有可比性(图2B)。
3.Kavain抑制破骨细胞标志基因和蛋白的表达
发明人检测了100ng/ml RANKL诱导的BMMS中破骨细胞特异性基因NFatc 1、TRACP(酸性磷酸酶5；Acp 5)、组织蛋白酶K(CTSK)和Atp6v0d2的表达情况。RT-PCR结果表明RANKL能刺激破骨细胞特异性基因的表达。15μM Kavain可降低RANKL诱导的这些基因的表达(图3A-D)。此外，采用westernblot分析Kavain是否调控NFATc 1及相关下游蛋白的表达。与上述结果一致，Kavain处理第3天和第5天的NFATc 1蛋白表达低于RANKL处理的PBS 对照组(图3 E)。15μM Kavain处理组的NFATc 1相关、破骨前细胞融合相关蛋白(DC-STAMP) 的表达在第3天和第5天与RANKL处理的PBS对照组相比受到抑制。此外，15μM Kavain 也能抑制骨吸收相关蛋白的表达，其中包括V-ATPase-D2、MMP 9、ctsk和整合素β3。15 μM kavain在mbms中作用3天和5天(图3E)。
4.Kavain通过调节细胞内钙水平影响NFATc 1的激活
为了直接评价Kavain对NFATc 1活性的影响，发明人在不同浓度的Kavain存在下，用RANKL构建了稳定转染的RAW 264.7细胞，观察其对NFATc 1活性的影响。结果表明， 15μMKavain显著降低了NFatc 1-荧光素酶活性(图4A)。为了进一步研究Kavain调控 NFATc 1激活的机制，发明人研究了Kavain对钙信号通路的影响。用GST-rRANKL(100ng/mL) 刺激BMMS24h，用Fluo 4钙指示剂测定钙通量。与预期一样，RANKL治疗组的钙振荡强度明显高于对照组(图4B和C)。Kavain治疗可显著降低RANKL介导的钙振荡强度(图4D 和E)。
5.Kavain抑制特定MAPK信号通路
发明人接下来研究了其对MAPK激活的影响，MAPK是RANKL介导的破骨细胞分化和激活的关键信号通路之一。Westernblot分析表明，Kavain能显著降低MAPK下游靶点P38 和JNK 1/2的磷酸化，但不影响ERK 1/2的磷酸化(图5)。
6.Kavain对RANKL诱导的NF-κB活化无影响
发明人还测定了Kavain对RANKL诱导的NF-κB活性的影响。使用荧光素酶报告基因测定，发明人发现在RANKL活化时NF-κB荧光素酶的强度增加。然而，与单独用RANKL 处理的组相比，在Kavain治疗后，未观察到NF-κB荧光素酶强度的明显变化(图9A)。此外，Western印迹分析的结果显示Kavain没有影响RANKL诱导的κB-α的降解(图9B)。因此，这些数据表明Kavain在破骨细胞生成过程中对NF-κB信号传导没有显著影响。
7.Kavain不影响成骨细胞的增殖和分化
接下来，发明人测试Kavain对成骨细胞分化和增殖的影响。在探讨Kavain在成骨细胞分化中的作用之前，用MTS法评价Kavain的毒性。将MC3T3-F1成骨细胞在不同浓度Kavain的96孔板中镀24和48h，结果表明：Kavain对成骨细胞增殖无影响，即使在高浓度(20μM)Kavain(图10A和10B)时也不影响成骨细胞增殖。其次，发明人用碱性磷酸酶(ALP) 染色直接评价Kavain对成骨细胞分化的影响。ALP染色在对照组与Kavain处理组间无显着性差异(图10C)。RT-PCR结果表明，与对照组相比，Kavain处理组成骨细胞标志基因 ALP、Runx 2和I型胶原α1(Col1a1)的表达水平无明显变化(图10E-F)。综上所述，这些结果表明Kavain对成骨细胞的增殖和分化没有影响。
8.Kavain可以减轻卵巢切除引起的骨丢失。
选择OVX小鼠，观察卡文对去卵巢所致骨质疏松症的影响。Kavain(10mg/kg)或PBS在假手术或去卵巢后，每周3次腹腔注射，连续6周。发明人对解剖后的股骨进行了显微 CT分析，结果显示重建区为虚线盒。结果提示Kavain能减轻OVX小鼠骨丢失(图6A)。定量分析发现，Kavain治疗的OVX小鼠骨密度(BMD)和骨小梁体积分数(BV/TV)均高于OVX对照组(图6C)。此外，采用组织学TRAP染色进一步验证了Kavain对破骨细胞形成的抑制作用。结果表明，去卵巢能增加破骨细胞表面/骨表面(10月S/BS)，而Kavain降低了10月 S/BS的增加比(图6B，6D)。总之，Kavain通过调节破骨细胞的形成来减轻卵巢切除引起的骨质疏松。
四、讨论
破骨细胞可以吸收骨和软骨，从而调节骨重塑和矿物平衡。然而，在骨质疏松、类风湿关节炎等骨丢失疾病中，发现破骨或破骨细胞功能显著增加。因此，降低破骨细胞活力是治疗这些溶骨疾病的典型的抗吸收治疗策略。本发明中首次证明Kavain通过抑制钙介导的NFATc 1和MAPK信号通路抑制破骨和骨吸收，同时还发现Kavain治疗可以减轻OVX 小鼠的骨丢失。
众所周知，M-CSF和RANKL是启动破骨细胞分化并刺激其骨吸收功能的主要细胞因子。 NFATc 1是促进破骨细胞分化的主转录因子，是在RANKL/RANK轴激活后诱导的。NFATc1 的表达依赖于肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF 6)以及NF-κB、MAPK和钙信号通路。反过来，NFATc 1调控使破骨细胞附着在骨上并介导其骨吸收功能的靶基因的表达。以往的研究中，Kavain及其衍生物分子被建议调控LPS诱导的信号通路，如NF-κB、激活蛋白 1(AP-1)和ERK。然而，Kavain调控破骨细胞活动的确切机制未被探究。有趣的是，发明人发现Kavain可以抑制NFATc 1和DC-STAMP的表达，这是一种破骨细胞融合前相关蛋白，并通过RNA和蛋白质分析，抑制下游效应ACP 5(也称为TRACP)、CTSK、MMP 9和整合素β 3的表达。这些发现提示了Kavain抑制破骨和骨吸收的机制之一。然而，发明人发现在加入Kavain后NF-κB通路的激活没有改变，或许Kavain对NF-κB通路影响的差异可能是由于细胞类型和培养体系的不同所致。
钙信号是另一种调节破骨细胞发生的关键途径，可被RANKL/RANK和磷脂酶Cγ激活，从而促进NFATc 1的激活，特别是NFATc 1可以在活性钙信号传递过程中被自动放大。在发明人的研究中，卡文抑制细胞内钙振荡。因此，抑制钙信号通路导致NFATc 1失活可能是导致破骨细胞形成和活性下降的原因之一。MAPK通路作用于RANKL信号的下游。MAPK 活性通过主要的特异性丝裂原活化蛋白激酶(MAP2Ks)激活JNK、P38、ERK，参与MAPK磷酸化。例如，MEK 1和MEK 2负责ERK；MKK 3和MKK 6激活P38；MKK 4和MKK 7负责JNKs，而MKK 4也参与P38磷酸化。MAPK通路和下游成分的激活促进破骨发生。在发明人的研究中，发明人证明Kavain降低了JNK和P38的磷酸化，但减少了ERK的磷酸化。相反，Kavain 在小鼠骨髓巨噬细胞中通过ERK 2去磷酸化和髓系分化抑制肿瘤坏死因子-α的表达。肿瘤坏死因子-α反过来通过激活破骨细胞前体的RANKL信号来促进破骨发生。发明人推测，在同一细胞系中，不同的刺激条件下，所涉及的下游通路可能会转移。除此之外，Kavain 可能对特定的MAP2Ks产生不同的影响。这些差异背后的机制值得进一步研究。
骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞也有助于骨重塑。成骨细胞可以表达关键的破骨细胞分化因子RANKL，并通过产生骨保护素来平衡其下游作用。骨丢失也可能是由于成骨细胞和破骨细胞数量的失衡或这两个细胞群体之间的沟通受损所致。以上研究结果表明，kavain可以抑制受体激活核因子-κB配体(RANKL)诱导的破骨细胞分化和融合，但对体外成骨细胞的分化和功能没有影响，提示Kavain对破骨细胞具有细胞类型特异性作用。总之，这些结果提示Kavain通过调节细胞内钙介导的NFATc 1和MAPK失活而抑制破骨细胞的形成和功能，而不影响成骨细胞(图7)。此外，Kavain还可以通过抑制破骨作用来抑制去卵巢引起的骨质疏松症。发明人的数据表明，这种天然化合物在治疗溶骨性疾病方面具有潜在的作用。

Claims (2)

1.醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨质疏松由卵巢切除引起。
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