CN109758466A

CN109758466A - 野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用

Info

Publication number: CN109758466A
Application number: CN201811111966.7A
Authority: CN
Inventors: 廖世杰; 刘云; 宋方茗; 冯文宇; 刘倩; 赵劲民; 徐家科; 丁晓飞; 马石庭; 宋慧洁; 林华豪
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2019-05-17

Abstract

本发明公开了野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用。体外试验表明野漆树苷可显着抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收，同时也抑制破骨细胞相关基因的表达；蛋白印迹实验表明野漆树苷可以抑制NF‑κB、MAPK信号通路和NFATc1、c‑fos两个转录因子；进一步研究表明，野漆树苷可以抑制P65入核和NFATc1、NF‑κB细胞的活性。体内试验表明野漆树苷可以减少钛颗粒诱导颅骨模型的TRAP阳性破骨细胞数量和颅骨的骨质破坏。因此，野漆树苷可以改善破骨细胞引起的骨溶解，可能成为治疗关节假体松动的潜在药物，为假体无菌性松动提供新的治疗选择。

Description

野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用

技术领域

本发明属于骨疾病治疗技术领域，尤其涉及野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用。

背景技术

目前骨关节炎，类风湿关节炎，骨关节结核，化脓性关节炎，强直性脊柱炎等可引起终末期骨关节破坏的疾病逐年增加，严重影响患者的健康和生活质量。尽管全关节置换术是一种非常成功的治疗方法，但近三成的全关节置换患者术后因假体松动等原因需要进行翻修手术，这可能给患者和国家带来更多的经济负担。因此，探讨关节假体松动的具体机制并延长假体寿命对医务工作者来说是一个很大的挑战。

目前认为假体松动最主要的原因是磨损微粒造成的假体周围骨溶解，而既往研究骨溶解与破骨细胞过度活跃及骨吸收功能增强密切相关。来源于假体的磨损微粒可以刺激假体周围聚集巨噬细胞分泌炎症因子包括白介素-1、白介素-1β、白介素-6、白介素-17和肿瘤坏死因子等，而这些炎症因子又可以促进RANKL表达，激活破骨细胞相关信号通路，从而促进破骨细胞的形成，造成局部骨吸收增强。关于破骨细胞的相关机制，主要由于RANKL、 OPG比例失衡，造成破骨细胞增多、过渡吸收造成骨代谢失衡，引起骨溶解。RANKL和OPG 均能与破骨细胞前体细胞膜的RANK受体结合，对破骨细胞的分化起到相反作用。当RANKL 表达增多时，与RANK受体结合增多，激活TRAF6并启动破骨细胞分化的相关信号通路(MAPK\NF-KB\AKT)，促进破骨细胞形成，发挥骨吸收能力。综合以上机制，探索磨损微粒、破骨细胞、假体松动之间关联有较大的研究价值。因此，抑制破骨细胞相关的信号通路，就能抑制破骨细胞的形成，防治假体松动，延长假体寿命。

一些黄酮类化合物如大豆异黄酮是植物雌激素，具有较好的抗氧化、抗肿瘤、抗炎等类雌激素药理特性。野漆树苷是主要来自山香园或化橘红的黄酮化合物，同样具有抗炎、抗氧化和降血压等效应，但未见野漆树苷用于预防和治疗骨科疾病的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用，这为骨溶解性疾病治疗提供了新的方案，也为深入开发天然植物成分开辟了新途径。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用。

骨溶解性疾病为关节假体松动周围骨溶解。

骨溶解性疾病为钛颗粒诱导的骨质破坏。

骨溶解性疾病为钛颗粒诱导的颅骨模型骨质破坏。

目前，野漆树苷在骨溶解性疾病中的作用还没有被报道。发明人在研究中首次观察了野漆树苷对破骨细胞生成和钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的作用机制。体外试验表明野漆树苷可显着抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收，同时也抑制破骨细胞相关基因的表达；蛋白印迹实验表明野漆树苷可以抑制NF-κB、MAPK信号通路和NFATc1、c-fos两个转录因子；进一步研究表明，野漆树苷可以抑制P65入核和NFATc1、NF-κB细胞的活性。体内试验表明野漆树苷可以减少钛颗粒诱导颅骨模型的TRAP阳性破骨细胞数量和颅骨的骨质破坏。因此，野漆树苷可以改善破骨细胞引起的骨溶解，可能成为治疗关节假体松动的潜在药物，为假体无菌性松动提供新的治疗选择。

附图说明

图1是野漆树苷抑制RANKL介导的破骨细胞形成结果图，图中：A野漆树苷的化学结构式；B通过MTS测定测量BMMs的活性；C用不同浓度的野漆树苷诱导的RANKL诱导的破骨细胞分化的TRAP染色；D不同时间段野漆树苷诱导的RANKL诱导的破骨细胞分化的TRAP 染色，通过显微镜定量破骨细胞的数量(细胞核>3)；E破骨细胞骨架F-actin环染色。

图2是野漆树苷抑制破骨细胞引起的骨吸收结果图，图中：A破骨细胞TRAP染色图及其相对应的不同药物浓度刺激下的骨吸收坑面积变化情况，使用Image J软件计算羟基磷灰石再吸收的面积；B以剂量依赖性方式抑制破骨细胞相关基因(Ctsk，Trap，Ctr和Atp6vOd2)的表达。

图3是野漆树苷抑制RANKL刺激NF-κB信号通路结果图，图中：A通过NF-κB应答萤光素酶构建体转染RAW264.7细胞，不同野漆树苷浓度刺激后，使用荧光素酶报道基因监测NF-κB的转录活性；B将BMMS细胞用5μM野漆树苷预刺激1小时，然后用100ng/ mL RANKL刺激0，15，30和60分钟，通过蛋白质印迹分析细胞裂解物中的蛋白质水平，同时使用Image J软件计算和分析IκBα，β-actin，p-NF-κBp65and NFκBp65条带的灰度水平；C将BMMS细胞用5μM野漆树苷和100ng/mL RANKL预刺激后进行p65免疫荧光染色，通过共聚焦镜观察野漆树苷干预后NF-κB细胞核转录情况。

图4是野漆树苷抑制RANKL刺激MAPK信号通路结果图。将BMMS细胞用5μM野漆树苷预刺激1小时，然后用100ng/mL RANKL刺激0，15，30和60分钟。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物中的蛋白质水平。同时使用Image J软件计算和分析ERK，p-ERK，JNK，p-JNK， p38，p-p38条带的灰度水平。

图5是野漆树苷抑制RANKL刺激的NFATc1活性结果图，图中：A通过NFATc1应答萤光素酶构建体转染RAW264.7细胞，不同野漆树苷浓度刺激后，使用荧光素酶报道基因监测NFATc1的转录活性；B将BMMS细胞在0，1，3，5天分别进行药物和RANKL刺激，通过蛋白质印迹分析细胞裂解物中的蛋白质水平，使用Image J软件计算和分析c-Fos和NFATc1 条带的灰度水平。

图6是野漆树苷在体内抑制钛颗粒诱导的骨溶解颅盖骨模型中的破骨细胞活性结果图，图中：分四组：假手术组(PBS)，阳性对照组(PBS+钛颗粒)，低剂量(野漆树苷2.5mg /kg+钛颗粒)和高剂量组(野漆树苷5mg/kg+钛颗粒)；A使用microCT重建的颅盖骨模型的大体观；B骨参数分析：BMD(骨矿物质密度)；C.BV/TV(骨量体积/总组织体积)； D孔隙数量；E孔隙率百分比。

图7是钛颗粒诱导的骨溶解模型的组织病理学检查结果图，图中：A代表性标本的H&E染色；B代表性标本的TRAP染色；C组织形态学分析：破骨细胞数量(TRAP阳性细胞)； D每个骨表面破骨细胞的百分比(OCs/BS，％)。

具体实施方式

一、材料和方法

1.1物料

培养基：购自美国Gibco-BRL的DMEM液、a-MEM液、胎牛血清(FBS)。

试剂：野漆树苷(C27H30O14，分子量578.52)(成都)。抗体：IkBa，ERK，p-ERK， JNK，p-JNK，p38，p-p38，NFATc1，c-Fos)、二抗、b-actin(美国)。M-CSF、RANKL(美国)。羟基磷灰石涂层培养版(北京)，荧光素酶裂解液缓冲液、DTT液(美国)，钛颗粒(美国)等材料。

1.2破骨细胞分化试验

从8周龄C57BL/6J小鼠收获骨髓巨噬细胞(BMMs)，使用小针头从股骨和胫骨冲出骨髓。然后将所有细胞在完全α-MEM培养基培养过夜。然后将BMMs以8x10³/孔的密度接种在96孔板中，在α-MEM中培养24小时以粘附。对于破骨细胞分化和药物测定，将细胞与100ng/mL重组RANKL和50ng/mL M-CSF在37℃，5％CO2下培养5-7天，同时每两天更换一次培养基。野漆树苷在第2天以不同浓度(0，2.5，5，10，20μM)进行培养，观察药物对破骨细胞分化的影响。在破骨细胞形成后进行TRAP染色，并将TRAP阳性细胞计数为含有超过3个细胞核的破骨细胞。

1.3细胞毒性分析

将破骨前体细胞以8×10³细胞/孔接种到96孔板中24小时以粘附。然后，将不同浓度野漆树苷(0，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320μM)加入平板两天。最后，将MTS溶液加入到培养基中并在37℃与细胞一起温育2小时。用ELISA平板读数器(BMG，德国) 读取490nm波长处的吸光度，分析野漆树苷对破骨细胞的影响。

1.4骨吸收坑测定法

为了测量野漆树苷对破骨细胞骨吸收功能的影响，将BMMs与100ng/mL RANKL和50ng /mL M-CSF的α-MEM在6孔平板上培养直至成熟的破骨细胞形成。随后将细胞从塑料上分离并重新接种到具有相同破骨细胞数目的羟基磷灰石涂覆的96孔板中的各个孔中。加入不同浓度的野漆树苷(0，2.5，5，10μmol/L)观察羟基磷灰石吸收情况(1-2天)。用 10％漂洗液漂洗，光学显微镜观察羟基憐灰石的吸收面积，拍照并用ImageJ软件进行分析。1.5RNA提取和定量实时PCR

将BMMs细胞以每孔1x10⁵的密度接种在6孔板中直至形成破骨细胞，每孔中加入1mL Trizol试剂直接进行细胞裂解，先后加入氯仿，异丙醇和75％的酒精沉淀、洗涤RNA。使用2μg总RNA与oligodT引物合成cDNA。

PCR反应按以下循环进行：首先在94℃变性5min，然后在以下扩增条件进行30个循环：94℃(40s)，58℃的(40秒)和72℃(40秒)。使用SYBR Premix Ex Tag试剂盒(TaKaRa，日本)和实时荧光定量PCR系统(Roche，瑞士巴塞尔)进行QPCR，直接读取数据。

1.6萤光素酶报告基因测定

使用荧光素酶报道基因监测NFATc1和NF-κB的转录活性。用NFATc1应答萤光素酶构建体或NF-κB应答萤光素酶构建体转染RAW264.7细胞。分别以5×10⁴细胞/孔或1.5 ×10⁴细胞/孔的密度在48孔板中(DMEM)中培养24小时。NF-κB细胞：野漆树苷(0μmol/L (阴性对照组)，0μmol/L(阳性对照组)，2.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L) 预处理1小时，用100ng/mL RANKL刺激约6小时；NFATc1细胞：野漆树苷(0μmol/L (阴性对照组)，0μmol/L(阳性对照组)，2.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L) 预处理1小时，后用100ng/mL RANKL刺激24小时。通过Promega荧光素酶测定系统测量细胞荧光素酶活性。

1.7 Western Blot试验

将BMMs(1x 10⁵个/孔)种植至6孔培养板内37℃温箱培养至细胞长满。短效蛋白：对照组加入100ng/ml RANKL刺激，实验组预先1小时加入野漆树苷10μmol/L刺激，然后不同时间点(0，15，30，60min)加入100ng/ml RANKL刺激；长效蛋白：分别于0，1，3，5 天分别进行药物和RANKL刺激。在放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液中提取来自细胞的蛋白质并与上样缓冲液混合。然后在10％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白进行电泳并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用含有5％BSA的TBS-Tween封闭1小时，然后在4℃与特定的一级抗体混合12小时。用0.1％TBST洗涤膜4次，随后用第二抗体孵育2小时。然后用增强化学发光(ECL)系统检测印迹的蛋白质斑点，在Image-quant LAS 4000上可视化并通过ImageJ软件分析。

1.8破骨细胞骨架F-actin环染色

提取小鼠骨髓单核巨噬细胞以15×10⁴细胞/孔接种到6孔板中完全培养基培养24小时以粘附。不同浓度野漆树苷(0，2.5，5，10μmol/L)加入干预培养。阳性组破骨细胞形成后，用4％多聚甲醛固定20分钟，PBS冲洗3次，Triton X-100(0.1％)处理5min， BSA封闭30min。加入Rhodamine-conjugated phalloidin液避光孵育1-2h，DAPI染色 5min。PBS再次冲洗3次，共聚焦荧光显微镜观察。

1.9 p65免疫荧光染色

提取小鼠骨髓单核巨噬细胞以15×10⁴细胞/孔接种到6孔板中完全培养基培养24小时以粘附。细胞饥饿3h后，5μmol/L野漆树苷干预1h，然后阳性组和药物组RANKL(100ng/mL)刺激半小时。4％多聚甲醛固定10分钟，PBS冲洗3次，Triton X-100(0.1％)处理5min，BSA封闭30min。再次PBS洗涤三次后p65抗体孵育1-2h。DAPI染色5min。 PBS再次冲洗3次，共聚焦荧光显微镜观察。

1.10钛颗粒诱导的小鼠颅盖骨骨溶解模型

从广西医科大学实验动物中心获得24只周龄雄性C57/BL6小鼠，分为4组：假手术组(PBS)，阳性对照组(PBS+钛颗粒)，低剂量(野漆树苷2.5mg/kg+钛颗粒)和高剂量组(野漆树苷5mg/kg+钛颗粒)。除了假手术组仅接受PBS注射之外，在颅盖的中心制作1cm长的切口，其中嵌入100μl钛颗粒悬浮液(250mg/ml)。第二天，药物组分别给小鼠注射用药(野漆树苷2.5mg/kg/d和5mg/kg/d)。术后14天，处死所有小鼠，收集颅骨并固定在4％多聚甲醛用于组织学分析和显微CT。上述所有动物实验均经广西医科大学动物伦理委员会(SCXK-(JUN)2012-0004，北京，中国)批准。

1.11 microCT扫描

通过Sky-Scan1176扫描仪和相关分析软件分析所有模型小鼠模型颅盖骨，获取颅盖骨三维重建图像及相关数据。在扫描之前，需要去除颅盖磨损颗粒以避免金属伪影，扫描方案以9mm的等距分辨率，80kV的X线能量，500μA的电流和以等角步长180°旋转。并且从颅骨冠状和矢状线的交叉点选取3mm×3mm的感兴趣区(ROI)作进一步分析。

1.12组织学和组织形态学分析

标本至少用4％多聚甲醛固定约3天，并用10％EDTA溶液脱钙约2周，然后包埋在石蜡中。颅盖骨感兴趣区域的冠状面截面准备用于H&E染色和TRAP染色活性检测。然后以 40倍和100倍放大率(Nikon Eclipse TE2000-S显微镜)检查ROI和四个相邻切片。

1.13统计分析

所有实验数据的统计分析均通过Student’s t检验和ANOVA检验进行，结果以均数± 标准差表示，实验应独立进行三次。有意义的数据被认为是*p＜0.05和**p＜0.01。

二、结果

如图1至图7所示，实验结果图对应实验均进行三次，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.1野漆树苷抑制RANKL诱导的破骨细胞形成

通过细胞毒性试验观察不同浓度野漆树苷对BMMs的影响，结果表明：320umol/L野漆树苷以内药物浓度对BMMs无细胞毒性作用(图1B)。在安全范围内，不同浓度的野漆树苷加入到BMMs中以观察其对RANKL诱导破骨细胞形成的影响。发现5μMol/L野漆树苷可以明显减少破骨细胞的数量和大小，且这种作用是浓度剂量依赖性的(图1C)。同时通过不同时间段观察发现野漆树苷主要是在早期阶段(1-3天)抑制破骨细胞的形成(图1D)。另外，通过破骨细胞骨架F-actin染色发现不同浓度的野漆树苷可以明显减少破骨细胞的 F-actin环的数量和F-actin环内的细胞核数量(图1E)。因此，结果证明野漆树苷可以抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。

2.2野漆树苷能抑制成熟破骨细胞骨吸收功能和并且抑制破骨细胞标志基因的表达

通过观察野漆树苷对羟基磷灰石涂层板成熟破骨细胞的作用分析，从图2A可以看出， 2.5μmol/l和5.0μmol/l药物干预后时羟基磷灰石吸收面积分别减少到27％和3.8％，而在10μmol/l野漆树苷药物组中只能少量观察到羟基磷灰石再吸收。另外，PCR试验表明：不同药物浓度野漆树苷可以下调破骨细胞再吸收相关基因(CTSK，Calcr，Acp5， Atp6vOd2(图2B)，进一步证明了野漆树苷可以抑制破骨细胞的骨吸收功能。

2.3野漆树苷可以抑制RANKL诱导的相关信号通路

鉴于多种信号通路及相关转录因子在破骨细胞分化中的重要作用，发明人从多方面研究野漆树苷在破骨细胞中的机制。从荧光素梅报告检测中发现野漆树苷可以明显抑制NF- κB细胞的活性(图3A)。通过蛋白质印迹试验观察野漆树苷在NF-κB信号通路中蛋白质磷酸化水平的变化，发现野漆树苷可以抑制IκB-α的降解，对照组中RANKL刺激15分钟，30分钟后IκB-α明显降解，然而，在5umol/l野漆树苷干预后15分钟和30分钟IκB-α 的降解明显被抑制。而NF-κBp65的磷酸化在15min、30min和60min明显抑制(图3B)。同时，为了进一步验证野漆树苷对p65入核的影响，进行了p65入核荧光显微镜染色，发现5umol/l野漆树苷干预后可以明显抑制p65入核(图3C)。然后，发明人研究了MAPK途径发现：用5umol/l野漆树苷干预后，虽然p38的磷酸在各个时间点药物抑制都不明显，但ERK的磷酸化在15分钟时药物抑制最明显，JNK磷酸化在15分钟和30分钟时药物明显被抑制。数据表明，野漆树苷可以通过NF-κB和MAPK途径抑制破骨细胞的活化(图4)。同时，NFATc1和c-Fos是调节破骨细胞相关基因表达的重要转录因子。荧光素梅报告检测中发现野漆树苷可以明显抑制NFATc1细胞的活性(图5A)，同时蛋白质印迹试验发现 RANKL刺激后NFATc1和c-Fos蛋白水平在第三天和第五天明显增高，药物干预后两者水平也相应被抑制(图5B)。

2.4野漆树苷能减少钛颗粒诱导的骨质破坏

为了进一步观察野漆树苷对骨溶解的影响，发明人做了一个钛颗粒诱导的小鼠颅盖骨骨溶解模型。从图6A Micro-CT三维重建结果中发现：相比假手术组，阳性对照组在颅盖上的出现大面积骨质破坏。在低剂量和高剂量野漆树苷干预后，特别是高剂量组，钛诱导的骨质破坏得到较大程度上缓解。通过具体骨参数分析，与阳性对照组相比，药物组BMD(骨矿物质密度)和BV/TV(骨量体积/总组织体积)明显增加，而孔隙数量和孔隙率百分比显著下降(图6B-E)。这些结果表明，野漆树苷可明显抑制钛颗粒所诱导的骨溶解。此外，TRAP染色结果显示，野漆树苷治疗组TRAP阳性破骨细胞数目较对照组明显下降。综上结果表明：野漆树苷可以明显抑制体内钛颗粒引起的小鼠颅盖骨骨溶解。

三、讨论

本发明通过体外细胞试验和体内动物实验对野漆树苷进行一些列研究表明：野漆树苷能抑制破骨的分化、减弱骨吸收功能，有望成为治疗假体松动的新药物。

骨的代谢依赖于破骨细胞与成骨细胞之间动态平衡作用，骨溶解的发生在于破骨细胞过渡活跃，骨吸收功能增强，成骨作用减弱，进而骨的破坏溶解增强，已有大量研究表明抑制破骨细胞分化形成，就能抑制骨的破坏溶解。本文试验表明5um/1野漆树苷能明显减少破骨细胞数量、形态，并能够抑制骨板羟基磷灰石吸收，较对照组下降低至1.5％，同时能够抑制破骨细胞吸收相关基因如Acp5、Atp6vOd2、Ctsk、Calcr。说明野漆树苷不仅能够影响破骨细胞的形成分化，还能影响破骨细胞的吸收功能。综合其对破骨细胞的作用，野漆树苷能够抑制破骨细胞的分化和吸收功能，具有潜在治疗骨溶解的作用。

破骨细胞的形成分化及吸收功能取决于RANKL的作用，RANKL与破骨细胞前体细胞膜的RANK受体结合，激活TRAF-6上游效应器，通过NF-kB途径，MAPK途径(包括JNK\P38\ERK途径)，启动基因转录来调节破骨细胞的分化成熟和骨吸收作用。NF-kB作为破骨细胞分化重要的信号通路，包括p-65和Ik-Ba，Ik-Ba是激活NF-κB信号通路的抑制剂蛋白。荧光素梅报告试验证明野漆树苷可以抑制NF-κB细胞的活性，同时蛋白印迹试验表明野漆树苷可以抑制p65磷酸化和Ik-Ba的降解，从而抑制NF-κB信号通路作用。同时，MAPK 信号通路中ERK，p38，and JNK可以通过抑制破骨细胞的分化、生存、凋亡在破骨细胞活动中发挥作用。实验结果表明野漆树苷可以抑制JNK和ERK的磷酸化水平来影响MAPK信号通路。另外，c-Fos和NFATc1是调控破骨细胞分化的重要转录因子，而实验证明野漆树苷还能够抑制c-Fos和NFATc1蛋白表达水平，从而起到调控破骨细胞分化成熟的作用。

体内试验颅盖骨病理TRAP染色表明：野漆树苷治疗组的破骨细胞数量明显较阳性对照组减少，同时CT3D重建提示野漆树苷治疗组较对照组明显抑制钛颗粒诱导颅盖骨骨质破坏。说明野漆树苷可以通过抑制破骨细胞的形成来抑制钛颗粒诱导的骨质破坏，可以作为潜在治疗假体周围骨溶解的一种选择。

综上所述，野漆树苷可以通过NF-κB和MAPK信号通路抑制破骨细胞的形成和功能，同时可以减少钛颗粒引起的骨质破坏。因此野漆树苷有可能作为治疗假体周围骨溶解的潜在药物。

Claims

1.野漆树苷在制备预防治疗骨溶解性疾病的药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨溶解性疾病为关节假体松动周围骨溶解。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨溶解性疾病为钛颗粒诱导的骨质破坏。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述骨溶解性疾病为钛颗粒诱导的颅骨模型骨质破坏。