CN101874895B

CN101874895B - Cart作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用

Info

Publication number: CN101874895B
Application number: CN 200910025053
Authority: CN
Inventors: 徐运; 李玲玲; 章玲
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2009-02-17
Filing date: 2009-02-17
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2029-02-17
Also published as: CN101874895A

Abstract

本发明涉及CART作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用。本发明是将CART制备成治疗阿尔茨海默病的注射制剂。本发明解决了现在使用的增强胆碱能作用的药物和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂各自存在的缺陷。本发明对Aβ的生成、降解及其神经毒性的影响及其分子机制，具有多靶点作用的治疗AD的新型药物。作用表现在雌激素治疗痴呆有效，可上调脑内的CART；CART在脑内海马分布较多；CART存在脑内乙酰胆碱能神经元中，促进乙酰胆碱释放；Aβ神经毒性诱导的线粒体功能障碍为其引起神经元凋亡的主要通路。而CART可与线粒体琥珀酸脱氢酶亚基B直接作用，维持线粒体的呼吸和能量产生、减轻氧化应激、稳定线粒体膜电位、防止线粒体受损，从而抑制细胞凋亡。

Description

CART作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用

技术领域

本发明涉及一种药物的应用，特别涉及小分子神经肽可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine-regulated transcript，简称CART)作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简称AD)是一种最常见的神经系统退行性疾病，是老年痴呆最常见的原因，表现为进行性智能衰退。65岁以上的人群患病率已达5～10％，85岁以上人群患病率达20％-40％。其主要病理机制为Aβ在大脑神经细胞内、外沉积，导致神经细胞死亡。Aβ来源于其前体蛋白(amyloidprecursor protein，APP)，脑中的APP经β分泌酶(β-site APP-cleavingenzymel，BACE1)酶切产生sAPPβ和C99，再经γ分泌酶切割产生Aβ40或Aβ42。其中Aβ42及其寡聚物是引起神经毒性作用的最主要组分。Aβ42神经毒性可引起线粒体功能障碍、氧化应激、突触传递功能障碍等，最终引起乙酰胆碱神经元坏死，导致痴呆，目前认为线粒体功能障碍可能为AD患者脑内细胞凋亡的最主要途径。

目前，临床应用治疗AD的药物主要有两类：1)增强胆碱能作用的药物：AD患者脑中胆碱能神经元变性、坏死，引起乙酰胆碱(Ach)水平降低。目前应用最广泛的是乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamin)和石杉碱甲等。此类药物必须在病情早期，脑内有部分正常的胆碱能神经元分泌Ach。可暂时缓解症状，不能影响病理过程；2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂：美金刚(memantine)。NMDA受体激活后引起的兴奋性毒性是AD脑损伤的重要发病机制之一；美金刚是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，可通过抑制NMDA受体介导的兴奋性毒性阻止部分AD的病理发展。但NMDA受体激活后引起的兴奋性毒性参与多种中枢神经系统疾病脑损伤的病理过程，美金刚的特异性有待临床进一步验证。因此阻止AD病理发展成为将来治疗AD的方向，现在AD的防治策略：1)调节Aβ的代谢过程，减少Aβ的生成和促进Aβ的降解；2)抑制Aβ的神经毒性作用。

CART是一种新的内源性神经肽，它具有广泛的生理作用，在奖赏与强化、进食与肥胖、精神焦虑行为、体液平衡、免疫功能、新陈代谢、内分泌以及其他的一些生理过程中均有作用。广泛分布于脑、垂体、肾上腺、胰岛和胃肠道等组织。

研究报道可研制为治疗肥胖、药物成瘾、焦虑和抑郁症等疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种CART作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用。

本发明的技术方案是：

CART作为制备治疗阿尔茨海默病药物的应用，其主要技术特征在于将CART制备成治疗阿尔茨海默病的注射制剂。

本发明的优点和效果在于治疗阿尔茨海默病时，由于CART：

1、是一种内源性小分子神经肽，静脉用药，可透过血脑屏障；

2、多靶点作用于AD的病理过程，符合当今研制治疗AD药物的决策；首先阻断Aβ在脑内的过度形成和沉积：通过抑制BACE1减少Aβ形成；增强NEP、LRP表达，从而加快脑内Aβ的降解和向脑外的转运；其次直接抑制Aβ神经毒性作用，减少神经细胞凋亡和脑损伤。

本发明从整体到细胞、分子水平，系统探讨CART对Aβ的生成、降解及其神经毒性的影响及其分子机制。以发现具有多靶点作用的治疗AD的具有潜力的新型药物。我们前期对CART在缺血性脑损伤中的保护作用及分子机制进行的系列研究，表明CART是一种内源性的神经保护剂。作用有：1)雌激素治疗痴呆有效，而雌激素可上调脑内的CART；2)CART在脑内海马分布较多，而海马在痴呆发病中具有明显的解剖学联系；3)CART存在脑内乙酰胆碱能神经元中，促进乙酰胆碱释放，而AD患者脑内的乙酰胆碱神经元坏死，乙酰胆碱减少；4)Aβ神经毒性诱导的线粒体功能障碍为其引起神经元凋亡的主要通路。而CART可与线粒体琥珀酸脱氢酶亚基B直接作用，维持线粒体的呼吸和能量产生、减轻氧化应激、稳定线粒体膜电位、防止线粒体受损，从而抑制细胞凋亡。

以上研究结果提示CART作用于AD病理过程中多个靶点而具有治疗作用。进一步研究发现CART不仅抑制脑内Aβ的形成而且又能抑制其神经毒性，这种双重作用，恰好符合当今AD的防治策略。

本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。

附图说明

图1--小鼠morris水迷宫试验结果图：

A--APP小鼠与WT小鼠水迷宫平均逃避潜伏期图

B--CART处理后小鼠水迷宫平均逃避潜伏期图。

图2--免疫荧光方法检测小鼠脑内Aβ结果图。

A--WT组脑内Aβ结果图

B--APP组脑内Aβ结果图

C--CART+APP组Aβ结果图

图3--Western blot检测Aβ表达图。

图4--western blot检测Aβ表达灰度值图：

A--为皮质的灰度值

B--为海马的灰度值。

图5--神经元生存能力测定(MTT)图：

A--不同浓度Aβ损伤神经元曲线图

B--不同浓度CART处理神经元存活率图

C--不同时间Aβ损伤神经元曲线图。

图6--流式细胞仪检测神经元死亡率图。

图7--CART对Aβ代谢酶mRNA水平的影响图。

图8--CART对Aβ代谢酶蛋白表达的影响图。

图9--CART对Aβ诱导的神经元线粒体膜电位水平的影响图。

图10--CART对Aβ诱导神经元的ROS影响图。

图11--CART对Aβ诱导神经元的ROS流式结果。

具体实施方式

对CART在缺血性脑损伤中的保护作用及分子机制进行了系列的研究，研究结果提示CART是一种内源性的神经保护剂。本发明首先，从整体角度，通过行为学、病理学、等方法验证CART能改善认知功能，降低Aβ神经毒性所致的神经损伤，从而证明CART对AD具有治疗作用；其次，从离体水平，用分子生物学等技术研究CART抑制Aβ对神经元的神经毒性作用；最后，从整体到从离体水平，用分子生物学等技术研究CART对AD病理过程中不同靶点的影响，以证明CART可制备为一多靶点治疗AD的新型药物的应用。

实验发现，CART可作用于AD病理过程中的多个靶点。首先作用脑内的BACE1，可能通过抑制其表达和活性减少Aβ生成；其次可能提高脑内NEP和LRP的功能，增加Aβ的降解和向脑外转运；最后，对已沉积的Aβ引起的神经毒性也具有直接抑制作用。

具体如下。

实施例1：

采用CART55-102，分子量为5243.21，白色粉状，规格是100ug/瓶，干燥保存于0-5℃；与生理盐水混合，按照1ug∶4000ul，制成治疗阿尔茨海默病的注射液制剂；体内CART静脉注射2.5ug/Kg/次。该剂量范围内CART未见毒、副作用。

实施例2：

采用CART62-102，分子量为4385.3，与生理盐水混合，按照1ug∶4000ul，制成注射液制剂。余同实施例1。

实施例3：

采用CART1-89，与生理盐水混合，按照1ug∶4000ul，制成注射液制剂。余同实施例1。

实施例4：

采用CART1-102，与生理盐水混合，按照1ug∶4000ul制成注射液制剂。余同实施例1。

实验1：

体内研究证明CART对Aβ沉积所致的AD具有治疗作用：

以B6C3-Tg双转基因小鼠(APP/PS1小鼠-简称APP小鼠)为AD动物模型，待小鼠出现AD症状后(8-10月)予CART(CART55-102，Phoenix Pharmaceutical，USA)静脉注射治疗。通过行为学、病理学证明，CART对AD具有治疗作用。

1)材料和方法

以APP小鼠为Aβ沉积所引起的AD动物模型，待小鼠出现行为学改变后(8-10月)予CART 2.5ug/kg静脉注射，隔日1次治疗，分别治疗10、30天，生理盐水为治疗对照组，每组12只小鼠，雌雄各半。野生小鼠为正常对照组。

行为学检测：水迷宫试验为用于检测动物学习记忆能力的公认方法，Morris水迷宫：圆形水池直径为120cm，高60cm，平台高度50cm，直径10cm，平台低于水面1cm，水温25±1℃，水的表面覆盖白色塑料泡沫颗粒。实验期间迷宫外参照物保持不变。实验前1天，让小鼠熟悉水迷宫环境。实验历时5天，每天训练1次，分别从东、南、西、北4个点入水，入水时，小鼠面向池壁，记录小鼠找到平台所需时间即逃避潜伏期。潜伏期越长，认知功能越差。

免疫荧光染色：脑组织冰冻切片，使用Aβ₄₂特异性抗体，通过以免疫荧光法检测小鼠脑内Aβ的沉积情况。冰冻切片4％甲醛/PBS，室温固定10min，PBS洗涤两次，每次5min，加入Triton-100，室温下放置5min，用PBS洗涤5min，2％正常山羊血清封闭30min；加入兔源多克隆抗Aβ42(Chemicon)抗体(1∶500)，4℃冰箱过夜。PBS洗涤5minX3次，IgG(1∶100)30min，37℃；免疫荧光标记的二抗FITC-conjuga ted抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmuneoResearch)室温30-60min。荧光显微镜摄像。

免疫印迹(Western blot)定量测定脑内海马和皮层Aβ的含量：脑皮层和海马提取蛋白质，并定量蛋白浓度，然后溶解在4X蛋白上样缓冲液(loadingBuffer)中，煮沸5分钟。在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将此蛋白转到PVDF膜上。浸在5％牛奶/TBST室温1小时，从而去除非特异性结合。分别加第一抗体(多克隆兔源抗Aβ42(Chemicon)抗体(1∶500)4℃过夜，辣根过氧化酶标记二抗(1∶5000)结合1小时，用增强的化学发光法测定其蛋白表达。

2)结果

(1)行为学结果：Mori s水迷宫试验结果提示，APP小鼠10个月后，与野生鼠相比，APP小鼠逃避潜伏期明显延长(见图1A)。CART治疗30天后，APP小鼠逃避潜伏期对照组(生理盐水组)明显缩短(见图1B)。每组10只小鼠。

(2)免疫荧光方法检测小鼠脑内Aβ结果提示，APP小鼠出现AD症状后其海马区内可见典型的AD病理变化即Aβ沉积增多(见图2B)，而予CART治疗后，其海马等脑区内Aβ沉积较未治疗组减少(见图2C)，提示CART可降低脑内Aβ的沉积(见图2)，野生型小鼠为正常对照组(WT)。

(3)免疫印迹结果(Western blot)与免疫荧光结果一致，Western blot检测Aβ表达(见图3)：图3为APP小、鼠组皮层及海马中的Aβ表达(1.09±0.10)比WT(0.57±0.09)组明显增高，CART处理组(0.66±0.04)低于痴呆组。所有实验均独立重复三次。图3-A为Western blot条带，图3-B为直方图，图4分别为皮质、海马的灰度值(均数±标准差，*p＜0.05)。

实验2：

体外研究证明CART抑制Aβ的神经毒性对AD具有治疗作用：

1)材料和方法

原代皮层神经元培养：怀孕15-17d野生型昆明小鼠，断颈处死后，取其胚胎，置于盛有冷HBSS的培养皿中，分离大脑皮层，1X胰酶消化后，置多聚赖氨酸处理后的24孔培养板中培养，2～3×10⁶细胞/ml，每2-3d部分换液，共培养10-14d。细胞培养在无血清、无酚红和无雌激素的培养液(Neurobasal加上Hepes、B27和谷氨酰胺)中，37℃，5％CO₂培养箱。

神经元细胞活力检测：使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测神经元的细胞活力。向100μl培养液/孔中加入MTT，37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养6h，然后倾去全部培养液，每孔中加入100μl DMSO溶液，摇床上摇动至蓝紫色的结晶完全溶解，酶标计数仪测定各组OD值。

药物处理：Aβ处理神经元(0.5，1，2，4uM)24h后，加CART(0.2，0.4，0.8，1.6nM)再维持24h。最终选择Aβ剂量为2uM，CART0.4nM。

神经元凋亡率检测：Annexin-V/PI双染法使用流式细胞仪检测神经元凋亡率。收集神经元离心(2000rpm离心5min)；PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1-5×10⁵细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；流式细胞仪检测。

2)结果

①MTT提示Aβ明显降低神经元的生存率，CART抑制Aβ的神经毒性：我们用Aβ的不同剂量(图5A)和不同时间(图5B)处理神经元，MTT检测神经元的生存率，结果提示1)2uM处理神经元48h，为本研究体外造模的最佳剂量，Aβ减少神经元的生存率，呈剂量和时间依赖性。2)体外不同浓度CART抑制Aβ的神经毒性(图5C)结果提示最佳剂量为0.4nM。

②流式细胞仪检测神经元死亡率：Aβ明显诱导神经元死亡，CART抑制其神经毒性，降低Aβ引起神经元死亡率。(见图6，*p＜0.05)进一步证明CART抑制Aβ毒性和神经保护作用。

实验3：

CART通过多靶点影响AD的主要病理过程治疗AD：

我们的研究发现CART不仅影响Aβ的生成、转运和降解，而且抑制Aβ引起的氧化应激作用。

1)材料和方法

实时荧光定量PCR：本发明中Aβ代谢酶的mRNA水平通过实时荧光定量PCR检测。引物为：BACE1：F：5-TTGCCCAAGAAAGTATTTGA-3，R：5-TGATGCGGAAGGACTGATT-3.LRP：F：5-GGACTTCAGTTATGCCAATG-3，R：5-GGCTGAGGGAGATGTTGA-3.NEP：F：5-GACCTACCGGCCAGAGTA-3，R：5-AAACCCGACATTTCCTTT-3.根据分子生物学技术常规，提取脑组织中总RNA，反转录为cDNA，再作实时荧光定量PCR。反应条件：95℃，5分钟40个循环。95℃，30秒，60℃，1分钟。

Western Blot：方法同上，分别加第一抗体(Aβ1-42，1∶500，AB5078P，Chemicon；BACE1，1∶500，MAB5308，Chemicon；NEP，1∶500，BAF1126，R&D；GAPDH为内参)，4℃过夜，辣根过氧化酶标记二抗(1∶5000)结合1小时，用增强的化学发光法测定其蛋白表达。

线粒体膜电位及ROS检测：均使用荧光探针检测法检测。神经元线粒体膜电位水平使用JC-1荧光探针，ROS检测使用DCFH-DA荧光探针，结合流式细胞仪检测各相应荧光强度。收集不多于1×10⁶的细胞；用PBS洗涤细胞二次，取JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5％CO₂的培养箱中孵育15～20min；室温离心，用1×Incubation Buffer洗两次；悬浮细胞；流式细胞仪分析。

2)结果

①CART对APP小鼠脑内Aβ代谢酶mRNA水平的影响：

实时定量PCR检测显示，APP小鼠脑内皮层(C)和海马(H)脑区内BACE1的mRNA水平较对野生组明显增高，而NEP和LRP的mRNA水平明显降低，给予CART治疗可抑制BACE1mRNA水平的增高，并能提高NEP和LRP的mRNA水平(见图7)。提示CART可通过调节Aβ的代谢酶降低脑内Aβ的水平。

②CART可抑制APP小鼠脑内BACE1提高NEP的蛋白表达：

Western Blot检测显示，APP小鼠脑皮层和海马(H)BACE1蛋白水平较对照组明显增高，NEP明显低于对照组。CART可抑制BACE1、提高NEP的蛋白表达(见图8)。提示CART可通过抑制BACE1、提高NEP的表达来降低脑内Aβ的水平。

③CART可抑制Aβ诱导的神经元线粒体膜电位下降：

正常神经元线粒体保持一定的膜电位水平(ΔΨm)，呈极化状态，JC-1荧光探针染色可检测ΔΨm(见图9)，正常(WT)时显示为橙色荧光(见图9A)，而A β作用30min后绝大数细胞线粒体膜电位水平下降，呈去极化状态，显示为绿色荧光(见图9B)；CART处理可抑制Aβ诱导的神经元ΔΨm水平下降(见图9C)。

④流式细胞仪测定提示CART可抑制Aβ诱导的ROS升高(图10)：

Aβ处理神经元后，诱导神经元氧化应激，释放大量活性氧(ROS)，CART通过抑制氧化应激，减少ROS释放，保护神经元损伤(流式结果见图11)。

Claims

1.CART55-102在制备治疗阿尔茨海默病药物方面的应用，其特征在于将CART55-102制备成治疗阿尔茨海默病的注射制剂。

2.根据权利要求1所述的CART55-102在制备治疗阿尔茨海默病药物方面的应用，其特征在于CART55-102分子量为5243.21Da。

3.根据权利要求1或2所述的CART55-102在制备治疗阿尔茨海默病药物方面的应用，其特征在于CART55-102注射制剂为每次静脉注射2.5μg/Kg。