CN103415519A - 作为β-分泌酶（BACE）抑制剂有用的6,7-二氢-吡唑[1,5-a]吡嗪-4-基胺衍生物 - Google Patents

作为β-分泌酶（BACE）抑制剂有用的6,7-二氢-吡唑[1,5-a]吡嗪-4-基胺衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及作为β-分泌酶抑制剂的新颖的6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基-胺衍生物，β-分泌酶也称作β-位点淀粉样蛋白切割酶、BACE、BACE1、Asp2、或膜天冬氨酸蛋白酶2。本发明还针对包括此类化合物的药物组合物，针对制备此类化合物和组合物的方法，并且针对此类化合物和组合物用于预防及治疗其中涉及β-分泌酶的紊乱的用途，这些紊乱如阿耳茨海默病(AD)、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆或与β-淀粉样蛋白相关的痴呆。

Description

作为β-分泌酶(BACE)抑制剂有用的6,7-二氢-吡唑[1,5-a]吡嗪-4-基胺衍生物
发明领域
本发明涉及作为β-分泌酶抑制剂的新颖的6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基-胺衍生物，β-分泌酶也称作β-位点淀粉样蛋白切割酶、BACE、BACE1、Asp2、或膜天冬氨酸蛋白酶2。本发明还针对包括此类化合物的药物组合物，针对用于制备此类化合物和组合物的方法，并且针对此类化合物和组合物用于预防及治疗其中涉及β-分泌酶的紊乱的用途，这些紊乱例如阿耳茨海默病(AD)、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆或与β-淀粉样蛋白相关的痴呆。
发明背景
阿耳茨海默病(AD)是一种与衰老相关的神经退行性疾病。AD患者遭受认知缺陷和记忆丧失连同行为障碍，例如焦虑。超过90％的受AD折磨的那些病例具有散发形式的紊乱，而只有10％的病例是家族性或遗传的。在美国，在65岁年龄段约十分之一的人患有AD，而在85岁年龄段，每两人就有1个患有AD。距初次诊断的平均预期寿命是7-10年，并且AD患者需要来自非常昂贵的辅助生活机构或来自家庭成员的大量护理。随着群体中老年人数量的不断增加，AD引起不断增长的医疗关注。当前可用于AD的疗法只治疗该疾病的症状，并且包括用于改善认知特性的乙酰胆碱酯酶抑制剂连同用于控制与这种疾病相关的行为障碍的抗焦虑药和抗精神病药。
AD患者脑部标志性病理特征是由tau蛋白的高度磷酸化产生的神经原纤维缠结以及由β-淀粉样蛋白1-42(Abeta1-42)肽聚集形成的淀粉样蛋白斑。Abeta1-42形成低聚物并且然后是微丝，并且最终是淀粉样蛋白斑。这些低聚物以及微丝被认为是尤其毒害神经的并且可以导致与AD相关的大多数神经学损伤。预防Abeta1-42形成的试剂具有成为用于AD治疗的疾病-改性剂的潜能。Abeta1-42产生自淀粉样前蛋白(APP)，由770个氨基酸组成。Abeta1-42的N-端被β-分泌酶(BACE)切割，并且然后γ-分泌酶切割C-末端。除了Abeta1-42之外，γ-分泌酶还释放为主要切割产物的Abeta1-40连同Abeta1-38和Abeta1-43。这些Abeta形式也可以聚集以形成低聚物和微丝。因此，预期BACE抑制剂将预防Abeta1-42连同Abeta1-40、Abeta1-38和Abeta1-43的形成，并且将是AD治疗的潜在治疗剂。
发明概述
本发明针对具有化学式(I)的化合物
Figure BDA0000374925510000021
或其互变异构体或立体异构体形式，其中
R1和R2独立地选自下组，该组由以下各项构成：氢、卤素、氰基、C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷基或C3-6环烷基；
R3选自下组，该组由以下各项构成：氢、C1-3烷基、C3-6环烷基、单-和多卤代-C1-3烷基、同芳基(homoaryl)以及杂芳基；
X1、X2、X3、X4独立地是C(R4)或N，其条件是其中不超过两个表示N；每个R4选自下组，该组由以下各项构成：氢、卤素、C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷基、氰基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢或C1-3烷基；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是苯基或经一个、两个或三个取代基取代的苯基，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基、嘧啶基、吡嗪基(pyrazyl)、哒嗪基(pyridazyl)、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基、噻二唑基、噁唑基、以及噁二唑基，每个任选地经一个、两个或三个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；或其加成盐或溶剂化物。
本发明示例了包括药学上可接受的载体以及任意上述化合物的一种药物组合物。本发明的一个示例是通过混合任意上述化合物与药学上可接受的载体制成的一种药物组合物。本发明示例了用于制造一种药物组合物的方法，该方法包括混合任意上述化合物与药学上可接受的载体。
本发明列举了治疗β-分泌酶介导的紊乱的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的任意上述化合物或药物组合物。
本发明进一步列举了抑制β-分泌酶的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的任意上述化合物或药物组合物。
本发明的一个实例是治疗选自下组的紊乱的方法，该组由以下各项构成：阿耳茨海默病、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆，优选地是阿耳茨海默病，该方法包括向需要其的受试者给予治疗有效量的任意上述化合物或药物组合物。
本发明的另一个实例是上述任意化合物对于在治疗需要其的受试者中的以下疾病中使用：(a)阿耳茨海默病、(b)轻度认知缺损、(c)老化、(d)痴呆、(e)路易体痴呆、(f)唐氏综合征、(g)与中风相关的痴呆、(h)与帕金森氏病相关的痴呆以及(i)与β-淀粉样蛋白相关的痴呆。
发明详细说明
本发明针对如在上文中定义的具有化学式(I)的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂化物。具有化学式(I)的化合物是β-分泌酶(也称作β-位点切割酶、BACE、BACE1、Asp2或膜天冬氨酸蛋白酶2)的抑制剂，并且在阿耳茨海默病、轻度认知缺损、老化、痴呆、与中风相关的痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆，优选地是阿耳茨海默病、轻度认知缺损或老化，更优选地是阿耳茨海默病的治疗中是有用的。
在本发明的一个实施例中，R1和R2独立地选自氢和C1-3烷基；
X1、X2、X3、X4独立地是C(R4)，其中每个R4选自氢和卤素；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是苯基或经一个、两个或三个取代基取代的苯基，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、以及多卤代-C1-3烷氧基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基、嘧啶基、以及吡嗪基，每个任选地经一个或两个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、以及多卤代-C1-3烷氧基；或
其加成盐或溶剂化物。
在本发明的另一个实施例中，R1和R2是氢；
X1、X2、X3、X4是CH；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是经氯取代的苯基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基以及嘧啶基，每个任选地经一个或两个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：氯、氟、氰基、甲基、以及甲氧基；或
其加成盐或溶剂化物。
在另一个实施例中，经R3取代的碳原子具有R-构型。
定义
“卤素”应指示氟、氯以及溴；“C1-3烷基”应指示具有1、2或3个碳原子的直链或支链饱和的烷基，例如，甲基、乙基、1-丙基以及2-丙基；“C1-3烷氧基”应指示一个醚基其中C1-3烷基如之前定义；“单-和多卤代C1-3烷基”应指示如之前定义的、经1、2、3个或可能的情况下如之前定义的更多个卤素原子取代的C1-3烷基；“单-和多卤代C1-3烷氧基”应指示一个醚基其中单-和多卤代C1-3烷基如之前定义；“C3-6环烷基”应指示环丙基、环丁基、环戊基以及环己基；“C3-6环烷二基”应指示一个二价基，如环丙烷二基、环丁烷二基、环戊烷二基以及环己烷二基。
在此使用的术语“受试者”是指动物，优选地是哺乳动物，最优选地是人类，该受试者是或已经成为治疗、观察或实验的对象。
在此使用的术语“治疗有效量”意指在研究员、兽医、医师或其他临床医生寻找的组织系统、动物或人中引起生物学或医学响应的活性化合物或药用试剂的量，该响应包括进行治疗的疾病或紊乱的症状的减轻。
在此使用的术语“组合物”意在涵盖包括处于特定量的特定成分的产物，连同直接或间接源于处于特定量的特定成分的组合的任何产物。
在上下文中，术语“具有化学式(I)的化合物”意在包括其加成盐、溶剂化物以及立体异构体。
在上下文中，术语“立体异构体”或“立体化学的同分异构形式”可互换地使用。
本发明包括为纯立体异构体或为两种或更多种立体异构体的混合物的、具有化学式(I)的化合物的全部立体异构体。
对映异构体是彼此非重叠镜像的立体异构体。一对的对映异构体的1∶1混合物是一种消旋体或消旋混合物。
非对映体(或非对映异构体)是不为对映异构体的立体异构体，即，它们是不相关的镜像。如果化合物包含一个双键，这些取代基可以处于E或Z构型。如果化合物包含一个双取代的环烷基，这些取代基可以处于顺式或反式构型。因此，本发明包括对映异构体、非对映异构体、消旋体、E异构体、Z异构体、顺式异构体、反式异构体及其混合物。
根据Cahn-Ingold-Prelog系统限定绝对构型。不对称原子处的构型由R或S限定。绝对构型未知的、已拆分的化合物可以被指定为(+)或(-)，取决于它们旋转平面偏振光的方向。
当鉴定一种特定立体异构体时，这意味着所述立体异构体基本上上无其他异构体，即，与其他异构体的关联小于50％，优选地小于20％，更优选地小于10％，甚至更优选地小于5％，特别是小于2％并且最优选地小于1％。因此，例如当具有化学式(I)的化合物被限定为(R)时，这意味着该化合物基本上上无(S)异构体；当具有化学式(I)的化合物被限定为E时，这意味着该化合物基本上无Z异构体；当具有化学式(I)的化合物被限定为顺式时，这意味着该化合物基本上无反式异构体。
具有化学式(I)的化合物与具有化学式(I-1)的互变异构体以动态平衡的形式共存。
Figure BDA0000374925510000071
此外，针对本发明化合物的一些晶型可以作为多晶型存在并且因此意在包括在本发明之内。此外，本发明的一些化合物可以与水(即，水合物)或常用有机溶剂形成溶剂化物，并且此类溶剂化物也意在涵盖在本发明的范围之内。
为了在医学中使用，本发明化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。然而，其他盐在制备根据本发明的化合物或它们的药学上可接受的盐中是有用的。这些化合物的适合的药学上可接受的盐包括可以通过，例如，混合该化合物溶液与一种药学上可接受的酸溶液形成的酸加成盐，该酸例如是，盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，在本发明的化合物携带一个酸性部分的情况下，其适合的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐，例如，钠或钾盐；碱土金属盐，例如，钙或镁盐；以及与适合的有机配体形成的盐，例如，季铵盐。
在药学上可接受的盐的制备中可以使用的代表性的酸包括但不局限于以下这些：乙酸、2，2-二氯乙酸、酰化氨基酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、L-谷氨酸、β-氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲基苯磺酸、三氟甲磺酸、以及十一碳烯酸。在药学上可接受的盐的制备中可以使用的代表性的碱包括但不局限于以下这些：铵、L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青霉素、氢氧化钙、胆碱、二甲基乙醇胺、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、哈胺(hydrabamine)、1H-咪唑、L-赖氨酸、氢氧化镁、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、仲胺、氢氧化钠、三乙醇胺、氨丁三醇以及氢氧化锌。
本发明化合物的化学名根据化学文摘服务社商定的命名法规产生。一些根据化学式(I)的化合物还能以它们的互变异构形式存在。此类形式，虽然没有在上述化学式中明确指出，但是也旨在包括在本发明的范围之内。
A.最终化合物的制备
实验程序1
根据反应方案(1)，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，水或甲醇)中，在热条件(例如像，在60℃至90℃加热反应混合物，持续例如4至100小时)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(II)的中间化合物与一种适当的氨源(例如像，氯化铵或氨水)进行反应来制备根据化学式(I)的最终化合物。在反应方案(1)中，所有变量如在化学式(I)中定义。
Figure BDA0000374925510000091
反应方案1
实验程序2
根据反应方案(2)，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，N,N-二甲基-甲酰胺)中，在一种适合的碱(例如像，K3PO4)、铜催化剂(例如像，CuI)以及二胺(例如像，(1R,2R)-(-)-1,2-二氨基环己烷)的存在下，在热条件(例如像，在微波辐射下，在180℃加热反应混合物，持续例如135分钟)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(III-a)的中间化合物与具有化学式(IV)的中间体进行反应来制备根据化学式(I-a)(其中L是-N(R5)CO-)的最终化合物。在反应方案(2)中，所有变量如在化学式(I)中定义，并且W是卤素。
Figure BDA0000374925510000092
反应方案2
实验程序3
额外地，根据反应方案(3)，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，二氯甲烷或甲醇)中，任选地在一种适合的碱(例如像，N,N-二异丙基乙胺)存在下，在一种缩合剂(例如像，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯或4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物])的存在下，在热条件(例如像，在25℃加热反应混合物，持续例如2小时)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(III-b)的中间化合物与具有化学式(V)的中间体进行反应来制备根据化学式(I-a)的最终化合物。在反应方案(3)中，所有变量如在化学式(I)中定义。
反应方案3
实验程序4
额外地，根据反应方案(4)，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，二氯甲烷)中，在一种适合的碱(例如像，吡啶)存在下，在热条件(例如像，在25℃加热反应混合物，持续例如2小时)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(III-b)的中间化合物与具有化学式(VI)的中间体进行反应来制备根据化学式(I-a)的最终化合物。在反应方案(4)中，所有变量如在化学式(I)中定义，并且Y是卤素。
Figure BDA0000374925510000111
反应方案4
实验程序5
根据反应方案(5)，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，惰性溶剂例如像1，4-二噁烷／乙醇的混合物)中，在一种适合的碱(例如像，K2CO3)、Pd-络合催化剂(例如像，四(三苯基膦)合钯(0))的存在下，在热条件(例如像，在微波辐射下，在80℃加热反应混合物，持续例如20小时或例如，在150℃加热反应混合物持续10min至30min)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(III-a)的中间化合物与具有化学式(VII)的中间体进行反应来制备根据化学式(I-b)(其中L是一个键)的最终化合物。在反应方案(5)中，所有变量如在化学式(I)中定义，并且W是卤素。R6和R7可以是氢或烷基，或可以作为整体形成例如具有化学式-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、或-C(CH3)2C(CH3)2-的一个二价基。
Figure BDA0000374925510000112
反应方案5
实验程序6
根据反应方案(6)，遵循本领域中已知的程序，可以从相应的、具有化学式(I-d)的最终化合物(其中R1选自下组，该组由以下各项构成：氯、溴和碘)来制备根据化学式(I-c)(其中R1是氢)的最终化合物。例如，可以在氢气氛以及一种适当的催化剂(例如像，钯炭、铂炭、拉内镍以及类似催化剂)存在下，通过搅拌这些反应物进行所述还原。适合的溶剂是，例如，水、链烷醇(例如，甲醇、乙醇以及类似物)、酯(例如，乙酸乙酯以及类似物)。为了增强所述还原反应的速率，升高反应混合物的温度和／或压力可以是有利的。可以通过向该反应混合物中添加催化剂毒物(例如像，噻吩以及类似物)来阻止这些反应物以及反应产物中所不希望的、某些官能团的进一步氢化。在反应方案(6)中，所有变量如在化学式(I)中定义。
Figure BDA0000374925510000121
反应方案6
前述制备中的多个中间体以及起始材料是可以根据本领域中已知的、制备所述或类似化合物的方法来制备的已知化合物并且一些中间体是新的。在下文中将更加详细地描述此类制备方法中的多个。
B.中间化合物的制备
实验程序7
根据反应方案(7)，在一种反应惰性溶剂(例如像，四氢呋喃或甲苯)中，在一种适合的碱(例如像，吡啶)存在下，在热条件(例如像，在100℃加热反应混合物，持续例如5小时)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(VIII)的中间化合物与用于合成硫代酰胺的一种适合的硫供体试剂(donatingreagent)(例如像，五硫化磷或2,4-双-(4-甲氧苯基)-1，3-二硫杂-2,4-二磷杂环丁烷2,4-二硫化物[劳森试剂])进行反应来制备根据化学式(II)的中间体。在反应方案(7)中，所有变量如在化学式(I)中定义。
Figure BDA0000374925510000131
反应方案7
实验程序8
根据反应方案(8)，在一种适合的惰性溶剂混合物(例如像，1，4-二噁烷／水)中，在一种适合的碱(例如像，水性Na2CO3)、Pd-络合催化剂(例如像，四(三苯基膦)合钯(0))的存在下，在热条件(例如像，在微波辐射下，在80℃加热反应混合物，持续例如20小时或例如，在150℃加热反应混合物持续例如10min至30min)进行的一个反应，可以通过将具有化学式(IX-a)的中间化合物与具有化学式(VII)的中间体进行反应来制备根据化学式(VIII-a)(其中L是一个键)的中间体。在反应方案(8)中，所有变量如在化学式(I)中定义，并且W是卤素。R6和R7可以是氢或烷基，或可以作为整体形成例如具有化学式-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、或-C(CH3)2C(CH3)2-的一个二价基。
Figure BDA0000374925510000141
反应方案8
实验程序9
根据反应方案(9)，遵循本领域中已知的布赫瓦尔德-哈特维希型耦合程序，可以从相应的、具有化学式(III-a)的中间化合物来制备根据化学式(III-b)的中间体。可以通过将具有化学式(III-a)的中间化合物用具有化学式(X)的中间体在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，乙醇或如1,2-二甲氧基乙烷／水／乙醇的惰性溶剂混合物)中，在一种适合的碱(例如像，水性K3PO4或Cs2CO3)、Pd-络合催化剂(例如像，[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯钯(II)或反式-双(二环己胺)二乙酸钯[DAPCy])的存在下，在热条件(例如像，在微波辐射下，在80℃加热反应混合物，持续例如20小时或例如，在130℃加热反应混合物持续10min)进行处理来进行所述偶联。在反应方案(9)中，所有变量如在化学式(I)中定义，并且W是卤素。R5是氢或C1-3烷基。可替代地，当R5是氢时，具有化学式(III-b)的中间体也可以按照两步合成来获得。首先，可以在本领域的普通技术人员已知的条件下，在中间体(III-a)以及一种稳定的亚胺(例如二苯甲酮亚胺)之间进行布赫瓦尔德-哈特维希型耦合。在第二个步骤中，可以在热条件(例如像，在25℃加热反应混合物，持续例如2小时)，通过将溶解于一种适合的溶剂(如异丙醇)中的耦合产物用一种酸(例如像，盐酸)进行处理来获得为伯胺的中间体(III-b)。
Figure BDA0000374925510000151
反应方案9
实验程序10
额外地，根据反应方案(10)，遵循本领域中已知的硝基-至-氨基还原程序，可以从相应的、具有化学式(III-c)的中间体来制备根据化学式(III-b)的中间体(其中R5是氢)。例如，在一种适当的还原剂(如氯化锡、锌或铁)存在下，在一种适合的惰性溶剂(如乙醇或乙醇／乙酸或甲醇／氯化铵水溶液的混合物)中，在适合的反应条件(例如在方便的温度，典型地在70℃与110℃之间的范围内持续确保完成该反应的一段时间)下，可以方便地进行所述还原。本领域的普通技术人员将理解，在中间体(III-c)中的R1和／或R2为卤素(选自由氯、溴和碘构成的组)并且不希望在该最终化合物中存在的情况下，在上述条件下也可以发生氧化加成-质子化过程从而得到中间体(III-b)(其中R1和／或R2是氢)。可替代地，可以在氢气氛以及一种适当的催化剂(例如像，钯炭、铂炭、拉内镍以及类似催化剂)存在下，通过搅拌这些反应物进行所述还原。适合的溶剂是，例如，水、链烷醇(例如，甲醇、乙醇以及类似物)、酯(例如，乙酸乙酯以及类似物)。为了增强所述还原反应的速率，升高反应混合物的温度和／或压力可以是有利的。可以通过向该反应混合物中添加催化剂毒物(例如像，噻吩以及类似物)来阻止这些反应物以及反应产物中所不希望的、某些官能团的进一步氢化。在反应方案(10)中，所有变量如在化学式(I)中定义。
Figure BDA0000374925510000161
反应方案10
实验程序11
通常，遵循下文反应方案(11)以及(12)中示出的反应步骤可以制备具有化学式(III-a)与(III-c)的化合物。
Figure BDA0000374925510000171
反应方案11
A：硫代酰胺-至-脒的转化
B：酰胺-至-硫代酰胺的转化(硫化)
C：环化
D：去除任意N-保护基
E：金属化
遵循本领域中已知的硫代酰胺-至-脒的转化程序，可以从相应的硫代酰胺衍生物方便地制备上述反应方案(11)中的脒衍生物(反应步骤A)。可以方便地通过将所述硫代酰胺在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，水或甲醇以及类似溶剂)中，在热条件(例如像，在60℃至90℃加热反应混合物，持续例如6至100小时)用一种氨源(例如像，氯化铵或氨水)处理来进行所述转化。
遵循本领域中已知的硫化程序，可以从酰胺衍生物制备上述反应方案(11)中的硫代酰胺衍生物(反应步骤B)。可以方便地通过将所述酰胺在纯净条件下或在一种反应惰性溶剂(例如像，四氢呋喃或1，4-二噁烷以及类似溶剂)中，任选地在一种适合的碱(像吡啶)存在下，在热条件(例如像，在50℃至100℃加热反应混合物，持续例如24小时)，用一种硫化剂(例如像，五硫化磷或2，4-双-(4-甲氧基-苯基)-1，3-二硫杂-2，4-二磷杂环丁烷2，4-二硫化物[劳森试剂])处理来进行所述转化。
遵循本领域中已知的环化程序，可以从相应的、具有化学式(XII-a)和(XII-c)的中间化合物制备上述反应方案(11)中具有化学式(IX-a)和(IX-c)的酰胺衍生物(反应步骤C)。通过将具有化学式(XII-a)和(XII-c)的中间化合物用一种适合的碱(如乙酸钾)，在一种适合的反应溶剂(例如像乙醇以及类似溶剂)中，在70℃至100℃持续确保完成该反应的一段时间，可以方便地进行所述环化。
可以通过硝基至氨基的还原，随后通过重氮化-脱氨基反应，从具有化学式(IX-a-1)的中间体(其中R2是硝基)制备具有化学式(IX-a)的中间体(其中R2是氢)。
可以通过将酯基通过本领域的普通技术人员已知的若干种方法之一转化为醛，随后通过醛基与DAST的反应，从具有化学式(IX-a-2)的中间体(其中R2是烷氧基羰基)制备具有化学式(IX-a)的中间体(其中R2是二氟甲基)。
可以通过根据本领域的普通技术人员已知的方法，进行保护基的去除，从相应的、具有化学式(XIII-a)和(XIII-c)的中间化合物制备上述反应方案(11)中具有化学式(XII-a)和(XII-c)的中间化合物(反应步骤D)。
遵循本领域中已知的金属化程序，可以从相应的、具有化学式(XIV-c)的中间化合物制备上述反应方案(11)中具有化学式(XIII-c)的中间化合物(反应步骤E)。通过将具有化学式(XIV-c)的中间化合物用一种适合的碱(如二异丙氨基锂)以及一种适合的亲电试剂(例如干冰或氯甲酸乙酯)，在一种适合的反应溶剂(例如像四氢呋喃)中，在-80℃至0℃持续确保完成该反应的一段时间，可以方便地进行所述金属化。
Figure BDA0000374925510000201
反应方案12
F：烷基化
G：氧杂噻唑烷氧化
H：氧杂噻唑烷形成
遵循本领域中已知的烷基化程序，可以从相应的、具有化学式(XVI-a)和(XVI-c)的中间化合物(其中，Z1是胺的保护基，例如像叔-丁氧基羰基)制备上述反应方案(12)中根据化学式(XIII-a)和(XVI-c)的中间体(反应步骤F)。可以通过将各自具有对应化学式(XVI-a)和(XVI-c)的中间化合物的(XV-a)和(XV-c)用一种适合的碱(例如像，碳酸钠或碳酸铯)，在一种适合的惰性溶剂(例如像，N，N-二甲基甲酰胺或二甲氧基亚砜)中，在低温(例如像0℃)持续30min，并且然后在适度高温(例如像100℃)持续24小时至100小时，或例如，在微波辐射下，在130℃加热反应混合物，持续例如30min至45min处理来方便地进行所述烷基化。
遵循本领域中已知的氧化程序，可以通过使具有化学式(XVII-a)和(XVII-c)的中间化合物反应来制备上述反应方案(12)中根据化学式(XVI-a)和(XVI-c)的中间体(反应步骤G)。通过将对应的、具有化学式(XVII-a)和(XVII-c)的中间化合物用一种氧化剂(例如像，高碘酸钠)，在一种适合的惰性溶剂(例如像，乙腈/水)中，在氯化钌(III)存在下，在适度高温(例如像25℃)持续例如2小时处理来方便地进行所述氧化。
遵循本领域中已知的磺酰胺化物形成程序，可以通过使具有化学式(XVIII-a)和(XVIII-c)的中间化合物反应来制备上述反应方案(12)中根据化学式(XVII-a)和(XVII-c)的中间体(反应步骤H)。通过将对应的、具有化学式(XVIII-a)和(XVIII-c)的中间化合物用亚硫酰二氯，在一种碱(例如像吡啶)存在下，在一种适合的反应-惰性溶剂(例如像，乙腈)中，在低温(例如像-40℃)持续例如30min，并且然后在适度高温(例如像25℃)持续例如24至72小时处理来方便地进行所述转化。
通常，遵循本领域已知的、描述于文献中的斯特雷克尔型程序，可以制备具有化学式(XVIII-a)和(XVIII-c)的中间化合物(其中Z1是胺的保护基(例如像叔-丁氧基羰基))。
药理学
本发明的化合物及其药学上可接受的组合物抑制BACE，并且因此可以在治疗或预防阿耳茨海默病(AD)、轻度认知缺损(MCI)、老化、痴呆、路易体痴呆、大脑淀粉样血管病、多发梗塞性痴呆、唐氏综合征、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆中有用。
本发明涉及一种用作药物的、根据通式(I)的化合物、其立体异构形式或其药学上可接受的酸或碱加成盐或溶剂化物。
本发明还涉及一种根据通式(I)的化合物、其立体异构形式或其药学上可接受的酸或碱加成盐或溶剂化物，对于在治疗或预防以下疾病或病症中使用，这些疾病或病症选自下组，该组由以下各项构成：AD、MCI、老化、痴呆、路易体痴呆、大脑淀粉样血管病、多发梗塞性痴呆、唐氏综合征、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆。
本发明还涉及根据通式(I)的化合物、其立体异构形式或其药学上可接受的酸或碱加成盐或溶剂化物，用于制造用于治疗或预防上文中提及的任意一种疾病症状的药物的用途。
鉴于具有化学式(I)的化合物的应用，提供了治疗患有上文中提及的任意一种疾病的温血动物(包括人类)的方法，或一种预防温血动物(包括人类)免遭上文中提及的任意一种疾病折磨的方法。
所述方法包括向温血动物(包括人类)给予，即，全身给予或局部给予，优选口服给予一个有效量的具有化学式(I)的化合物、其立体异构形式、其药学上可接受的加成盐或溶剂化物。
治疗方法还包括在一个疗程中给予每天一到四次摄入之间的活性成分。在这些治疗方法中，根据本发明的化合物优选地在给予之前配制。如在此在下文所述的，使用熟知且容易获得的成分通过已知程序制备适合的药用制剂。
可以适合治疗或预防阿耳茨海默病或其并发症的、本发明的化合物可以单独给予或与一种或多种额外的治疗剂组合给予。联合治疗包括：包含具有化学式(I)的化合物以及一种或多种额外的治疗剂的单个药物剂型的给予，连同具有化学式(I)的化合物和以其自身分开的药物剂量制剂存在的每种额外治疗剂的给予。例如，可以向患者给予一起处于单一口服剂量组合物例(如片剂或胶囊)中的具有化学式(I)的化合物以及治疗剂，或可以将每种药剂以分开的口服剂量制剂进行给予。
药物组合物
本发明还提供了用于预防及治疗其中β-分泌酶的抑制是有益的疾病，例如阿耳茨海默病(AD)、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆的组合物。所述组合物包括治疗有效量的、根据化学式(I)化合物与药学上可接受的载体或稀释剂。
尽管活性成分可以单独给予，但是其优选地是作为药物组合物存在。因此，本发明进一步提供了一种药物组合物，包括根据本发明的化合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。该载体或稀释剂在与该组合物其他成分的相容性的意义上必须是“可接受的”并且对其受体无毒。
本发明的药物组合物可以通过制药领域中熟知的任何方法制备。将作为活性成分的一种治疗有效量的具体化合物，处于碱形式或加成盐形式，与一种药学上可接受的载体组合为一个亲密的掺合物，该载体可以采取多种形式，取决于希望给予的制剂的形式。优选地，希望地是这些药物组合物处于适合的全身给予，例如，口服、经皮或肠胃外给予；或局部给予，例如，经由吸入剂、鼻喷雾、滴眼剂或经由乳膏、凝胶、洗涤剂或类似物的单位剂型。例如，在制备处于口服剂型的组合物中，在口服液体制剂(例如悬浮液、糖浆、酏剂和溶液)的情况下，可以采用的任何常用药物介质，例如像水、二醇类、油类、醇类等；或者在粉剂、丸剂、胶囊、以及片剂的情况下，采用固体载体，例如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于它们的给药方便，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在此情况下显然采用固体药物载体。对于肠胃外组合物，载体通常至少大部分包括无菌水，虽然可以包括例如帮助溶解的其他成分。例如可以制备注射溶液，其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水与葡萄糖溶液的混合物。也可以制备注射混悬液，在此情况下可以采用适当的液体载体、悬浮剂等。在适合皮下给药的组合物中，载体任选地包括渗透增强剂和/或适合的可润湿剂，任选地与小比例的适合的任何性质的添加剂结合，这些添加剂不会引起任何对皮肤的显著有害作用。所述添加剂可以促进对皮肤的给予和/或可以有助于制备希望的组合物。能以不同方式给予这些组合物，例如，作为透皮贴剂、作为spot-on或作为软膏剂。
为了便于给药和剂量的一致性，尤其有利的将上述药物组合物配制为单位剂型。如在说明书和权利要求中使用的，剂量单位剂型是指适合作为单一剂量的物理上离散的单位，各单位含有经计算以产生所希望的与所需药物载体关的疗效的预定量的活性成分。这样的剂量单位剂型的实例是片剂(包括刻痕片剂或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉包、薄片、注射溶液或悬浮液、一茶匙的量、一大汤匙的量等，及其分开的多种剂型。
如本领域的普通技术人员所熟知的，给予的精确剂量以及频率取决于具体使用的具有化学式(I)的化合物、进行治疗的具体病症、进行治疗的病症的严重性、具体患者的年龄、体重、性别、疾病程度以及总体身体健康状况，连同个体可以服用的其他药物。此外，显然有效的所述每日量可以降低或增加，这取决于所治疗的受试者的反应和/或取决于对本发明的这些化合物开处方的医师的评估。
取决于给予模式，该药物组合物将包括按重量计从0.05％至99％，优选地按重量计从0.1％至70％，更优选地按重量计从0.1％至50％的活性成分，以及按重量计从1％至99.95％，优选地按重量计从30％至99.9％，更优选地按重量计从50％至99.9％的一种药学上可接受的载体，所有的百分数都基于该组合物总重量。
这些化合物可以用于全身给予，例如，口服、经皮或肠胃外给予；或局部给予，如，经由吸入剂、鼻喷雾、滴眼剂或经由乳膏、凝胶、洗涤剂或类似物。优选地这些化合物经口给予。如本领域的普通技术人员所熟知的，给予的精确剂量以及频率取决于具体使用的根据化学式(I)的化合物、进行治疗的具体病症、进行治疗的病症的严重性、具体患者的年龄、体重、性别、疾病程度以及总体身体健康状况，连同个体可以服用的其他药物。此外，显然有效的所述每日量可以降低或增加，这取决于所治疗的受试者的反应和/或取决于对本发明的这些化合物开处方的医师的评估。
可以与载体物质组合以生产一种单一剂型的具有化学式(I)的化合物的量将取决于治疗的疾病、哺乳动物种类、以及具体给予模式而变化。然而，作为一般指导，适合本发明的这些化合物的单位剂量可以，例如，优选地包含0.1mg至约1000mg之间的活性化合物。优选的单位剂量在1mg至约500mg之间。更优选的单位剂量在1mg至约300mg之间。甚至更优选的单位剂量在1mg至约100mg之间。此类单位剂量可以一天给予超过一次，例如一天2、3、4、5或6次，但是优选地每天1或2次，使得对于70kg成年人而言，每次给予的总剂量范围在每kg受试者体重0.001至约15mg。优选的剂量是每次给予每kg受试者体重0.01至约1.5mg，并且此类疗法可以持续多个星期或月份，并且在一些情况中，持续多年。然而，如本领域普通技术人员充分理解的，将理解，针对任何具体患者的特定剂量水平取决于多种因素，包括使采用的特定化合物的活性；进行治疗个体的年龄、体重、总体身体健康状况、性别以及饮食；给予时间及途径；排泄率；先前已经给予的其他药物；以及进行治疗的具体疾病的严重性。
如本领域普通技术人员将理解的，在一些情况中可能有必要使用这些范围外的剂量。另外，指出临床医生或治疗医生结合个体患者响应将知道如何以及何时开始、中断、调节、或终止治疗。
以下实例旨在说明性但并非限制本发明的范围。
实验部分
在下文中，术语“AcOH”意思是乙酸，“HCl”意思是盐酸，“AcOEt”意思是乙酸乙酯，“DCM”意思是二氯甲烷，“DIPE”意思是二异丙醚，“DMF”意思是N，N-二甲基甲酰胺，“CO2”意思是二氧化碳，“DMSO”意思是二甲亚砜，“Et2O”意思是二乙醚，“Et3N”意思是三乙胺，“EtOH”意思是乙醇，“iPrOH”意思是异丙醇，“iPrNH2”意思是异丙胺，“MeCN”意思是乙腈，“MeOH”意思是甲醇，“NaOH”意思是氢氧化钠，“NH4Cl”意思是氯化铵，“NH3”意思是氨，“NaHCO3”意思是碳酸氢钠，“NaHSO4”意思是硫酸氢钠，“Na2CO3”意思是碳酸钠，“Na2SO4”意思是硫酸钠，“H2SO4”意思是硫酸，“MgSO4”意思是硫酸镁，“CuI”意思是碘化亚铜，“TFA”意思是三氟甲磺酸，“RuO2”意思是氧化钌，“DAST”意思是三氟化二乙氨基硫，“DBU”意思是1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯，“N2”意思是氮，“CO2”意思是二氧化碳，“aq.”意思是水性，“min”意思是分钟，“m.p.”意思是熔点，“rac”意思是消旋的，“Rt”意思是保留时间，“THF”意思是四氢呋喃，“SFC”意思是超临界流体色谱。
在一个单模反应器中进行微波辅助反应：EmrysTM Optimizer微波反应器(Personal Chemistry A.B.，currently Biotage)。
在来自ThalesNano纳米技术公司(ThalesNano Nanotechnology Inc.)的一个连续流氢化器
Figure BDA0000374925510000271
中进行氢化反应。
使用试剂级溶剂，在硅胶60F254板(默克公司)上进行薄层色谱分析法(TLC)。在标准技术下，在硅胶上进行开口柱色谱法，粒度60
Figure BDA0000374925510000272
，网目＝230-400(默克公司)。使用来自默克公司的随时连接柱，在来自ArmenInstrument的SPOT或LAFLASH系统上，在不规则凝胶上进行快速柱色谱法，粒度15-40μm(正向层一次性使用的快速柱)。
在Perkin-Elmer341旋光计上用钠灯测量旋光度并且报导如下：[α]°(λ，cg/100ml，溶剂，T℃)。
在可商购的Vapourtec R2+R4模块化装置中进行流动反应。
对于关键中间体，连同一些最终化合物，手性中心的绝对构型(表示为R和/或S)经由与已知构型的样品的比较或使用适合绝对构型测定的分析技术，例如VCD(振动圆二色)或X-射线结晶确定。当手性中心的绝对构型未知时，主观地指定为R*。
A.中间体的制备
实例A1
中间体A1：rac-2-氨基-2-(3-溴-苯基)-丙腈的制备
Figure BDA0000374925510000281
将三甲基甲硅烷基氰化物(20g，200mmol)添加到3-溴-乙酰苯(20g，100mmol)以及NH4Cl(11g，200mmol)在NH3/MeOH(400mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在室温下搅拌4天。在真空中蒸发溶剂并且将残余物吸收到AcOEt(100mL)中。过滤掉固体并且将滤液在真空中蒸发以获得中间体A1(20g，86％产率)，将其不进一步纯化而用于下一步骤中。
实例A2
中间体A2：rac-2-氨基-2-(3-溴-苯基)-丙酸甲酯的制备
Figure BDA0000374925510000282
将中间体A1(20g，88.9mmol)溶解于HCl/MeOH(500mL)中。将该混合物回流4天。冷却到室温后，添加AcOEt(100mL)以及H2O(100mL)并且将该混合物用AcOEt(2×100mL)进行萃取。将合并的水层用NH3溶液碱化至pH＝8并且用AcOEt(5×100mL)进行萃取。干燥(Na2SO4)这些合并的有机层，过滤并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种油的中间体A2(10.6g，46％产率)。LCMS：258[M+H]+；Rt：3.77min(方法7)。
根据实例A1-A2中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A3
中间体A3：rac-2-氨基-2-(3-硝基-苯基)-丙酸甲酯的制备
Figure BDA0000374925510000291
来自rac-2-氨基-2-(3-硝基-苯基)-丙腈。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/石油醚)以获得中间体3(63％)。LCMS：225[M+H]+；Rt：0.98min(方法9)。
实例A4
中间体A4：rac-2-氨基-2-(3-溴-苯基)-丙-1-醇的制备
在-15℃，将氢化铝锂(1M于THF中；22mL，22mmol)滴加到中间体A2(7.5g，29.1mmol)在THF(200mL)中的搅拌溶液里。经1小时，将该混合物缓慢加热至0℃。添加更多的THF(150mL)并且滴加Na2SO4的饱和溶液直到不再有氢气形成。添加无水Na2SO4并且在室温搅拌过夜。将该混合物用硅藻土过滤，用THF洗涤并且在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH/DCM中的7M溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种油的中间体A4(5.70g，85％产率)。LCMS：230[M+H]+；Rt：0.69min(方法1)。
实例A5
中间体A5：rac-2-氨基-2-(3-硝基-苯基)-丙-1-醇的制备
Figure BDA0000374925510000293
将硼氢化钠(16.3g，429.4mmol)分批添加到中间体A3(48.3g，214.7mmol)在MeOH(500mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在室温下搅拌10小时。在真空中蒸发溶剂。将残余物用NaHCO3的饱和水溶液碱化至pH＝9并且用AcOEt(3×200mL)进行萃取。干燥(Na2SO4)这些有机层，过滤并且在真空中蒸发溶剂，以获得中间体A5(30.26g，72％产率)。LCMS：197[M+H]+；Rt：3.16min(方法8)；m.p.238.7℃-241.6℃(WRS-2A)。
实例A6
中间体A6：(R)-2-氨基-2-(3-溴-苯基)-丙-1-醇的制备
Figure BDA0000374925510000301
通过制备型SFC((Daicel AD x250mm)、流动相(CO2，具有0.2％iPrNH2的MeOH))，将中间体A4的样品(15.4g)分离为相应的对映异构体，以获得中间体A6(7.21g，40％产率)。LCMS：230[M+H]+；Rt：0.71min(方法1)；αD：-14.9°(589nm，c0.2946w/v％，MeOH，20℃)。
实例A7
中间体A7：(R)-[1-(3-溴-苯基)-2-羟基-1-甲基-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000302
在0℃，将二-叔-丁基二碳酸酯(19.8g，90.7mmol)分批添加到中间体A6(11.6g，50.4mmol)在NaHCO3(100mL)与THF(100mL)的饱和溶液的混合物中的搅拌溶液里。将该混合物在0℃搅拌10min并且在室温下搅拌15小时。将该混合物在冰/H2O浴中冷却并且边搅拌边用NaHSO4酸化至pH＝1-2。分离有机层并且将水层进一步用AcOEt萃取。分离合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过短柱层析法(硅胶；AcOEt/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且真空中进行浓缩，以获得静置时固化的、为一种无色油的中间体A7(16.47g，99％产率)。LCMS：330[M+H]+；Rt：2.58min(方法1)。
实例A8
中间体A8：(R)-[3-(叔丁氧羰基)-4-(3-溴-苯基)-4-甲基-[1，1，3]氧杂噻唑烷-2-氧化物的制备
Figure BDA0000374925510000311
将中间体A7(14.3g，43.3mmol)在干MeCN(80mL)中的溶液滴加到冷却至-40℃并且在N2气氛下的亚硫酰二氯(7.9mL，108.3mmol)在干MeCN(226mL)中的搅拌溶液里。添加吡啶(17.4mL，216.5mmol)之前，将该反应混合物在-40℃搅拌30min。允许该反应加热至室温并且搅拌64小时。在真空中蒸发溶剂。将残余物用Et2O处理。过滤固体并且将滤液在真空中浓缩，以获得为一种红色油的中间体A8(15.5g，95％产率)。该产物不进一步纯化而用于下一反应中。LCMS：393[M+NH4]+；Rt：3.4min(方法1)。
实例A9
中间体A9：(R)-[3-(叔丁氧羰基)-4-(3-溴-苯基)-4-甲基-[1，1，3]氧杂噻唑烷-2，2-二氧化物的制备
Figure BDA0000374925510000312
在0℃，将氯化钌(III)(85mg，0.41mmol)添加到中间体A8(15.3g，40.8mmol)在MeCN与H2O(1：1)(438mL)的混合物中，随后添加高碘酸钠(13.1g，61.2mmol)。允许该反应加热至室温并且搅拌2小时。将混合物用硅藻土过滤并且用AcOEt(125mL)洗涤。向滤液中添加H2O(125mL)和AcOEt(250mL)。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；DCM)纯化该产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的中间体A9(14.4g，90％产率)。LCMS：409[M+NH4]+；Rt：3.3min(方法1)；m.p.133.1℃(FP90)；αD：-35.6°(589nm，c0.55w/v％，DMF，20℃)。
根据实例A7-A9中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A10
中间体A10：rac-[3-(叔丁氧羰基)-4-(3-硝基-苯基)-4-甲基-[1，1，3]氧杂噻唑烷-2，2-二氧化物的制备
Figure BDA0000374925510000321
制备自rac-[3-(叔丁氧羰基)-4-(3-硝基-苯基)-4-甲基-[1，1，3]氧杂噻唑烷-2-氧化物。快速柱色谱法(硅胶；DCM)以获得为黄色固体的中间体A10(95％)。LCMS：376[M+NH4]+；Rt：1.35min(方法2)。
实例A11
中间体A11：2-[2-(3-溴-苯基)-2R-叔-丁氧基羰基-氨基-丙基]-2H-吡唑-3-羧酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000331
在室温下，将碳酸铯(824mg，2.53mmol)添加到中间体A9(0.661g，1.69mmol)与2H-吡唑-3-羧酸乙酯(260mg，1.86mmol)在DMSO(8mL)的混合物中。将该混合物在室温搅拌30min并且在110℃搅拌3小时。将该混合物用柠檬酸与DCM(20mL)的饱和溶液进行处理并且搅拌2小时。分离有机相并且用H2O(10mL)进行处理并且用DCM(2×10mL)萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种无色油的中间体A11(186mg，24％产率)。LCMS：452[M+H]+；Rt：4.23min(方法3)。
实例A12
中间体A12：rac-[2-(4-溴-吡唑-1-基)-1-甲基-1-(3-硝基-苯基)-乙基]-氨基甲酸叔丁基酯的制备
Figure BDA0000374925510000332
将碳酸钠(59mg，0.56mmol)添加到中间体A10(100mg，0.28mmol)与4-溴-1H-吡唑(53mg，0.36mmol)在DMF(3mL)中的混合物里。将该混合物在130℃搅拌2小时。在真空中蒸发溶剂。将该残余物用H2O(2mL)进行处理并且用DCM(2×10mL)萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得经Et2O处理之后为白色固体的中间体A12(100mg，84％产率)。LCMS：425[M+H]+；Rt：3.57min(方法3)；m.p.159.3℃(FP90)。
实例A13
中间体A13：(R)-2-[2-氨基-2-(3-溴-苯基)-丙基]-2H-吡唑-3-羧酸乙酯的制备
在0℃，将三氟乙酸(1mL)添加到中间体A11(186mg，0.41mmol)在DCM(5mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在室温下搅拌2小时。在真空中蒸发溶剂以获得不进一步纯化而用于下一步骤中的、为一种无色油的中间体A13(180mg，94％产率)。LCMS：352[M+H]+；Rt：2.69min(方法3)。
实例A14
中间体A14：rac-4-溴-2-[2-叔-丁氧基羰基氨基-2-(3-硝基-苯基)-丙基]-2H-吡唑-3-羧酸的制备
Figure BDA0000374925510000342
在-78℃，将二异丙氨基锂在THF与庚烷(0.25mL，0.49mmol)中的2M溶液添加到中间体A12(100mg，0.24mmol)在THF(3mL)中的溶液里。将反应混合物在-78℃搅拌1小时。然后添加干冰并且经2小时将该混合物加热至室温。将该混合物用NH4Cl的饱和溶液进行处理并且用DCM(3×10mL)进行萃取。分离有机层，干燥，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为无色油的中间体A14(60mg，54％产率)。LCMS：469[M+H]+；Rt：1.74min(方法3)。
实例A15
中间体A15：(R)-6-(3-溴-苯基)-6-甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000351
在室温下，将乙酸钾(83mg，0.85mmol)添加到中间体A13(180mg，0.39mmol)在EtOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在90℃搅拌5小时。在真空中蒸发溶剂。将该残余物用0.5M的HCl水溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种无色油的中间体A15(100mg，84％产率)。LCMS：306[M+H]+；Rt：2.01min(方法4)。
实例A16
中间体A16：rac-3-溴-6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000352
方法A
将三氟乙酸(3mL)添加到中间体A14(200mg，0.4mmol)在DCM(20mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌2小时。然后添加EtOH(3mL)中的乙酸钾(59mg，0.06mmol)。将该混合物在90℃搅拌3小时。在真空中蒸发溶剂。将该粗品用1M的HCl(10mL)水溶液进行处理并且将产物用AcOEt(4×20mL)萃取。分离有机层，干燥(MgS04)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的中间体A16(120mg，19％产率)。LCMS：351[M+H]+；Rt：2.45min(方法5)；m.p.285.3℃(FP90)。
方法B
在室温下，将三氟乙酸(100mL)添加到中间体A23(6.5g，13.07mmol)在DCM(200mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在室温下搅拌3小时。在真空中蒸发溶剂，然后添加乙酸钾(1.924g，19.60mmoL)以及EtOH(100mL)，并且将该反应在回流下搅拌4小时。将该粗品在真空中蒸发并且将该残余物用1M的HCl水溶液处理至pH=3。将该粗品用AcOEt(3×50m1)萃取，将有机相蒸干并且将粗品用冷EtOH以及Et20进行处理以获得为米色固体的中间体A16。将合并的溶剂在真空中蒸发并且通过柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的额外一批中间体A16(合并的量4g，87％)。LCMS：351[M+H]+；Rt：1.65min(方法3)。
实例A17
中间体A17：(R)-6-[3-(5-氯吡啶-3-基)-苯基]-6-甲基-6,7-二氢-5H吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000361
在室温、N2下将四(三苯基膦)合钯(0)(34mg，0.029mmol)添加到中间体A15(90mg，0.29mmol)与5-氯吡啶-3-硼酸(55mg，0.35mmol)在1,4-二噁烷(5mL)与Na2CO3(3mL)饱和溶液的混合物中的搅拌悬浮液里。在微波辐射下，将该混合物在150℃搅拌15min。冷却至室温之后，将该混合物用H2O进行稀释并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂并用冷EtOH与Et2O进行洗涤，以获得为白色固体的中间体A17(81mg，81％产率)。LCMS：339[M+H]+；Rt：0.89min(方法2)。
实例A18
中间体A18：(R)-6-[3-(5-氯-吡啶-3-基)-苯基]-6-甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
Figure BDA0000374925510000371
将五硫化二磷(71mg，0.32mmol)添加到中间体A17(90mg，0.27mmol)在吡啶(4mL)中的溶液里并且将该混合物在100℃加热5小时。在真空中蒸发溶剂并且将粗产物通过短柱层析法(硅胶；MeOH／DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种黄色油的中间体A18(60mg，63％产率)。LCMS：355[M+H]+；Rt：2.4min(方法3)。
根据实例A18中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A19
中间体A19：rac-3-溴-6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
Figure BDA0000374925510000381
制备自中间体A16。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为黄色固体的中间体A19(87％)。LCMS：366[M+H]+；Rt：2.37min(方法3)。
实例A20
中间体A20：rac-6-(3-氨基-苯基)-3-溴-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000382
在密封管中，将32％水性NH3溶液(3mL)添加到中间体A19(600mg，1.63mmol)在NH3于MeOH(5mL)中的7M溶液里的搅拌混合物中。将该混合物在60℃搅拌4小时。冷却至室温后，将这些溶剂在真空中蒸发。将该粗产物溶解于EtOH(20mL)中并且添加氯化锡(II)(372mg，1.96mmol)。将该混合物在90℃搅拌24小时。冷却至室温后，将该混合物用硅藻土过滤并且在真空中蒸发溶剂。将残余物用8％NaOH(10mL)水溶液进行处理并且用DCM(30mL)进行萃取。将该混合物在室温下搅拌1小时。分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种黄色油的中间体A20(200mg，38％产率)。LCMS：320[M+H]+；Rt：1.5min(方法6)。
实例A21
中间体A20：rac-6-(3-氨基-苯基)-3-溴-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺以及中间体A21：rac-3-溴-6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000391
在密封管中，将32％水性NH3溶液(4mL)添加到中间体A19(3.8g，10.35mmol)在NH3于MeOH(6mL)中的7M溶液里的搅拌混合物中。将该混合物在100℃搅拌6小时。冷却至室温后，将这些溶剂在真空中蒸发。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂且将粗产物通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂以获得中间体20(100mg，3％产率)、中间体21(200mg，6％产率)以及含有中间体20与21的混合物的部分(2.5g)。LCMS：A20：322[M+H]+，Rt：0.87min(方法3)；A21：350[M+H]+；Rt：0.95min(方法2)
实例A22
中间体A22：rac-6-(3-氨基-苯基)-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000392
方法A
将中间体A20(200mg，0.62mmol)在MeOH(30mL)与Et3N(5mL)中的溶液在H-Cube反应器(1.2mL／min，30mm钯碳10％连接柱，满氢模式(full hydrogen mode)，50℃，3循环)中进行氢化。将溶剂在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的中间体A22(100mg，66％产率)。LCMS：415[M+H]+；Rt：1.58min(方法3)。
方法B
在EtOH(100mL)与AcOH(20mL)中，将锌(1.33g，20.40mmol)添加到实例A21中所述的含有中间体20与21的混合物的部分(2.5g，7.46mmol)中。
将该混合物在回流下搅拌24小时。冷却至室温后，将该混合物用硅藻土过滤并且在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得静置时沉淀出的、为一种黄色油的中间体A22(0.93g，52％产率)。
使用氯甲酸乙酯代替干冰，根据实例A14中所述的合成程序制备以下中间体：
实例A23
中间体A23：rac-4-溴-2-[2-叔-丁氧基羰基氨基-2-(3-硝基苯基)-丙基]-2H-吡唑-3-羧酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000401
制备自中间体A12。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)以获得中间体A23(65％)。LCMS：499[M+H]+；Rt：4.09min(方法3)。
实例A24
中间体A24：rac-[1-甲基-1-(3-硝基-苯基)-2-(3-三氟-甲基吡唑-1-基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000411
在室温下，将中间体A10(2.5g，6.976mmo1)添加到3-(三氟-甲基)吡唑(1.234g，9.069mmo1)以及碳酸钾(1.928g，13.952mmo1)在DMF(175mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在110℃加热2小时。将溶剂蒸发并且将残余物用柠檬酸(80mL)与AcOEt(160mL)的饱和溶液进行处理。将该混合物在室温下搅拌1小时。分离有机层，干燥并在真空中蒸发。通过快速柱色谱法(硅胶；DCM)纯化该粗品。收集所希望的部分并且在真空中蒸发，以获得一种透明的油，该油在用冷Et2O处理并静置后，沉淀为一种白色固体(2g，69％)。
实例A25
中间体A25：rac-2-[2-叔-丁氧基羰基氨基-2-(3-硝基-苯基)-丙基]-5-三氟甲基-2H-吡唑-3-羧酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000412
制备自中间体A24。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)以获得中间体A25(51％)。LCMS：487[M+H]+；Rt：4.22min(方法3)。
根据实例A16-方法B中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A26
中间体A26：rac-6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-2-三氟甲基-6，7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000421
制备自中间体A25。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为白色固体的中间体A26(93％)。LCMS：339[M-H]-；Rt：2.21min(方法3)。根据实例A18-A21中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A27
中间体A27：rac-6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-2-三氟甲基-6，7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
Figure BDA0000374925510000422
制备自中间体A26。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为黄色固体的中间体A27(95％)。LCMS：355[M-H]-；Rt：1.29min(方法2)。
实例A28
中间体A28：rac-6-(3-氨基-苯基)-6-甲基-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺以及中间体A29：6-甲基-6-(3-硝基-苯基)-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
制备自中间体A27。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得中间体A28(16％)以及中间体A29(59％)。LCMS：A28：308[M-H]-；Rt：0.77min(方法2)；A29：338[M-H]-；Rt：2.28min(方法3)，
实例A29
中间体A28：rac-6-(3-氨基-苯基)-6-甲基-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000432
将铁(272mg，4.87mmo1)添加到中间体29(340mg，1mmo1)以及NH4C1(100mg)在MeOH(20.4mL)与H2O(6.8mL)中的混合物里。将该反应在80℃搅拌5小时。将粗品冷却并用硅藻土过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)纯化该残余物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种透明油的中间体A28(260mg，84％产率)。LCMS：310[M+H]+；Rt：2.50min(方法5)。
根据实例A1-A4中描述的合成程序制备以下中间体A30：
实例A30
中间体A30：rac-2-氨基-2-(5-溴-2-氟-苯基)-丙-1-醇、中间体A31：(R)-2-氨基-2-(5-溴-2-氟-苯基)-丙-1-醇以及中间体A32：(S)(S)-2-氨基-2-(5-溴-2-氟-苯基)-丙-1-醇的制备：
Figure BDA0000374925510000441
制备自1-(5-溴-2-氟-苯基)-乙酮。
然后将该外消旋物质通过制备型SFC(Chiralpak Diacel AD20μm(2000g)、流动相(70％庚烷，具有0.1％Et3N的30％EtOH))进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得中间体A31(44％)以及中间体A32(44％)。
根据实例A7-A12中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A31
中间体A33：(R)-[1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(4-氟-吡唑-1-基)-1-甲基-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000442
制备自中间体A31。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)以获得为一种透明油的中间体A33(55％)。LCMS：418[M+H]+；Rt：1.57min(方法2)。
根据实例A25中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A32
中间体A34：(R)-2-[2-(5-溴-2-氟-苯基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙基]-4-氟-2H-吡唑-3-羧酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000451
制备自中间体A33。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)以获得为一种透明油的中间体A34(67％)。LCMS：490[M+H]+；Rt：1.71min(方法2)。
根据实例A16-方法B中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A33
中间体A35：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000452
制备自中间体A34。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为一种油的中间体A35(90％)。LCMS：343[M+H]+；Rt：0.96min(方法2)。
根据实例A18中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A34
中间体A36：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
制备自中间体A35。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为黄色固体的中间体A36(85％)。LCMS：360[M+H]+；Rt：1.19min(方法2)。
实例A35
中间体A37：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000461
在室温下，将32％NH3水溶液(1.5mL)与NH3在MeOH(3mL)中的7M溶液添加到中间体A36(330mg，0.921mmo1)中。将该混合物于密封管中在100℃搅拌6小时，然后，冷却后，将溶剂在真空中去除。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗物料。收集所希望的部分以获得为一种透明油的中间体A37(260mg，83％)。LCMS：343[M+H]+；Rt：1.03min(方法2)。
实例A36
中间体A38：(R)-6-[5-(二苯亚甲基-氨基)-2-氟-苯基]-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000462
在室温下，于密封管中，在N2下，将甲苯(58mL)添加到中间体A37(3g，8.178mmo1)、三(二苯亚甲基丙酮)二钯(749mg，0.818mmo1)、2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-联萘(1.528g，2.453mmo1)以及叔丁醇钠(1.415g，14.72mmo1)的混合物中。将该混合物用N2冲洗几分钟并且然后添加二苯甲酮亚胺(2.745mL，16.356mmo1)并且将该混合物在90℃搅拌18小时。将该混合物在真空中浓缩冷并且然后将该混合物用H2O进行稀释并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为淡黄色固体的中间体A38(3g，83％)。LCMS：442[M+H]+；Rt：1.39min(方法2)。
实例A37
中间体A39：(R)-6-(5-氨基-2-氟-苯基)-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000471
将HC137％(1.05mL)添加到中间体A38(3g，6.795mmo1)在iPrOH(78mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌2小时。浓缩该混合物，并且然后用Et2O进行研磨。将固体过滤掉并且吸收在iPrOH中。将NaHCO3(5.709g)添加到其中并且将该混合物搅拌1小时，然后过滤并将滤液在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得一种淡黄色的油。将该物质用DIPE／Et2O3：1的混合物进行处理以获得为一种黄色固体的中间体A39(1.1g，58％)。LCMS：278[M+H]+；Rt：0.56min(方法2)。
实例A38
中间体A40：(3-乙酰基-4-氟-苯基)-胺甲酸苄酯的制备
Figure BDA0000374925510000472
在室温下，将氯甲酸苄酯(3mL，21.5mmo1)添加到1-(5-氨基-2-氟苯基)乙酮(3g，19.6mmo1)与四丁基溴化铵的混合物中。将该反应在室温搅拌24小时，将粗品用AcOEt(50mL)以及H2O(50mL)进行处理，将有机相分离并且在真空中蒸发。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗品。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为一种膏状固体的中间体A40(4.7g，84％)。LCMS：286[M-H]-；Rt：2.81min(方法3)。
根据针对中间体A11的合成描述的合成程序制备以下中间体：
实例A39
中间体A41：rac-{3-[2-(4-溴-吡唑-1-基)-1-叔-丁氧基羰基氨基-1-甲基-乙基]-4-氟-苯基}-氨基甲酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000481
制备自中间体A40。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)，随后用DIPE进行洗涤以获得为白色固体的中间体A41(72％)。LCMS：487[M+H]+；Rt：3.56min(方法3)。
实例A40
中间体A42：2-[2-[5-[双(乙氧羰基)氨基]-2-氟-苯基]-2-(叔-丁氧基羰基氨基)丙基]-4-溴-吡唑-3-羧酸rac-乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000482
在-70℃，于N2气氛下，将二异丙氨基锂(2M于环己烷／乙苯／THF中，7.36mL，14.721mmol)添加到中间体A41(2.1g，4.327mmol)在干THF(66mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在-70℃搅拌1小时，然后在-70℃添加氯甲酸乙酯(0.91mL，9.519mmol)并且将该反应在-30℃加热2小时。将该粗品在-50℃用NH4Cl(30mL)的饱和溶液进行淬灭并且加热至室温，将该粗品用AcOEt(3×20mL)进行萃取，将有机相在真空中蒸发，干燥，并将所得粗品通过快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发，以获得中间体A42(1.6g，59％)。LCMS：631[M+H]+；Rt：4.22min(方法3)。
根据实例A16-方法B中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A41
中间体A43：N-[3-(3-溴-6-甲基-4-氧代-5,7-二氢吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-N-乙氧羰基-氨基甲酸rac-乙酯以及中间体A44：N-[3-(3-溴-6-甲基-4-氧代-5,7-二氢吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]氨基甲酸rac-乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000491
制备自中间体A42。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/庚烷)以获得为白色固体的中间体A43(52％)以及为膏状固体的中间体A44(20％)。LCMS：A43：485[M+H]+；Rt：2.15min(方法3)；A44：413[M+H]+；Rt：0.98min(方法2)
根据实例A18中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A42
中间体A45：Ｎ-[3-(3-溴-6-甲基-4-硫基-5，7-二氢吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-N-乙氧羰基-氨基甲酸rac-乙酯以及中间体A46：N-[3-(3-溴-6-甲基-4-硫基-5，7-二氢吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]氨基甲酸rac-乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000501
制备自中间体A43以及A44。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为黄色固体的中间体A45(65％)以及为黄色固体的中间体A46(28％)。LCMS：A45：501[M+H]+；Rt：2.70min(方法3)；A46：429[M+H]+；Rt：2.53min(方法3)。根据实例A35中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A43
中间体A47：rac-[3-(4-氨基-3-溴-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-氨基甲酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000502
制备自中间体A45以及A46。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得就这样用于下一步骤的、为膏状固体的中间体A47。根据实例A22-方法B中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A44
中间体A48：rac-[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-氨基甲酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000511
制备自中间体A47。快速柱色谱法(硅胶；NH3于MeOH／DCM中的7M溶液)以获得为一种油的中间体A48(71％)。LCMS：322[M+H]+；Rt：0.63min(方法2)。
实例A45
中间体A49：6-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000512
在室温下，将中间体A48(300mg，0.905mmol)添加到HCl(6M于H2O中，17.1mL)的溶液中。将该混合物在110℃搅拌35小时，然后将溶剂在真空中去除并且用NaHCO3的饱和溶液处理且用AcOEt(3×10mL)萃取。分离有机层并在真空中蒸发。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗物料。收集所希望的部分以获得为一种透明油的中间体A49(160mg，68％)。LCMS：260[M+H]+；Rt：0.51min(方法3)。
根据实例A8中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A46
中间体A50：rac-4-(5-溴-2-氟-苯基)-4-二氟甲基-2-氧代-2λ*4*-[1，2,3]氧杂噻唑烷-3-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000521
制备自氨基甲酸、N-[1-(5-溴-2-氟苯基)-2,2-二氟-1-(羟甲基)乙基]-，1，1-二甲酯。获得为一种黄色油(粗物料，非对映异构体的混合物，100％)的中间体A50。
根据实例A9中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A47
中间体A51：rac-4-(5-溴-2-氟-苯基)-4-二氟甲基-2,2-二氧代-2λ*6*-[1，2,3]氧杂噻唑烷-3-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000522
制备自中间体A50。在庚烷中研磨，随后通过柱色谱法(硅胶；DCM)以获得为白色固体的中间体A51(78％)。LCMS：465[M+NH4]+；Rt：1.46min(方法2)。
实例A48
中间体A52：rac-1-(5-溴-2-氟-苯基)-2,2-二氟-1-(5-甲基-3-硝基-吡唑-1-基甲基)-乙胺的制备：
Figure BDA0000374925510000523
在室温下，向MeCN(150mL)中的中间体A51(6.8g，15.238mmol)与5-硝基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯(3.4g，18.365mmol)里添加DBU(5.1mL，34.103mmol)。将所得混合物在60℃搅拌18小时。然后在真空中蒸发溶剂并且在室温下向残余物中添加HCl(4M于二噁烷中，40mL)中。将所得溶液在室温下搅拌2小时，然后在真空中蒸发溶剂。向残余物中添加H2O以及饱和的Na2CO3，并且将该混合物用DCM萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；DCM于庚烷中50／50)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发，以获得为一种粘性泡沫的中间体A52(4.6g，67％)。LCMS：453[M+H]+；Rt：1.46min(方法2)。
实例A49
中间体A53：rac-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-2-硝基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000531
在一个密封管中，将DBU(4.126mL，27.6mmol)添加到中间体A52(4.15g，9.198mmol)在MeCN(45mL)中的搅拌混合物里。在微波辐射下，将该混合物在150℃搅拌30min。将该混合物用10％NH4Cl稀释并且用DCM萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；AcOEt)纯化该残余物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发，以获得中间体A54(2.48g，67％)。LCMS：405[M-H]-；Rt：1.10min(方法2)。
实例Ａ５０
中间体A54：rac-2-氨基-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000541
将中间体A53(2.4g，5.924mmol)溶解于MeOH(150mL)中。将该溶液用RuO2连接柱(50℃，满氢，1ml／min)进行氢化。在真空中蒸发溶剂并且将残余物通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为灰白色固体的中间体A54(2.1g，94％)。LCMS：377[M+H]+；Rt：0.74min(方法2)。
实例A51
中间体A55：rac-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000542
将中间体A54(1.8g，4.798mmol)、EtOH(36mL)以及H2SO4(0.767mL)的混合物加热到90℃。然后分批添加亚硝酸钠(828mg，11.995mmol)并且将该混合物在90℃搅拌20min。然后，将该混合物冷却至室温，倒入饱和Na2CO3与H2O中并用DCM萃取。分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为白色固体的中间体A55(1.25g，72％)。LCMS：403[M+MeCN+H]+；Rt：0.92min(方法2)。
根据实例A18中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A52
中间体A56：rac-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
制备自中间体A55。快速柱色谱法(硅胶；DCM)以获得为黄色固体的中间体A56(1.14g，88％)。LCMS：419[M+MeCN+H]+；Rt：1.19min(方法2)。
实例A53
中间体A57：rac-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000552
将中间体56(1.12g，2.977mmol)在7M NH3于MeOH(30mL)中的溶液在微波辐射下在120℃搅拌30分钟。在真空中蒸发溶剂并且将残余物用DCM进行处理并用稀释的Na2CO3溶液进行洗涤。分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7M溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为黄色固体的中间体A57(1.03g，96％)。LCMS：361[M+H]+；Rt：0.99min(方法2)。
根据实例A36-A37中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A54
中间体A58：rac-6-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-二氟甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000561
制备自中间体A54。快速柱色谱法(硅胶；7M NH3于MeOH／DCM中)以获得为一种灰白色泡沫的中间体A58(86％)。LCMS：296[M+H]+；Rt：0.61min(方法2)。
实例A55
中间体A59：1H-吡唑-3，5-二羧酸二酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000562
将二乙基吡唑-3，5-二羧酸酯(5.2g，24.5mmol)溶解于7M NH3于MeOH中，并且将该混合物在70℃于密封管中加热48小时。然后蒸发溶剂以给出为一种固体的中间体A59(3.74g，99％)。
实例A56
中间体A60：1H-吡唑-3，5-二腈的制备
Figure BDA0000374925510000563
在0℃，将三氯氧化磷(11.249mL，120.679mmol)添加到中间体59(3.72g，24.136mmol)在MeCN(90mL)中的混合物里。在120℃，于密封管中将该混合物搅拌5小时(直到固体消失)。将该反应倾倒入冰／H2O的混合物中并且用DCM萃取。将有机层分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且在真空中蒸发溶剂以给出为一种固体的中间体A60，将其不进一步纯化而用于下一步骤中。LCMS：117[M-H]-；Rt：0.61min(方法2)。
根据实例A7-A12中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A57
中间体A61：(R)-[1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(3，5-二氰基-吡唑-1-基)-1-甲基-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
Figure BDA0000374925510000571
制备自中间体A31。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/DCM)以获得为一种泡沫的中间体A61(60％)。LCMS：467[M+NH4]+；Rt：1.57min(方法2)。
实例A58
中间体A62：(R)-4-氨基-6-(5-溴-2-氟苯基)-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-2-腈的制备
Figure BDA0000374925510000572
在室温，向中间体A61(4.483g，8.4mmol)在DCM(40mL)中的搅拌混合物里添加三氟乙酸(4mL)。将该混合物在室温下搅拌20小时，然后用饱和的Na2CO3溶液进行碱化并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；7N NH3于MeOH／DCM中)纯化该残余物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以给出中间体A62(2.9g，99％)。LCMS：349[M+H]+；Rt：1.13min(方法2)。
实例A59
中间体A63：(R)-4-氨基-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-2-腈的制备
Figure BDA0000374925510000581
该反应分两个相等批次进行。报导了所使用物质的总量。将CuI(342mg，1.795mmol)添加到中间体A62(500mg，1.436mmol)、叠氮化钠(284mg，4.308mmol)、N,N’-二甲基乙二胺(255μL，2.369mmol)以及Na2CO3(457mg，4.308mmol)在MeCN(10mL)中的悬浮液里并且对该反应进行除气。将该混合物在110℃加热4小时，然后在120℃额外加热2小时。然后将该混合物用1M HCl进行淬灭并且将水层用NH4OH进行碱化并且用AcOEt(3x)进行萃取。分离这些合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH／DCM中的7N溶液)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得中间体A63(300mg，65％)。LCMS：285[M+H]+；Rt：0.74min(方法2)。
根据实例A7-A9、A11、A13以及A15中描述的合成程序制备以下中间体：
实例A60
中间体A64：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯的制备
Figure BDA0000374925510000582
制备自二乙基吡唑-3，5-二羧酸酯。在随后的反应中，中间体A64用作一种粗品白色固体。
实例A61
中间体A65：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-2-羟甲基-6-甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000591
在0℃，将硼氢化钠(3.094g，81.774mmol)添加到中间体64(3.6g，9.086mmol)在THF(10mL)与MeOH(5mL)中的搅拌溶液里。将该混合物在室温下搅拌18小时。将该混合物冷却至0℃，用H2O进行处理并且用DCM萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的中间体A65(3.2g，99％)。
实例A62
中间体A66：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-6-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-2-甲醛的制备
Figure BDA0000374925510000592
将二氧化锰(7g，80.5mmol)添加到中间体A65(3.2g，9.035mmol)在氯仿(48mL)中的溶液里。将反应混合物在62℃搅拌4小时。将该混合物用硅藻土过滤并且用DCM进行洗涤。浓缩有机层以获得为一种淡橙色蓬松固体的中间体A66(2.3g，72％)。
实例A63
中间体A67：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-2-二氟甲基-6-甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-酮的制备
Figure BDA0000374925510000601
将中间体A66(2.3g，6.531mmol)在DCM(50ml)以及DAST(2.193mL，16.328mmol)在DCM(50ml)中的溶液泵送通过floW chemistryVapourtec R2+R4模块化装置，盘管10mL，在80℃下，Rt=15min。用CaCO3收集排出液。将该溶液用硅藻土过滤并且用DCM洗涤，将该有机层用NaHCO3的饱和溶液洗涤并且用DCM萃取。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以获得为棕色油的中间体A67(2.2g，90％)。
实例A64
中间体A68：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-2-二氟甲基-6-甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
Figure BDA0000374925510000602
将五硫化二磷(1.871g，8.419mmol)添加到中间体A67(2.1g，5.613mmol)在二噁烷(1mL)中的溶液里并且将该混合物在100℃加热18小时。将该混合物在真空中浓缩并且通过快速柱色谱法(硅胶；DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为黄色油的中间体A68(2g，91％)。LCMS：392[M+H]+；Rt：1.29min(方法2)。
实例A65
中间体A69：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-2-二氟甲基-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000611
该反应分两个相等批次进行。报导了所使用物质的总量。将NH3(2M于EtOH中，30mL，60mmol)添加到中间体A69(2g，5.125mmol)以及NH4Cl(2.173g，41mmol)中。将该混合物在微波辐射下于170℃加热45min。将该混合物浓缩，并且添加另外30mL的NH3(2M于EtOH中)。将该混合物在微波辐射下于170℃加热45min。将该程序重复4次以持续180min的时间总量。过滤该混合物并且将滤液在真空中浓缩。通过柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗品。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为一种油的中间体A69(1g，52％)。LCMS：375[M+H]+；Rt：1.11min(方法2)。
根据类似于实例A59中描述的那个的合成程序制备以下中间体：
实例A66
中间体A70：(R)-6-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-二氟甲基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000612
制备自中间体A69。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)以获得为一种油的中间体A70(51％)。LCMS：310[M+H]+；Rt：0.69min(方法2)。
根据实例类似于A7-A11、A48、A15以及A18中描述的一个合成程序制备以下中间体：
实例A67
中间体A71：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-3-氟-2,6-二甲基-6,7-二氢-5H-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-硫酮的制备
Figure BDA0000374925510000621
制备自4-氟-5-甲基-1H-吡唑-3-羧酸乙酯。快速柱色谱法(硅胶；AcOEt/DCM)以获得为黄色固体的中间体A71(92％)。LCMS：374[M+H]+；Rt：1.27min(方法2)。
实例A68
中间体A72：(R)-6-(5-溴-2-氟-苯基)-3-氟-2,6-二甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000622
将NH3(2M于EtOH中，10eq)添加到中间体A71(2.4g，6.448mmol)与NH4Cl(4eq.)的溶液里并且将该混合物在85℃于密封管中加热24小时。在真空中蒸发溶剂并且将残余物悬浮于DCM中并用H2O洗涤。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。向该残余物中添加更多的NH4Cl(4eq)，随后添加NH3(2M于EtOH中，10eq)并且将该混合物在85℃于密封管中加热24小时。将该过程再重复四次，以达到276mL的NH3(2M于EtOH中)以及8.277g的NH4Cl的总量。然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得为淡黄色固体的中间体A72(960mg，42％)。LCMS：357[M+H]+；Rt：1.11min(方法2)。
根据类似于实例A36-A37中描述的一个合成程序制备以下中间体：
实例A69
中间体A73：(R)-6-(5-氨基-2-氟-苯基)-3-氟-2，6-二甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000631
制备自中间体A72。快速柱色谱法(硅胶；于MeOH／DCM中的7NNH3)以获得为淡黄色固体的中间体A73(42％)。
根据实例类似于A7-A9、A48、A23、A16B、A18、A21、A36、A37中描述的一个合成程序制备以下中间体：
实例A70
中间体A74：(R)-6-(5-氨基-2-氟-苯基)-3-氯-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺的制备
Figure BDA0000374925510000632
制备自中间体A31。快速柱色谱法(硅胶；MeOH／DCM)，随后通过在DIPE／Et2O中研磨，以获得为黄色固体的中间体A74(94％)。LCMS：294[M+H]+；Rt：1.13min(方法3)。
最终化合物的制备
实例B1
化合物1：(R)-6-[3-(5-氯-吡啶-3-基)-苯基]-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-4-基胺三氟乙酸盐的制备
Figure BDA0000374925510000641
在密封管中，将32％水性NH3溶液(0.5mL)添加到中间体A18(60mg，0.17mmol)在NH3于MeOH(1.5mL)中的7M溶液里的搅拌混合物中。将该混合物在100℃搅拌5小时。冷却至室温后，将这些溶剂在真空中蒸发。通过短柱层析法(硅胶；MeOH／DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以给出通过反相HPLC(梯度从H2O中的80％0.1％TFA溶液、20％CH3CN至H2O中的0％0.1％TFA溶液、100％CH3CN)进一步纯化的部分并用DIPE进行研磨以获得为一种白色固体的化合物1(36mg，46％产率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.79(s，3H)，4.69(d，J=13.6Hz，1H)，5.25(d，J=13.9Hz，1H)，7.23(d，J=2.3Hz，1H)，7.45(br.d，J=8.7Hz，1H)，7.52(t，J=7.8Hz，1H)，7.69(d，J=2.0Hz，1H)，7.75(br.d，J=7.8Hz，1H)，7.94-7.96(m，1H)，8.28(t，J=2.2Hz，1H)，8.66(d，J=2.3Hz，1H)，8.88(d，J=2.0Hz，1H)，9.28(br.s，1H)，9.87(br.s，1H)，11.06(br.s，1H)。
实例B2
化合物2：rac-5-氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺的制备
将5-氯-吡啶-2-羧酸(71.8mg，0.68mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(137mg，0.5mmol)在MeOH(4mL)中的溶液里。
将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A22(100mg，0.41mmol)在MeOH(3mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌3小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O进行研磨并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂且将所得部分通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行进一步纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的化合物2(21mg，13％产率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm1.67(s，3H)，4.38(d，J＝13.3Hz，1H)，4.53(d，J＝13.3Hz，1H)，4.79(br.s，2H)，6.72(br.s，1H)，7.24(br.d，J＝7.8Hz，1H)，7.34(t，J＝7.9Hz，1H)，7.51(d，J＝2.0Hz，1H)，7.73(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，7.85-7.90(m，2H)，8.23(d，J＝8.4Hz，1H)，8.55(d，J＝2.0Hz，1H)，9.86(br.s，1H)。
实例B3
化合物3：rac-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000651
将3,5-二氯-吡啶-2-羧酸(112mg，0.58mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(176.2mg，0.64mmol)在MeOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A22(128mg，0.53mmol)在MeOH(5mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌3小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O进行研磨并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为白色固体的化合物3(180mg，82％产率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.41(s，3H)，4.12-4.45(m，2H)，6.54(br.s.，2H)，6.64(d，J＝2.0Hz，1H)，7.25-7.32(m，2H)，7.45(d，J＝2.0Hz，1H)，7.63(m，J＝6.3，2.5，2.5Hz，1H)，7.82(br.s，1H)，8.43(d，J＝2.0Hz，1H)，8.72(d，J＝2.0Hz，1H)，10.64(br.s.，1H)。
实例B4
化合物4：(R*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺以及化合物5：(S*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000661
将化合物3(0.58g)的样品用冷DCM并且然后用Et2O进行洗涤。然后将该外消旋化合物通过Chiralpak AD-H5μm(250x20mm)上的制备型SFC、流动相(0.3％iPrNH2，60％CO2，40％EtOH)分离为对应的对映异构体。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得两者都为白色固体的化合物4(152mg，26％产率)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.41(s，3H)，4.28(br.s，2H)，6.41(br.s.，2H)，6.64(d，J＝1.4Hz，1H)，7.30(s，2H)，7.45(d，J＝2.0Hz，1H)，7.60-7.67(m，1H)，7.83(s，1H)，8.44(d，J＝2.0Hz，1H)，8.73(d，J＝2.3Hz，1H)，10.65(br.s.，1H)以及化合物5(155mg，27％产率)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.41(s，3H)，4.28(s，2H)，6.41(br.s.，2H)，6.64(d，J＝0.9Hz，1H)，7.26-7.33(m，2H)，7.45(d，J＝1.4Hz，1H)，7.59-7.69(m，1H)，7.84(s，1H)，8.44(d，J＝2.0Hz，1H)，8.73(d，J＝2.0Hz，1H)，10.65(br.s.，1H)。
实例B5
化合物6：rac-5-氰基-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺以及化合物7：(R*)-5-氰基-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺以及化合物8：(S*)-5-氰基-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺的制备
将5-氰基-吡啶-2-羧酸(187.8mg，1.27mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(412.9mg，1.49mmol)在MeOH(20mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A22(300mg，1.24mmol)在MeOH(10mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌4小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O研磨并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；NH3在MeOH/DCM中的7M溶液)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用EtOH和Et2O进行洗涤并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得为膏状固体的化合物6(122mg，26％产率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.42(s，3H)，4.31(m，J＝3.5Hz，2H)，6.66(br.s，2H)，6.66(d，J＝1.7Hz，1H)，7.26-7.33(m，2H)，7.45(d，J＝2.0Hz，1H)，7.78(dt，J＝6.9，1.9Hz，1H)，8.01-8.06(m，1H)，8.29(dd，J＝8.1，0.6Hz，1H)，8.59(dd，J＝8.1，2.0Hz，1H)，9.18-9.22(m，1H)，10.68(s，1H)。然后将该外消旋化合物通过Chiralpak AD-H5μm(250x20mm)上的制备型SFC、流动相(0.3％iPrNH2，60％CO2，40％EtOH)进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得两者都为白色固体的化合物7(45.8mg，10％产率)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.41(s，3H)，4.21-4.35(m，2H)，6.39(br.s.，2H)，6.64(br.s，1H)，7.26-7.35(m，2H)，7.45(d，J＝1.2Hz，1H)，7.78(br.d，J＝7.2Hz，1H)，8.05(br.s，1H)，8.30(d，J＝8.1Hz，1H)，8.60(dd，J＝8.1，2.0Hz，1H)，9.20-9.22(m，1H)，10.68(s，1H)以及化合物8(46.5mg，10％产率)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.41(s，3H)，4.29(br.s.，2H)，6.41(br.s.，2H)，6.64(d，J＝1.7Hz，1H)，7.27-7.34(m，2H)，7.45(d，J＝1.7Hz，1H)，7.77-7.80(m，1H)，8.05(br.s，1H)，8.30(dd，J＝8.2，0.7Hz，1H)，8.60(dd，J＝8.1，2.0Hz，1H)，9.19-9.24(m，1H)，10.68(s，1H)。
实例B6
化合物9：rac-5-氰基-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-3-溴-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺三氟乙酸盐的制备
Figure BDA0000374925510000681
将5-氰基-吡啶-2-羧酸(23.6mg，0.16mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(51.9mg，0.19mmol)在MeOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A20(50mg，0.16mmol)在MeOH(5mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌4小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O进行研磨并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，且将该残余物通过制备型HPLC(RP C18XSelect19x1005um)、流动相(梯度从H2O中的80％0.1％TFA溶液、20％CH3CN至H2O中的0％0.1％TFA溶液、100％CH3CN)进行纯化以获得为一种白色固体的化合物9(9.8mg，11％产率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.75(s，3H)，4.74(d，J＝13.9Hz，1H)，5.09(d，J＝13.6Hz，1H)，7.19-7.24(m，1H)，7.40(t，J＝8.1Hz，1H)，7.87(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，7.88(s，1H)，8.00(br.s，1H)，8.29(dd，J＝8.1，0.6Hz，1H)，8.60(dd，J＝8.4，2.0Hz，1H)，8.78(br.s.，1H)，9.21(dd，J＝2.0，0.9Hz，1H)，9.70(br.s.，1H)，10.89(s，1H)，11.23(br.s.，1H)。
实例B7
化合物10：rac-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺以及化合物11：(R*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺以及化合物12：(S*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-2-三氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000691
将3，5-二氯-吡啶羧酸(70mg，0.366mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(119mg，0.431mmol)在MeOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A28(111mg，0.359mmol)在MeOH(5mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌4小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O研磨、声处理、过滤并在真空中于50℃干燥，以获得为白色固体的化合物10(95mg，55％产率)。然后将该外消旋化合物通过Chiralpak AD-H5μm(250x20mm)上的制备型SFC、流动相(0.3％iPrNH2，70％CO2，30％iPrOH)进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得化合物11(40mg，23％产率)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm1.42(s，3H)，4.35-4.47(m，2H)，6.61(br.s.，2H)，7.09(br.s，1H)，7.26-7.35(m，2H)，7.59-7.67(m，1H)，7.83(br.s，1H)，8.43(d，J＝2.1Hz，1H)，8.72(d，J＝2.1Hz，1H)，10.67(s，1H)以及化合物12(38mg，22％产率)，它的1H NMR与化合物11的一致。
实例B8
化合物13：(R)-5-甲氧基-吡嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-3-氟-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000701
将5-甲氧基吡嗪-2-羧酸(120mg，0.78mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(233mg，0.841mmol)在MeOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A39(212mg，0.764mmol)在MeOH(5mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌4小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O进行研磨并且然后通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得一种白色固体。将该固体用DIPE进行处理以获得为白色固体的化合物13(155mg，49％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm1.59(s，3H)，4.06(s，3H)，4.28(br.d，J＝13.0Hz，1H)，4.51(br.d，J＝13.0Hz，1H)，5.04(br.s.，2H)，7.09(dd，J＝11.6，9.0Hz，1H)，7.36(d，J＝4.0Hz，1H)，7.84-7.97(m，2H)，8.12(d，J＝1.2Hz，1H)，8.99(d，J＝1.2Hz，1H)，9.51(br.s，1H)。
实例B9
化合物14：rac-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物15：(R*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物16：(S*)-3，5-二氯-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000711
将3，5-二氯-吡啶羧酸(75.5mg，0.393mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(128mg，0.463mmol)在MeOH(5mL)中的溶液里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A49(100mg，0.386mmol)在MeOH(5mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌4小时。将该混合物用Na2CO3和H2O的饱和溶液进行处理并且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将该粗产物用Et2O研磨、声处理、过滤并在真空中于50℃干燥。将所得的化合物通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)再进行一次纯化，从而在用AcOEt以及DIPE处理之后，获得为白色固体的化合物14(95mg，57％产率)。然后将该外消旋化合物通过Chiralcel OJ-H5μm(250x20mm)上的制备型SFC、流动相(0.3％iPrNH2，85％CO2，15％EtOH)进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得化合物15(38mg，23％产率)1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm1.58(s，3H)，2.52(br.s.，2H)，4.41(br.d，J＝13.2Hz，1H)，4.62(dd，J＝13.2，0.9Hz，1H)，6.43(d，J＝2.1Hz，1H)，7.08(dd，J＝11.7，8.9Hz，1H)，7.52(d，J＝2.1Hz，1H)，7.81(dd，J＝6.9，2.8Hz，1H)，7.89(d，J＝2.1Hz，1H)，7.94(ddd，J＝8.8，4.1，3.0Hz，1H)，8.42(d，J＝2.1Hz，1H)，9.71(br.s.，1H)以及化合物16(40mg，24％产率)，它的1H NMR与化合物15的一致。
实例B10
化合物17：rac-5-甲氧基-哌嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物18：(R*)-5-甲氧基-哌嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物19：(S*)-5-甲氧基-哌嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6,7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000721
将5-甲氧基吡嗪-2-羧酸(187.9mg，1.219mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(337mg，1.219mmol)在MeOH(6mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃C并且添加中间体A58(300mg，1.016mmol)在MeOH(4mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌1小时，然后用Na2CO3与H2O的饱和溶液进行处理且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。用DCM沉淀部分产物并且将该残余的粗物料通过快速柱色谱法(硅胶；在MeOH/DCM中的7M NH3)进行纯化。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将所得的产物与获得自沉淀且用庚烷研磨的产物进行合并、声处理并过滤，以获得为一种白色固体的化合物17(278mg，62％产率)。然后将该外消旋化合物通过Chiralcel OD-H5μm(250x20mm)上的制备型SFC、流动相(0.3％iPrNH2，70％CO2，30％EtOH)进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得化合物18(103mg，23％产率)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm4.03(s，3H)4.58(br.d，J＝13.6Hz，1H)4.75(br.d，J＝13.6Hz，1H)6.27(t，J＝55.5Hz，1H)6.68(d，J＝2.0Hz，1H)6.93(br.s，2H)7.20(dd，J＝11.8，9.0Hz，1H)7.48(d，J＝2.0Hz，1H)7.78(dt，J=8.4，3.6Hz，1H)8.17(dd，J=7.1，2.7Hz，1H)8.42(d，J=1.2Hz，1H)8.88(d，J=1.2Hz，1H)10.51(s，1H)以及化合物19(102mg，23％产率)，它的1H NMR与化合物18的一致。
实例B11
化合物20：rac-5-氟-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物21：(S*)-5-氟-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺以及化合物22：(R*)-5-氟-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-6-二氟甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000731
将5-氟-2-吡啶羧酸(74.5mg，0.528mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(146mg，0.528mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌5min。然后将该混合物冷却至0℃并且添加中间体A58(130mg，0.44mmol)在MeOH(2mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌1小时，然后用Na2CO3与H2O的饱和溶液进行处理且用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；在MeOH/DCM中的7M NH3)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将所得产物用庚烷进行研磨，声处理并过滤，以获得为一种白色固体的化合物17(112mg，60％产率)。然后将该外消旋化合物通过Chiralpak AD-H管柱(5μm，250x20mm)上的制备型SFC、流动相(70％CO2，30％EtOH(+0.3％iPrNH2)进一步纯化。针对每一种对映异构体收集所希望的部分并且在真空中浓缩，以获得其1H NMR与化合物22的一致的、化合物A21(41mg，22％产率)以及化合物22(43mg，23％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm4.53-4.61(m，1H)，4.74(br.d，J=13.4Hz，1H)，6.26(t，J=55.9Hz，1H)，6.67(d，J＝1.8Hz，1H)，6.93(br.s，2H)，7.20(dd，J＝12.0，9.0Hz，1H)，7.47(d，J＝1.8Hz，1H)，7.79(ddd，J＝8.8，3.9，2.8Hz，1H)，7.98(td，J＝8.7，2.9Hz，1H)，8.16(dd，J＝7.1，2.7Hz，1H)，8.21(dd，J＝8.8，4.6Hz，1H)，8.73(d，J＝2.8Hz，1H)，10.62(br.s，1H)。
实例B12
化合物23：(R)-5-甲氧基-吡嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-2-氰基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000741
将5-甲氧基吡嗪-2-羧酸(95.4mg，0.619mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(171.3mg，0.619mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌30min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A63(160mg，0.563mmol)在MeOH(3mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌20小时，然后用Na2CO3的饱和溶液进行处理且搅拌几分钟。然后将该混合物用DCM进行处理。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，干燥后获得为一种固体的化合物23(115mg，49％产率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm1.58(s，3H)，1.66(br.s.，2H)，4.07(s，3H)，4.47(br.d，J=13.6Hz，1H)，4.66(br.d，J＝13.3Hz，1H)，6.81(br.s，1H)，7.09(dd，J＝11.6，9.0Hz，1H)，7.75-7.81(m，1H)，7.97(dd，J=7.1，2.7Hz，1H)，8.14(s，1H)，9.00(s，1H)，9.49(br.s.，1H)。
实例B13
化合物24：(R)-5-氟-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-2-氰基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000751
将5-氟-2-吡啶羧酸(87.4mg，0.619mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(171.3mg，0.619nnol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌30min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A63(160mg，0.563mmol)在MeOH(3mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌20小时，然后用Na2CO3的饱和溶液进行处理且搅拌几分钟。然后将该混合物用DCM进行处理。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得用DIPE研磨的一种油。将所得的固体过滤并干燥以给出为一种固体的化合物24(95mg，41％产率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm1.58(br.s，3H)4.46(br.d，J＝13.4Hz，1H)4.66(d，J＝13.4Hz，1H)4.90(br.s.，2H)6.81(s，1H)7.10(dd，J=11.8，8.8Hz，1H)7.60(td，J=8.3，2.8Hz，1H)7.78-7.86(m，1H)7.96(dd，J=7.1，2.7Hz，1H)8.32(dd，J=8.7，4.5Hz，1H)8.45(d，J=2.8Hz，1H)9.80(br.s，1H)。
实例B14
化合物25：(R)-1-二氟甲基-1H-吡唑-4-羧酸[3-(4-氨基-2-氰基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000752
将1-二氟甲基-1H-吡唑-3-羧酸(82.7mg，0.51mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(155mg，0.561mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌30min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A63(145mg，0.51mmol)在MeOH(3mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌3小时，然后用Na2CO3的饱和溶液进行处理且搅拌几分钟。然后将该混合物用DCM进行处理。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得用庚烷研磨的一种油。将所得的固体过滤并干燥以给出为一种固体的化合物25(100mg，46％产率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm1.58(s，3H)4.47(br.d，J=13.3Hz，1H)4.65(d，J=13.3Hz，1H)4.94(br.s.，2H)6.81(s，1H)7.05(d，J=2.6Hz，1H)7.09(dd，J=11.6，9.0Hz，1H)7.20(t，J=60.4Hz，1H)7.69-7.75(m，1H)7.88(d，J=2.6Hz，1H)7.91(dd，J=6.8，2.2Hz，1H)8.62(br.s，1H)。
实例B15
化合物26：(R)-5-氰基-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-2-氰基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000761
将5-氰基-2-吡啶羧酸(79.7mg，0.538mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(163.8mg，0.592mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌30min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A63(153mg，0.538mmol)在MeOH(3mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌3小时，然后用Na2CO3的饱和溶液进行处理且搅拌几分钟。然后将该混合物用DCM进行处理。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得用庚烷研磨的一种油。将所得的固体过滤并干燥以给出为一种固体的化合物26(63mg，28％产率)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.47(br.s，3H)4.43-4.55(m，2H)6.76(br.s.，2H)7.20(dd，J=11.8，9.0Hz，1H)7.27(br.s，1H)7.71-7.79(m，1H)8.10(br.d，J＝5.2Hz，1H)8.26(d，J＝8.1Hz，1H)8.57(dd，J=8.2，1.6Hz，1H)9.18(br.s，1H)10.81(br.s，1H)。
实例B16
化合物27：(R)-5-氟-吡啶-2-羧酸[3-(4-氨基-2-二氟甲基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000771
将5-氟-2-吡啶羧酸(68mg，0.485mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(148mg，0.533mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌5min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A70(150mg，0.485mmol)在MeOH(2mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌4小时，然后在冷浴中于真空中进行浓缩。通过快速柱色谱法(干负载，硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得一种灰白色固体，将该固体通过C18Sunfire(30x1005um)上的RP HPLC，流动相：梯度从H2O中的80％0.1％TFA溶液、20％CH3CN至H2O中的0％0.1％TFA溶液、100％CH3CN进一步纯化，从而获得为一种白色固体的化合物27(57mg，33％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.84(br.s，3H)，4.79(br.d，J＝13.9Hz，1H)，5.02(br.d，J＝13.3Hz，1H)，7.10(t，J＝54.3Hz，1H)，7.30(dd，J=12.0，8.8Hz，1H)，7.46(br.s.，1H)，7.86-7.91(m，1H)，7.93(dd，J=7.5，2.3Hz，1H)，7.98(td，J=8.7，2.9Hz，1H)，8.20(dd，J=8.7，4.6Hz，1H)，8.73(d，J＝2.9Hz，1H)，9.33(br.s.，1H)，10.07(br.s.，1H)，10.80(br.s，1H)，11.09(br.s.，1H)。
实例B17
化合物28：(R)-5-甲氧基-吡嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-2-二氟甲基-6-甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000781
将5-甲氧基吡嗪-2-羧酸(75mg，0.485mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(148mg，0.533mmol)在MeOH(3mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌5min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A70(150mg，0.485mmol)在MeOH(2mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并且搅拌4小时，然后在冷浴中于真空中进行浓缩。通过快速柱色谱法(干负载，硅胶；MeOH/DCM)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂，以获得一种灰白色固体，将该固体通过C18Sunfire(30x1005um)上的RP HPLC，流动相：梯度从H2O中的80％0.1％TFA溶液、20％CH3CN至H2O中的0％0.1％TFA溶液、100％CH3CN进一步纯化，从而获得为一种白色固体的化合物27(32mg，12％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.85(br.s.，3H)4.03(s，3H)4.80(br.d，J＝13.9Hz，1H)5.03(br.d，J＝12.7Hz，1H)7.12(t，J＝54.3Hz，1H)7.31(dd，J=11.8，9.0Hz，1H)7.47(br.s.，1H)7.84-7.90(m，1H)7.96(dd，J=7.4，2.2Hz，1H)8.42(d，J＝1.4Hz，1H)8.88(d，J＝1.4Hz，1H)9.32(br.s.，1H)10.09(br.s.，1H)10.70(s，1H)11.08(br.s.，1H)。
实例B18
化合物29：(R)-5-甲氧基-吡嗪-2-羧酸[3-(4-氨基-3-氟-2，6-二甲基-6，7-二氢-吡唑[1，5-a]吡嗪-6-基)-4-氟-苯基]-酰胺的制备
Figure BDA0000374925510000791
将5-甲氧基吡嗪-2-羧酸(97mg，0.631mmol)添加到4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(175mg，0.631mmol)在MeOH(2mL)中的混合物里。将该混合物在室温下搅拌5min，然后将其冷却至0℃并且添加中间体A73(175mg，0.601mmol)在MeOH(2mL)中的溶液。将该混合物加热至室温并搅拌24小时。将溶剂在真空中去除并且将残余物悬浮于DCM中并用饱和Na2CO3进行处理。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶；在MeOH/DCM中的7MNH3)纯化该粗产物。收集所希望的部分并且在真空中蒸发溶剂。将残余物悬浮于Et2O中。将沉淀过滤出并在真空下于50℃进行干燥以获得为白色固体的化合物29(195mg，76％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm1.45(br.s，3H)，2.12(s，3H)，4.02(s，3H)，4.18(br.d，J＝13.0Hz，1H)，4.24(br.d，J＝12.4Hz，1H)，6.26(br.s.，2H)，7.17(dd，J=12.0，8.8Hz，1H)，7.68-7.77(m，1H)，8.04(br.d，J＝5.2Hz，1H)，8.40(d，J＝1.2Hz，1H)，8.87(d，J＝1.2Hz，1H)，10.46(br.s，1H)。
表1
Figure BDA0000374925510000793
Figure BDA0000374925510000801
Figure BDA0000374925510000821
C.分析部分
核磁共振(NMR)
将1H NMR光谱记录在具有标准脉冲序列的Bruker DPX-400亦或在Bruker AV-500光谱仪上，各自在400MHz和500MHz处操作。化学移位(δ)报告为来自四甲基硅烷(TMS)的低磁场百万分率(ppm)，TMS用作内标准。
LCMS-方法
对于本发明化合物的(LC)MS-表征，使用以下方法。
用于Acquity-SQD仪的通用程序A
使用Acquity UPLC(沃特斯公司(Waters))系统进行UPLC(超高效液相色谱)测量，该系统包括一个组织体取样器(sampler organizer)、一个二元泵(该泵具有除气器)、一个四柱温箱、一个二极管-阵列检测器(DAD)以及一个如在以下对应的方法中详细说明的管柱。该MS检测器被配置为具有一个电喷射离子化作用源。通过使用0.08秒的通道间延迟，在0.1秒内从100至1000进行扫描，在一个单相四极SQD检测器上获取质谱。毛细管针电压是3.0kV。对于阳极离子化模式而言，锥孔电压是25V并且对于阴极离子化模式而言，锥孔电压是30V。将氮气用作雾化气体。源温度维持在140℃。使用MassLynx-Openlynx软件进行数据采集。
方法1：
除通用程序A之外：在来自沃特斯的一个BEH-C18管柱(1.7μm，2.1x50mm)上，在50℃不与MS检测器分离，使用1.0ml/min的流速进行反相UPLC。所使用的梯度条件是：95％A(0.5g/l乙酸铵溶液+5％乙腈)、5％B(乙腈)，3.8分钟后至40％A、60％B中，4.6分钟后至5％A、95％B中，保持至5分钟。注射体积2.0μl。
方法2：
除通用程序A之外：在来自安捷伦公司(Agilent)的一个RRHD EclipsePlus-C18(1.8μm，2.1x50mm)上，在50℃不与MS检测器分离，使用1.0ml/min的流速进行反相UPLC。所使用的梯度条件是：95％A(0.5g/l乙酸铵溶液+5％乙腈)、5％B(乙腈)，1.2分钟后至40％A、60％B中，1.8分钟后至5％A、95％B中，保持至2.0分钟。注射体积2.0μl。
方法3：
与方法1相同的梯度；使用的管柱：来自安捷伦公司的RRHD EclipsePlus-C18(1.8μm，2.1x50mm)。
用于HP1100-MS仪(TOF、SQD或MSD)的通用程序B
使用HP1100(安捷伦科技有限公司(Agilent))系统进行HPLC测量，该系统包括一个泵(二元或四元)，该泵具有除气器、一个自动进样器、一个柱温箱、一个二极管-阵列检测器(DAD)以及一个如在以下对应的方法中详细说明的管柱。该MS检测器(SQD、TOF或MSD)被配置为具有一个电喷射离子化作用源亦或一个ESCI双离子化作用源(与大气压化学电离组合的电喷射)。将氮气用作雾化气体。源温度维持在140℃亦或100℃。使用MassLynx-Openlynx软件或Chemsation-Agilent Data Browser软件进行数据采集。
B1：通过在0.99秒内从100至1000进行扫描，步长0.30并且峰宽0.10分钟，在处于APCI模式的一个单相四极MSD检测器上获取质谱。毛细管针电压是3.0Kv，对于阳和阴极离子化模式，破碎电压是70V并且电晕强度是4μA。
B2：通过使用0.08秒的通道间延迟，在0.1秒内从100至1000进行扫描，在一个单相四极SQD检测器上获取质谱。毛细管针电压是3.0kV。对于阳极离子化模式而言，锥孔电压是20V并且对于阴极离子化模式而言，锥孔电压是30V。
B3：通过使用0.3秒的保压时间，在0.5秒内从100至750进行扫描，在一个Time of Flight(TOF)检测器上获取质谱。对于阳极离子化模式而言，毛细管针电压是2.5kV并且对于阴极离子化模式而言，毛细管针电压是2.9kV。对于阳极和阴极离子化模式而言，锥孔电压都是20V。亮氨酸-脑啡肽是用于锁定质量标度的标准物质。
方法4：
除通用程序B1之外：在60℃，在来自安捷伦公司的一个Eclipse Plus-C18管柱(3.5μm，2.1x30mm)上，使用1.0ml/min的流速进行反相HPLC。所使用的梯度条件是：95％A(于H20/ACN95/5中的6.5mMNH4AcO)、5％B(ACN)，保持0.2分钟，3.0分钟后至100％B中，保持至3.15分钟并且在3.3分钟处平衡至初始条件直到5.0分钟。注射体积2μl。
方法5：
除通用程序B2之外：在60℃，在来自安捷伦公司的一个Eclipse Plus-C18管柱(3.5μm，2.1x30mm)上，使用1.0ml/min的流速进行反相HPLC。所使用的梯度条件是：95％A(于H2O/ACN95/5中的6.5mMNH4AcO)、5％B(ACN/MeOH1/1)，5.0分钟后至100％B中，保持至5.15分钟并且在5.30分钟处平衡至初始条件直到7.0分钟。注射体积2μl。
方法6：
除通用程序B3之外：在60℃，在来自安捷伦公司的一个Eclipse Plus-C18管柱(3.5μm，2.1x30mm)上，使用1.0ml/min的流速进行反相HPLC。所使用的梯度条件是：95％A(于H2O/ACN95/5中的6.5mMNH4AcO)、5％B(ACN)，保持0.2分钟，3.0分钟后至100％B中，保持至3.15分钟并且在3.3分钟处平衡至初始条件直到5.0分钟。注射体积2μl。
通用程序C
使用Agilent1100模块进行HPLC测量，该模块包括一个泵、一个二极管-阵列检测器(DAD)(使用的波长是220nm)、一个管柱加热器以及一个如在以下对应的方法中详细说明的管柱。来自该管柱的流量被分到AgilentMSD系列G1946C与G1956A中。MS检测器被配置为具有API-ES(大气压电喷射离子化作用)。通过从100到1000进行扫描来获取质谱。对于阳极离子化模式而言，毛细管针电压是2500V并且对于阴极离子化模式而言，毛细管针电压是3000V。破碎电压是50V。在10l/min的流速下，干燥气体温度保持在350℃。
方法7：
除通用程序C之外：在一个YMC-Pack ODS-AQ、50x2.0mm5μm管柱上，使用0.8ml/min的流速进行反相HPLC。使用两个流动相(流动相A：具有0.1％TFA的H2O；流动相B：具有0.05％TFA的ACN)。首先，将100％A保持1分钟。然后4分钟后将梯度应用为40％A与60％B并且保持2.5分钟。典型地，使用2μl的一个注射体积。炉温度是50℃(MS极性：阳性)。
方法8：
除通用程序C之外：在一个Ultimate XB-C18、50x2.1mm5μm管柱上，使用0.8ml/min的流速进行反相HPLC。使用两个流动相(流动相C：10mmol/L NH4HCO3；流动相D：ACN)。首先，将100％C保持1分钟。然后4分钟后将梯度应用为40％C与60％D并且保持2.5分钟。典型地，使用2μl的一个注射体积。炉温度是50℃(MS极性：阳性)。
通用程序D
使用Shimadzu2010LCMS-系统进行UHPLC测量，该系统包括一个泵、一个光子二极管阵列检测器(PDA)(使用的波长是220nm)、一个柱温箱以及一个如在以下对应的方法中详细说明的管柱。来自该管柱的流量被分到Shimadzu2010MSD检测器。MS检测器被配置为具有API-ES(大气压电喷射离子化作用)。通过从100到1000进行扫描来获取质谱。用于阳极离子化模式的接口电压是4500V。雾化气流是1.5l/min。CDL(具有加热毛细管的曲型脱溶剂线)温度是250℃并且CDL电压是30V。热块(heatblock)温度是200℃。检测器电压是1500V。
方法9
除通用程序D之外：在一个Xtimate C18(30×2.1mm3.0μm)管柱上，使用1.2mL/min的流速进行反相UHPLC。使用两个流动相(A：具有0.15％TFA的H2O；B：具有0.75％TFA的ACN)。首先，将100％A保持1min。然后0.9min后将梯度应用为40％A与60％B，保持到1.5min并且在1.51min处平衡至初始条件直到2.0min。典型地，使用1.0μl的一个注射体积。炉温度是50℃(MS极性：阳性)。
通用程序E
使用UPLC(超高效液相色谱)Acquity(沃特斯公司)系统进行LC测量，该系统包括一个二元泵，该泵具有一个除气器、一个自动进样器、一个二极管-阵列检测器(DAD)以及一个如在以下对应的方法中详细说明的管柱，该管柱保持在40℃。来自该管柱的流量被引至MS检测器。该MS检测器被配置为具有一个电喷射离子化作用源。通过使用0.1秒的扫描间延迟，在0.2秒内从100至1000进行扫描，在一个三相四极质谱仪Quattro检测器(沃特斯公司)上获取质谱。毛细管针电压是3kV并且源温度被维持在130℃。用于阳极离子化模式以及阴极离子化模式的锥孔电压是20V。将氮气用作雾化气体。使用MassLynx-Openlynx软件(沃特斯公司)进行数据采集。
方法10：
除通用程序E之外：在一个Waters Acquity BEH(桥联的乙基硅氧烷/硅石混合体)苯基-己基管柱(1.7μm，2.1x100mm)上，使用0.343ml/min的流速进行反相UPLC。采用两个流动相(流动相A：95％7mM7mMNH4AcO/5％ACN；流动相B：100％ACN)来运行一个梯度状态：从84.2％A与15.8％B(持续0.49分钟)，2.18分钟后至10.5％A与89.5％B中持续1.94min并且0.73min后回到初始条件持续0.73分钟。使用2ml的一个注射体积。
熔点
值是峰值亦或融化范围，并且获得的值具有与这个分析方法通常相关的实验不确定性。
Mettler FP81HT/FP90-FP62设备(在表2中由FP90与FP62表示)
对于多种化合物，在Mettler FP62亦或Mettler FP81HT/FP90设备上于毛细开管中确定熔点。使用1℃/分钟、3℃/分钟、5℃/分钟或10℃/分钟的温度梯度对熔点进行测量。最高温度是300℃。熔点读自数字显示器。
表2：分析数据-Rt意思是保留时间(按min计)，[M+H]+意思是该化合物的质子化质量，方法是指用于(LC)MS的方法。
Figure BDA0000374925510000881
Figure BDA0000374925510000891
n.d.意思是未测定。
SFCMS-方法
用于SFC-MS方法的通用程序A
使用来自伯吉尔仪器公司(Berger Instruments，美国特拉华州纽华克市)的分析型SFC系统进行SFC测量，该系统包括用于递送二氧化碳(CO2)和改性剂的一个双元泵控制模块(FCM-1200)，具有温度控制在1℃-150℃范围内的、用于管柱加热的一个热控制模块(TCM2100)以及用于六种不同管柱的管柱选择阀门(美国，德克萨斯州，休斯顿，VICI，瓦尔科)。光电二极管阵列检测器(Agilent1100，德国，瓦尔特布隆)配备有一个高压流单元(高达400bar)并且配置有一个CTC LC Mini PAL自动采样器(Leap科技公司，美国，北卡莱罗纳州，罗市)。将具有垂直Z-电喷射界面的ZQ质谱仪(沃特斯公司，美国，马萨诸塞州，米尔福德)与SFC-系统连接。用SFC ProNTo软件与Masslynx软件构成的整合平台进行仪器控制、数据收集及处理。
方法1
除通用程序A之外：在一个CHIRALPAK AD-H管柱(4.6mm x500mm)上，在50℃，使用3.0ml/min的流速进行SFC中的手性分离。流动相是CO2，20％MeOH(含有0.2％iPrNH2)保持15.00min，无梯度模式。
通用程序B
使用来自伯吉尔仪器公司(美国，特拉华州，纽华克市)的分析型SFC系统进行SFC测量，该系统包括用于递送二氧化碳(CO2)和改性剂的一个双元泵流体控制模块、一个CTC分析自动液体取样器、用于将管柱从室温加热至80℃的一个TCM-20000热控制模块。使用配备有持续高达400bar高压流单元的一个Agilent1100UV光电二极管阵列检测器。来自该管柱的流量被分到MS光谱仪。该MS检测器配置有大气压离子化作用源。用于Waters ZQ质谱分光光度计的以下电离参数是：电晕：9μa，源温度：140℃，锥孔：30V，探头温度450℃，萃取器3V，脱溶剂气体400L/hr，锥孔气体70L/hr。将氮气用作雾化气体。使用Waters-Micromass MassLynx-Openlynx数据系统进行数据采集。
方法2
除通用程序B之外：在一个CHIRALPAK AD DAICEL管柱(10μm，4.6x250mm)上，在35℃，使用3.0ml/min的流速进行SFC中的手性分离。流动相是CO2，60％乙醇，40％EtOH(含有0.3％iPrNH2)保持7min。
表3：分析的SFC数据-Rt意思是保留时间(按min计)，[M+H]+意思是该化合物的质子化质量，方法是指用于在对映异构体意义上纯的化合物的SFC/MS分析的方法。
Figure BDA0000374925510000921
*A意思是洗脱的第一个同分异构体。B意思是洗脱的第二个同分异构体。在对映异构体意义上不纯化合物的情况下对ee进行评估。
旋光：
在Perkin-Elmer341旋光计上用钠灯测量旋光度并且报导为以下[α]λ t℃(cg/100ml，溶剂)。
表4：分析数据-用于在对映异构体意义上纯的化合物的旋光值
Figure BDA0000374925510000922
Figure BDA0000374925510000931
n.d.意思是未确定
药理学实例
本发明中提供的化合物是β-位点APP-切割酶1(BACE1)的抑制剂。BACE1的抑制剂，一种天冬氨酸蛋白酶，被认为是与阿耳茨海默病(AD)的治疗有关。来自β-淀粉样前蛋白(APP)的β-淀粉样蛋白肽(Aβ)的产生与累积被认为在AD的开始与进展中起关键作用。通过在Aβ结构域的N-和C-端处各自由β-分泌酶与γ-分泌酶进行序列切割从淀粉样前蛋白(APP)产生Aβ。
凭借它们抑制酶活性的能力，具有化学式(I)的化合物被预期为基本上在BACE1处具有它们的作用。使用下文描述的且适合此类化合物(并且更具体地，根据化学式(I)的化合物)的鉴定的、基于生物化学荧光共振能量转移(FRET)的测定以及SKNBE2细胞中的细胞αlisa测定对此类抑制剂的行为进行测试，这些行为示于表3中。
基于生物化学FRET的测定
该测定是基于荧光共振能量转移测定(FRET)的测定。用于该测定的底物是APP衍生的、包含淀粉样前蛋白(APP)β-分泌酶切割位点的‘Swedish’Lys-Met/Asn-Leu突变的13个氨基酸的肽。该底物还包含两个荧光团：(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酸(Mca)是具有在320nm处的激发波长和405nm处的发射波长的一种荧光供体并且2，4-二硝基苯酚(Dnp)是一种专有的淬灭体受体。已经对这两个基团之间的距离进行了选择，使得光激发时，供体荧光能量通过共振能量传递由受体显著地淬灭。由BACE1切割时，荧光团Mca与淬灭基团Dnp分离，恢复供体的全荧光效应。荧光的增加与蛋白质水解速率线性相关(Koike H(小池)等人，J.Biochem.(《生物化学杂志》)1999，126，235-242)。
简言之，在384-孔规格中，在化合物不存在或存在下，将处于1μg/ml终浓度的重组BACE1蛋白在室温下用10μm底物于孵化缓冲液(pH5.0的40mM柠檬酸盐缓冲液、0.04％PEG、4％DMSO)中孵化120min。接下来通过在T＝0和T＝120处(在320nm处激发且在405nm处发射)的荧光测量直接测量蛋白质水解的量。由于T120与T0之间的差异，结果用RFU表示。
最佳拟合曲线通过％Controlmin对化合物浓度曲线的最小二乘法拟合得到。由此可以获得IC50值(引起50％活性抑制的抑制性浓度)。
LC＝低控制值的中位值
＝低控制：不与酶反应
HC＝高控制值的中位值
＝高控制：与酶反应
作用％＝100-[(样品-LC)/(HC-LC)*100]
控制％＝(样品/HC)*100
Controlmin％＝(样品-LC)/(HC-LC)*100
如上所述对以下示例性化合物进行基本测试并且展示以下活性：
表5
Figure BDA0000374925510000951
Figure BDA0000374925510000961
SKNBE2细胞中的细胞αlisa测定
在两个αlisa测定中，对产生并分泌到人神经母细胞瘤SKNBE2细胞培养基中的总Aβ和Aβ42水平进行定量。该测定基于表达野生型淀粉样前蛋白的人神经母细胞瘤SKNBE2(hAPP695)。稀释这些化合物并且添加到这些细胞中，孵育18小时并且然后进行Aβ42与总Aβ的测量。通过夹心αlisa进行总Aβ以及Aβ42的测量。αlisa是使用各自用于总Aβ以及Aβ42检测的、附接到链亲和素涂覆的珠子上的生物素酰化抗体AbN/25以及抗体Ab4G8或cAb42/26结合的受体珠子的一种夹心测定。在总Aβ或Aβ42存在下，这些珠子变得紧密靠近。供体珠子的激发引起单线态氧分子的释放，触发受体珠子中能量传递的级联，导致光发射。在孵育1小时之后测量光发射(在650nm处激发且在615nm处发射)。
最佳拟合曲线通过％Controlmin对化合物浓度曲线的最小二乘法拟合得到。由此可以获得IC50值(引起50％活性抑制的抑制性浓度)。
LC＝低控制值的中位值
＝低控制：对细胞进行无化合物的预孵化，在αlisa中无生物素酰化的Ab
HC＝高控制值的中位值
＝高控制：对细胞进行无化合物的预孵化
作用％＝100-[(样品-LC)/(HC-LC)*100]
控制％＝(样品/HC)*100
Controlmin％＝(样品-LC)/(HC-LC)*100
如上所述对以下示例性化合物进行基本测试并且展示以下活性：
表6
Figure BDA0000374925510000971
Figure BDA0000374925510000981
n.t.意思是未测试
体内效力证明
本发明的Aβ肽降低剂可以用于治疗哺乳动物(例如人)中的AD，或可替代地，在动物模型，例如但不局限于，小鼠、大鼠或豚鼠中证明效力。哺乳动物可以不被诊断为患有AD，或可以不具有针对AD的遗传易感性，但是可以是转基因的，使得它以类似于患有AD的患者中见到的方式过度产生并最终沉积Aβ。
Aβ肽降低剂可以使用任何标准方法，以任何标准形式进行给予。例如但不局限于，Aβ肽降低剂可以处于口服或通过注射摄入的液体、片剂或胶囊的形式。Aβ肽降低剂可以按足以显著降低血液、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)、或脑中Aβ肽水平的任何剂量进行给予。
为了确定Aβ42肽降低剂的急性给予是否会降低体内Aβ肽水平，使用非转基因的啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。检查经Aβ肽降低剂处理的动物并与未处理或用载体处理的那些进行比较，并且通过标准技术，例如，使用ELISA对可溶性Aβ42以及总Aβ的脑水平进行定量。处理周期从小时(h)至天变化，并且一旦效应起始时程可以建立，基于Aβ42降低的结果调节处理周期。
示出了用于测量体内Aβ42降低的一个典型实验方案，但这只是可以用于优化可检出Aβ水平的多个变化中的一种。例如，Aβ肽降低化合物被配制到20％羟丙基β环糊精中。将这些Aβ肽降低剂作为一次口服量(p.o.)或一次皮下注射体积(s.c)向禁食过夜的动物进行给予。一定时间后，通常是2h或4h(如在表7中指出的)，处死这些动物并且对Aβ42水平进行分析。
通过断头术和放血将血液收集于EDTA-处理过的收集管中。将血液在4℃于1900g离心10分钟(min)并且回收血浆并快速冰冻以用于后续分析。将脑从头盖和后脑上去除。去除小脑并且分离左半球和右半球。将左半球在-18℃下储存以用于测试化合物水平的定量分析。将右半球用磷酸盐-缓冲盐水(PBS)缓冲液进行冲洗并且立即在干冰上进行冰冻并在-80℃下储存直到匀浆以用于生化测定。
将来自非转基因动物的小鼠脑重悬于包含蛋白酶抑制剂(Roche-11873580001或04693159001)的、每克组织8倍体积的0.4％DEA(二乙胺)/50mM NaCl中，例如，对于0.158g的脑，添加1.264ml的0.4％DEA。将全部样品在FastPrep-24系统(MP生物医学公司(MPBiomedicals))中使用裂解基质D(MPBio#6913-100)在6m/s持续20秒匀浆。将匀浆在221.300x g离心50min。然后将所得高速上清液转移到新的微量离心管中。将九份上清液用1份0.5M Tris-HCl pH6.8进行中和并用于总Aβ以及Aβ42的定量。
为了对脑匀浆可溶性部分中的总Aβ以及Aβ42进行定量，使用酶联免疫吸附测定。简言之，在Ultraculture公司的1.5ml微量离心管中制备标准品(合成的Aβ1-40以及Aβ1-42的稀释液，Bachem公司)，其中最终浓度范围从10000至0.3pg/ml。将样品和标准品与用于Aβ42检测的HRPO-标记的N-端抗体以及与用于总Aβ检测的生物素酰化的中间-结构域(mid-domain)抗体4G8进行共孵育。然后将50μl的共轭物/样品或共轭物/标准品混合物添加到抗体涂覆板上(对于Aβ42检测，捕获抗体选择性地识别Aβ42的C-末端，抗体JRF/cAβ42/26，对于总Aβ检测，捕获抗体选择性地识别Aβ的N-末端，抗体JRF/rAβ/2)。允许该板在4℃孵育过夜以允许抗体-淀粉样蛋白复合物的形成。根据制造商的说明书(皮尔斯公司(Pierce Corp.)，伊利诺伊州罗克福德市)，在该孵育以及随后的洗涤步骤之后，通过添加Quanta Blu荧光过氧化酶底物来完成用于Aβ42定量的ELISA。在10min至15min之后进行读数(在320nm处激发/在420nm处发射)。
针对总Aβ检测，根据制造商的说明书(皮尔斯公司，伊利诺伊州罗克福德市)，添加链亲和素-过氧化酶-共轭物，60min之后进行额外一个洗涤步骤并且添加Quanta Blu荧光过氧化酶底物。在10min至15min之后进行读数(在320nm处激发/在420nm处发射)。
在这个模型中，与未处理的动物相比，至少20％的Aβ42降低将是有利的。
如上所述对以下示例性化合物进行基本测试并且展示以下活性：
表7：
Figure BDA0000374925510001011
n.t.意思是未测试；s.c.意思是皮下注射；p.o.意思是口服

Claims (8)

1.具有化学式(I)的化合物
Figure FDA0000374925500000011
或其一种互变异构体或立体异构体形式，其中
R1和R2独立地选自下组，该组由以下各项构成：氢、卤素、氰基、C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷基或C3-6环烷基；
R3选自下组，该组由以下各项构成：氢、C1-3烷基、C3-6环烷基、单-和多卤代-C1-3烷基、同芳基(homoary1)以及杂芳基；
X1、X2、X3、X4独立地是C(R4)或N，其条件是其中不超过两个表示N；每个R4选自下组，该组由以下各项构成：氢、卤素、C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷基、氰基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢或C1-3烷基；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是苯基或经一个、两个或三个取代基取代的苯基，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基、噻二唑基、噁唑基、以及噁二唑基，每个任选地经一个、两个或三个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、单-和多卤代-C1-3烷基、单-和多卤代-C1-3烷氧基；或其一种加成盐或溶剂化物。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，
R1和R2独立地选自氢和C1-3烷基；
X1、X2、X3、X4独立地是C(R4)，其中每个R4选自氢和卤素；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是苯基或经一个、两个或三个取代基取代的苯基，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、以及多卤代-C1-3烷氧基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基、嘧啶基、以及吡嗪基，每个任选地经一个或两个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、以及多卤代-C1-3烷氧基；或
其一种加成盐或溶剂化物。
3.如权利要求1所述的化合物，其中，
R1和R2是氢；
X1、X2、X3、X4是CH；
L是一个键或-N(R5)CO-，其中R5是氢；
Ar是同芳基或杂芳基；
其中同芳基是经氯取代的苯基；
杂芳基选自下组，该组由以下各项构成：吡啶基以及嘧啶基，每个任选地经一个或两个取代基取代，这个或这些取代基选自下组，该组由以下各项构成：氯、氟、氰基、甲基、以及甲氧基；或
其一种加成盐或溶剂化物。
4.如权利要求1所述的化合物，经R3取代的碳原子具有R-构型。
5.一种药物组合物，该组合物包括一种治疗有效量的化合物以及一种药学上可接受的载体，该化合物是如在权利要求1至4中任一项所定义的。
6.一种用于制备如权利要求5中定义的药物组合物的方法，其特征在于一种药学上可接受的载体与一种治疗有效量的如在权利要求1至4中任一项所定义的化合物紧密混合。
7.如在权利要求1至4中任一项所定义的一种化合物，对于在阿耳茨海默病(AD)、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆或与β-淀粉样蛋白相关的痴呆的治疗、防止或预防中使用。
8.治疗选自下组的紊乱的一种方法，该组由以下各项构成：阿耳茨海默病、轻度认知缺损、老化、痴呆、路易体痴呆、唐氏综合征、与中风相关的痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆以及与β-淀粉样蛋白相关的痴呆，该方法包括向需要其的受试者给予一种治疗有效量的如在权利要求1至4中任一项所定义的化合物或如在权利要求5中所定义的药物组合物。
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