CN103408634B - 马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103408634B CN103408634B CN201310298255.6A CN201310298255A CN103408634B CN 103408634 B CN103408634 B CN 103408634B CN 201310298255 A CN201310298255 A CN 201310298255A CN 103408634 B CN103408634 B CN 103408634B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- horse placenta
- water
- soluble protein
- horse
- protein extract
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
<b>本发明涉及马胎盘提取物及其药物应用的技术领域，是一种具有生物活性的马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用；本发明提取过程中采用接近生理pH和生理渗透压的磷酸盐缓冲液为提取溶剂，最大程度的保持马胎盘中活性物质的活性；其能明显增强正常淋巴细胞的活性、明显抑制ConA和LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖活性、明显增强NK细胞对PC-3癌细胞的杀伤活性，因此对免疫功能具有一定程度的调节作用；能显著抑制H2O2造成的皮肤成纤维细胞的氧化损伤，提高细胞活力，降低细胞内MDA含量，提高SOD和GPx酶活性，降低细胞凋亡率，抑制DNA损伤，因此对氧化损伤有一定的保护作用。</b>
Description
技术领域
本发明涉及马胎盘提取物及其药物或/和保健品或/和化妆品应用的技术领域，是一种有生物活性的马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用。
背景技术
胎盘作为维持胎儿在母体内生长发育的临时性器官，因其特殊的屏障功能与内分泌功能，自古以来就为人们所重视，《本草纲目》称其具有“安神养血、补气、益精、解毒、补血”的作用。近年来研究发现，胎盘含有多种蛋白质、多肽、多糖、矿物质元素及维生素等，具有调节免疫功能、抗氧化延缓衰老、预防肿瘤、促进伤口愈合、增强记忆力等保健功效。在动物胎盘的研究中，羊胎盘的研究是最早、最深入且应用最广泛的，鉴于羊胎盘相关研究的成功，人们也更加重视其他动物胎盘（如牛、鹿、猪等）的研究，在加工上也由简单的烘干与水煮发展到生物萃取，并对胎盘所含的活性成分进行了相关研究。但是在国内外马胎盘的研究仍处于起步阶段，关于马胎盘蛋白的提取工艺及其生物活性的相关研究几乎未见报道，对马胎盘的加工尚缺乏系统和深入的研究。
发明内容
本发明首次提供了一种马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用，特别是该马胎盘水溶性蛋白提取物在制备免疫调节或/和抗氧化方面药物或/和保健品或/和化妆品的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种马胎盘水溶性蛋白提取物，按下述步骤得到：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升至4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次至8次，每次组织匀浆时间为1min至2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min至4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h至4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍至10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍至10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种马胎盘水溶性蛋白提取物的制备方法，按下述步骤进行：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升至4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次至8次，每次组织匀浆时间为1min至2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min至4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h至4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍至10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍至10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述第一步，取适量新鲜马胎盘用清水将血污洗净，再用蒸馏水漂洗3次至5次，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘。
上述小块马胎盘的粒径为0.5cm3至2cm3。
上述第六步，将收集后的透析液用2h至3h的时间冷冻至-40℃，然后用24h的时间在压力为1Mpa下抽真空干燥使温度上升至10℃后，得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物；或/和，匀浆机的转速为10000r/min至12000r/min；或/和，离心机的转速为10000r/min至12000r/min。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种马胎盘水溶性蛋白提取物在制备免疫调节或/和抗氧化方面药物的应用。
本发明的优点：本发明提取过程中采用接近生理pH和生理渗透压的磷酸盐缓冲液为提取溶剂，最大程度的保持马胎盘中活性物质的活性；其能明显增强正常淋巴细胞的活性、明显抑制ConA和LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖活性、明显增强NK细胞对PC-3癌细胞的杀伤活性，因此对免疫功能具有一定程度的调节作用；能显著抑制H2O2造成的皮肤成纤维细胞的氧化损伤，提高细胞活力，降低细胞内MDA含量，提高SOD和GPx酶活性，降低细胞凋亡率，抑制DNA损伤，因此对氧化损伤有一定的保护作用。
附图说明
附图1为本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对皮肤成纤维细胞氧化损伤保护作用的DNAladder电泳图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，该马胎盘水溶性蛋白提取物，按下述步骤得到：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升至4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次至8次，每次组织匀浆时间为1min至2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min至4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h至4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍至10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍至10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物。马胎盘水溶性蛋白提取物略带腥味，在4℃下密封保存可保存6个月。马胎盘在中药中，被称为马胞，主要功能为：补虚养颜、益智安神、协调气血、固摄冲任、活血化瘀、养血温经等。无论是根据中医实践经验，还是现代科学研究结果来看，马胎盘也应含有与其他胎盘类似的活性成分并具有相似的保健功能。其在保健品、化妆品、食品等方面会有广泛的应用。
实施例2，该马胎盘水溶性蛋白提取物，按下述步骤得到：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升或4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次或8次，每次组织匀浆时间为1min或2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min或4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h或4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍或10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍或10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物。
实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3的第一步，取适量新鲜马胎盘用清水将血污洗净，再用蒸馏水漂洗3次至5次，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘。
实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4中小块马胎盘的粒径为0.5cm3至2cm3。
实施例5，作为上述实施例的优化，实施例5的第六步，将收集后的透析液用2h至3h的时间冷冻至-40℃，然后用24h的时间在压力为1Mpa下抽真空干燥使温度上升至10℃后，得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物。
实施例6，作为上述实施例的优化，实施例6中匀浆机的转速为10000r/min至12000r/min；或/和，离心机的转速为10000r/min至12000r/min。
实施例7，该马胎盘水溶性蛋白提取物在制备免疫调节或/和抗氧化方面药物的应用。
下面是对上述实施例得到的马胎盘水溶性蛋白提取物的研究分析及在制备免疫调节或/和抗氧化方面药物的应用的试验：
1.马胎盘水溶性蛋白提取物氨基酸组成分析
按国家标准GB/T5009.124-2003法进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物氨基酸种类和平均质量百分含量见表1所示。
表1本发明马胎盘水溶性蛋白提取物氨基酸种类和平均质量百分含量
*:必须氨基酸
从表1可以看出，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物中含有17种氨基酸，其中谷氨酸含量最高质量百分含量为7.53%，其次为天门冬氨酸质量百分含量为5.64%和亮氨酸质量百分含量为5.54%，含有7种必须氨基酸（色氨酸未测定）占氨基酸总质量百分含量的38.9%。
本发明马胎盘水溶性蛋白提取物免疫调节作用的研究
（1）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对正常淋巴细胞的影响
脱颈处死小鼠，无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调节细胞密度为1.8×107mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。在96孔平底细胞培养板中，设立空白调零组、阴性对照组、给药组；在阴性对照组和给药组每孔分别加入淋巴细胞悬液150μL；在给药组继续加入30μL不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白提取物溶液，使最终浓度分别为1500μg·mL-1、750μg·mL-1、375μg·mL-1、187.5μg·mL-1、93.75μg·mL-1、46.87μg·mL-1、23.44μg·mL-1，用基础DMEM培养基将所有孔补加至200μL，每组均设5个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养68h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg·mL-1）继续培养4h，板式离心机1200×g离心15min，吸弃上清120μL，加入100μLFormanzan溶解液，过夜孵育，以空白对照孔调零，酶标仪570nm波长处测定各孔A值，不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对正常淋巴细胞活性的平均影响（±s,n=5）见表2所示。
表2不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对正常淋巴细胞活性的平均影响（±s,n=5）
| 组别 | 不同浓度的本发明(μg·mL-1) | A570 | 细胞活力(%) |
| 阴性对照组 | 0 | 0.887±0.013 | 100.0±1.5 |
| 给药组1 | 23.44 | 0.872±0.022 | 98.4±2.5 |
| 给药组2 | 46.87 | 0.888±0.008 | 100.1±0.9 |
| 给药组3 | 93.75 | 0.889±0.015 | 100.2±1.7 |
| 给药组4 | 187.5 | 1.120±0.048** | 126.3±5.4** |
| 给药组5 | 375 | 0.984±0.029* | 111.0±3.3*4 --> |
| 给药组6 | 750 | 1.010±0.018** | 113.9±2.0** |
| 给药组7 | 1500 | 0.776±0.022** | 87.5±2.5** |
与阴性对照组比较,*:P<0.05;与对照组比较,**:P<0.01
从表2可以看出，与阴性对照组比较，随着本发明马胎盘水溶性蛋白提取物浓度逐渐增大（187.5μg·mL-1至750μg·mL-1），对正常淋巴细胞的活性产生了明显的增殖影响。
（2）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性的影响
脱颈处死小鼠，无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调节细胞密度为1.8×107mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。在96孔平底细胞培养板中，设立空白调零组、阴性对照组、ConA对照组、ConA+给药组。在阴性对照组、ConA对照组和ConA+给药组每孔分别加入淋巴细胞悬液150μL；在ConA对照组和ConA+给药组每孔分别加入ConA溶液20μL，使ConA的终浓度为10μg·mL-1；在ConA+给药组继续加入30μL不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白提取物溶液，使终浓度分别为1500μg·mL-1、750μg·mL-1、375μg·mL-1、187.5μg·mL-1、93.75μg·mL-1、46.87μg·mL-1、23.44μg·mL-1，用基础DMEM培养基将所有孔补加至200μL，每组均设5个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养68h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg·mL-1）继续培养4h，板式离心机1200×g离心15min，收集上清120μL（-80℃保存待测IL-2），加入100μLFormanzan溶解液，过夜孵育，以空白对照孔调零，酶标仪570nm波长处测定各孔A值。不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性的平均影响（±s,n=5）见表3所示。
表3不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性的平均影响（±s,n=5）
| 组别 | ConA浓度(μg·mL-1) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | A570 | 细胞活力(%) |
| 阴性对照组 | 0 | 0 | 0.672±0.026 | 100.0±3.9 |
| ConA对照 | 10 | 0 | 0.873±0.011** | 129.9±1.6** |
| ConA+给药1 | 10 | 23.44 | 0.807±0.022## | 120.1±3.3## |
| ConA+给药2 | 10 | 46.87 | 0.820±0.030## | 122.0±4.5## |
| ConA+给药3 | 10 | 93.75 | 0.814±0.016## | 121.1±2.3## |
| ConA+给药4 | 10 | 187.5 | 0.792±0.024## | 117.8±3.6## |
| ConA+给药5 | 10 | 375 | 0.765±0.021## | 113.8±3.1## |
| ConA+给药6 | 10 | 750 | 0.725±0.027## | 107.9±4.0## |
| ConA+给药7 | 10 | 1500 | 0.485±0.025## | 72.1±3.8## |
与阴性对照组比较,**:P<0.01;与ConA对照组比较,##:P<0.01
从表3可以看出，不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白提取物均能对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性产生明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。
（3）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对LPS诱导的B淋巴细胞增殖活性的影响
脱颈处死小鼠，无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调节细胞密度为1.8×107mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。在96孔平底细胞培养板中，设立空白调零组、阴性对照组、LPS对照组、LPS+给药组。在阴性对照组、LPS对照组和LPS+给药组每孔分别加入淋巴细胞悬液150μL；在LPS对照组和LPS+给药组每孔分别加入LPS溶液20μL，使LPS的终浓度为15μg·mL-1；在LPS+给药组继续加入30μL不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白提取物溶液，使终浓度分别为1500μg·mL-1、750μg·mL-1、375μg·mL-1、187.5μg·mL-1、93.75μg·mL-1、46.87μg·mL-1、23.44μg·mL-1，用基础DMEM培养基将所有孔补加至200μL，每组均设5个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养68h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg·mL-1）继续培养4h，板式离心机1200×g离心15min，吸弃上清120μL，加入100μLFormanzan溶解液，过夜孵育，以空白对照孔调零，酶标仪570nm波长处测定各孔A值。不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对LPS诱导的B淋巴细胞增殖活性的平均影响（±s,n=5）见表4。
表4不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对LPS诱导的B淋巴细胞增殖活性的平均影响（±s,n=5）
| 组别 | LPS浓度(μg·mL-1) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | A570 | 细胞活力(%) |
| 阴性对照组 | 0 | 0 | 0.662±0.047 | 100.0±7.0 |
| LPS对照组 | 15 | 0 | 1.016±0.015** | 153.4±2.2** |
| LPS+给药1 | 15 | 23.44 | 1.046±0.031 | 158.0±4.8 |
| LPS+给药2 | 15 | 46.87 | 1.028±0.016 | 155.1±2.5 |
| LPS+给药3 | 15 | 93.75 | 1.073±0.028 | 162.0±4.3 |
| LPS+给药4 | 15 | 187.5 | 1.001±0.022 | 151.1±3.4 |
| LPS+给药5 | 15 | 375 | 0.984±0.018 | 148.5±2.7 |
| LPS+给药6 | 15 | 750 | 0.889±0.016## | 134.3±2.4## |
| LPS+给药7 | 15 | 1500 | 0.712±0.041## | 107.4±6.1## |
与阴性对照组比较,**:P<0.01;与LPS对照组比较,##:P<0.01
从表4可以看出，高浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白提取物给药组对LPS诱导的B淋巴细胞增殖活性产生了明显的抑制作用。
（4）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对NK细胞杀伤活性的影响
脱颈处死小鼠，无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调节细胞密度为1.8×107mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。取对数生长期的人前列腺癌细胞（PC-3）为靶细胞，调整细胞密度为2.5×105mL-1，在96孔平底细胞培养板中接种100μL，培养4h后，按效靶比50:1加入淋巴细胞（NK细胞为效应细胞），加入不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白（终浓度分别为1500μg·mL-1、375μg·mL-1、93.75μg·mL-1、23.44μg·mL-1），同时设立空白调零组、靶细胞对照组、效靶细胞对照组，靶细胞+给药(终浓度同上)对照组，每组均设5个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养72h后，吸弃培养液，用PBS洗涤3次，加入基础DMEM培养基200μL，每孔加入20μLMTT溶液（5mg·mL-1）继续培养4h，吸弃培养基然后加入150μLFormanzan溶解液，过夜孵育，以空白对照孔调零，酶标仪570nm波长处测定各孔A值，并计算NK细胞杀伤活性：NK细胞杀伤活性%=（1-实验组A平均值/靶细胞A平均值）×100%。不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对PC-3细胞的直接作用（±s,n=5）见表5所示；不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对NK细胞杀伤PC-3细胞的影响（±s,n=5）见表6所示。
表5不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对PC-3细胞的直接作用（±s,n=5）
| 组别 | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | A570 | 细胞活力(%) |
| 靶细胞对照组 | 0 | 1.713±0.079 | 100.0±6.2 |
| 靶细胞+给药对照组1 | 23.44 | 1.711±0.064 | 99.8±5.1 |
| 靶细胞+给药对照组2 | 93.75 | 1.686±0.083 | 97.9±6.6 |
| 靶细胞+给药对照组3 | 375 | 1.645±0.064 | 94.6±5.0 |
| 靶细胞+给药对照组4 | 1500 | 1.317±0.063** | 68.6±5.0** |
与对照组比较,**:P<0.01
表6不同浓度本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对NK细胞杀伤PC-3细胞的影响（±s,n=5）
| 组别 | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | A570 | 杀伤活性(%) |
| 靶细胞对照组 | 0 | 1.527±0.052 | 0.0±3.4 |
| 效靶细胞对照组 | 0 | 1.270±0.061** | 16.8±4.0** |
| 效靶细胞+给药组1 | 23.44 | 1.338±0.059 | 12.4±3.9 |
| 效靶细胞+给药组2 | 93.75 | 1.141±0.097## | 25.3±6.4## |
| 效靶细胞+给药组3 | 375 | 1.067±0.066## | 30.1±4.3## |
| 效靶细胞+给药组4 | 1500 | 0.849±0.042## | 44.4±2.8## |
与靶细胞对照组比较,**:P<0.01;与效靶细胞对照组比较,##:P<0.01
从表5和表6可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物与PC-3癌细胞单独作用并不能直接作用杀伤该细胞，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物与NK细胞和PC-3细胞共同作用，能明显增强NK细胞对PC-3细胞的杀伤活性；且呈剂量依赖性，说明本发明马胎盘水溶性蛋白提取物在一定程度上可以增强NK细胞对PC-3癌细胞的杀伤强度。
（5）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞内IL-2含量的影响
收集上述2.（2）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性的影响中T淋巴细胞上清液，然后按照美国eBioscience公司IL-2ELISA试剂盒测定说明进行操作，不同浓度马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞内IL-2含量的影响（±s,n=5）见表7。
表7不同浓度马胎盘水溶性蛋白提取物对ConA诱导的T淋巴细胞内IL-2含量的影响（±s,n=5）
| 组别 | ConA浓度(μg·mL-1) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | IL-2含量(pg/mL) |
| 对照组 | 0 | 0 | 21.0±8.8 |
| ConA对照 | 10 | 0 | 1039.3±6.6** |
| ConA+给药1 | 10 | 23.44 | 1035.0±19.8 |
| ConA+给药2 | 10 | 46.87 | 1037.3±6.3 |
| ConA+给药3 | 10 | 93.75 | 1039.3±4.0 |
| ConA+给药4 | 10 | 187.5 | 1040.1±4.1 |
| ConA+给药5 | 10 | 375 | 1016.4±15.7##7 --> |
| ConA+给药6 | 10 | 750 | 973.0±10.7## |
| ConA+给药7 | 10 | 1500 | 862.4±12.4## |
与对照组比较,**:P<0.01;与ConA对照组比较,##:P<0.01
从表7可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物能抑制ConA诱导的T淋巴细胞中IL-2的分泌。
本发明马胎盘水溶性蛋白提取物抗氧化作用的研究
（1）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物总抗氧化能力的检测
按总抗氧化能力检测试剂盒说明书进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白总抗氧化能力测定（±s,n=3）见表8。
表8本发明马胎盘水溶性蛋白总抗氧化能力测定（±s,n=3）
| 组别 | 本发明加入量 | A593 | 抗氧化能力相当于FeSO4的浓度（mM） |
| 阳性对照（mM） | 1 | 0.683±0.013 | 1.423 |
| 实验组1（mg/mL） | 10 | 0.469±0.015 | 0.953 |
| 实验组2（mg/mL） | 5 | 0.215±0.013 | 0.396 |
| 实验组3（mg/mL） | 2.5 | 0.197±0.100 | 0.358 |
| 实验组4（mg/mL） | 1.25 | 0.108±0.004 | 0.161 |
| 实验组5（mg/mL） | 0.625 | 0.084±0.001 | 0.108 |
| 实验组6（mg/mL） | 0.3125 | 0.075±0.002 | 0.090 |
从表8可以看出，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物具有一定能力的抗氧化能力，且具有剂量依赖效应。
（2）MTT法测定本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对皮肤成纤维细胞氧化损伤的保护作用
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，给药组分别加入20μL不同浓度的本发明马胎盘水溶性蛋白，使其终浓度分别为800μg·mL-1、400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1、25μg·mL-1、12.5μg·mL-1，阴性对照组和H2O2模型对照组分别加入20μL基础DMEM培养基，继续培养24h后，除阴性对照组外，其余每组加入H2O2溶液，使其终浓度为250μM，继续培养1h后。吸弃上清液，加入基础DMEM培养基200μL，加入20μLMTT（5mg·mL-1），继续培养4h，吸弃上清液，加入150μLDMSO，震摇10min，使甲瓉结晶充分溶解，30min内酶标仪490nm波长处测定各孔A值，并计算细胞活力。本发明马胎盘水溶性蛋白预作用24h对皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响（±s,n=6）见表9所示。
表9本发明马胎盘水溶性蛋白提取物预作用24h对皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响（±s,n=6）
| 组别 | H2O2浓度 (μM) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | A490 | 细胞活力(%) |
| 阴性对照组 | 0 | 0 | 0.506±0.009 | 100.0±1.8 |
| H2O2模型对照组 | 250 | 0 | 0.350±0.014** | 69.2±2.7**8 --> |
| 给药组1 | 250 | 12.5 | 0.476±0.016## | 94.0±3.2## |
| 给药组2 | 250 | 25 | 0.510±0.015## | 100.7±2.9## |
| 给药组3 | 250 | 50 | 0.560±0.013## | 110.7±2.5## |
| 给药组4 | 250 | 100 | 0.590±0.020## | 116.6±3.9## |
| 给药组5 | 250 | 200 | 0.639±0.016## | 126.2±3.2## |
| 给药组6 | 250 | 400 | 0.721±0.019## | 142.6±3.8## |
| 给药组7 | 250 | 800 | 0.746±0.015## | 147.5±3.1## |
与阴性对照组比较,**:P<0.01;与模型组比较,##:P<0.01
从表9可以看出，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物预作用24h再由H2O2氧化造模时，各个浓度给药组对细胞氧化损伤有很显著的保护作用，且随着给药剂量的增加而增强，呈浓度依赖性。
（3）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内MDA含量的影响
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，H2O2处理1h后，收集洗涤皮肤成纤维细胞，然后按BioVision公司MDA试剂盒测定说明书进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内MDA含量的影响（±s,n=3）见表10所示。
表10本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内MDA含量的影响（±s,n=3）
| 组别 | H2O2浓度(Μm) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | MDA含量(nmol/mL) |
| 阴性对照组 | 0 | 0 | 3.13±0.39 |
| H2O2模型对照组 | 250 | 0 | 33.93±3.36** |
| 给药组1 | 250 | 12.5 | 17.00±1.18## |
| 给药组2 | 250 | 50 | 12.01±1.10## |
| 给药组3 | 250 | 100 | 7.01±0.85## |
| 给药组4 | 250 | 200 | 6.49±0.39## |
与对照组比较,**:P<0.01;与模型组比较,##:P<0.01
从表10可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物能显著减小H2O2氧化损伤的皮肤成纤维细胞内MDA的含量，对氧化损伤有一定的保护作用。
（4）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内SOD含量的影响
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，H2O2处理1h后，收集洗涤皮肤成纤维细胞，然后按BioVision公司SOD试剂盒测定说明书进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内SOD活力的影响（±s,n=3）见表11。
表11本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内SOD活力的影响（±s,n=3）
| 组别 | H2O2浓度 (μM) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | SOD活力(%) |
| 对照组 | 0 | 0 | 84.2±1.7 |
| 模型组 | 250 | 0 | 64.1±1.9** |
| 给药组1 | 250 | 12.5 | 65.8±0.3 |
| 给药组2 | 250 | 50 | 66.9±1.0# |
| 给药组3 | 250 | 100 | 67.0±1.4# |
| 给药组4 | 250 | 200 | 79.1±0.7## |
与对照组比较,**:P<0.01;与模型组比较,#:P<0.05;与模型组比较,##:P<0.01
从表11可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物能显著增强H2O2氧化损伤的皮肤成纤维细胞内SOD的活力，具有一定的抗氧化能力。
（5）马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内GPx含量的影响
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，H2O2处理1h后，收集洗涤皮肤成纤维细胞，然后按BioVision公司GPx试剂盒测定说明书进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内GPx活力的影响（±s,n=3）见表12。
表12本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞内GPx活力的影响（±s,n=3）
| 组别 | H2O2浓度 (μM) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | GPx活力(mU·mL-1) |
| 对照组 | 0 | 0 | 12.67±0.41 |
| 模型组 | 250 | 0 | 0.48±0.41** |
| 给药组1 | 250 | 12.5 | 0.53±041 |
| 给药组2 | 250 | 50 | 2.05±0.59## |
| 给药组3 | 250 | 100 | 3.78±0.57## |
| 给药组4 | 250 | 200 | 5.46±0.56## |
与对照组比较,**:P<0.01;与模型组比较,##:P<0.01
从表12可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物能显著增强H2O2氧化损伤的皮肤成纤维细胞内GPx的活力，具有一定的抗氧化能力。
（6）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对氧化损伤的皮肤成纤维细胞凋亡的影响
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，H2O2处理1h后，收集洗涤皮肤成纤维细胞，然后按invitrogen公司AnnexinV-AF488/PI双染试剂盒测定说明书进行测定，本发明马胎盘水溶性蛋白对氧化损伤的皮肤成纤维细胞凋亡的影响（±s,n=3）见表13。
表13本发明马胎盘水溶性蛋白对氧化损伤的皮肤成纤维细胞凋亡的影响（±s,n=3）
| 组别 | H2O2浓度 (μM) | 本发明给药浓度(μg·mL-1) | 早期凋亡率(%) | 晚期凋亡率（%） |
| 对照组 | 0 | 0 | 3.0±0.2 | 0.7±0.1 |
| 模型组 | 500 | 0 | 53.9±3.5** | 15.5±1.5* |
| 给药组1 | 500 | 12.5 | 32.5±1.0# | 9.0±0.1 |
| 给药组2 | 500 | 50 | 29.3±0.9# | 6.9±0.7# |
| 给药组3 | 500 | 200 | 22.6±0.1# | 2.8±0.1# |
与对照组比较,*:P<0.05;与对照组比较,**:P<0.01;与模型组比较,#:P<0.05
从表13可以看出：本发明马胎盘水溶性蛋白提取物能在一定程度上抑制氧化损伤造成的细胞凋亡。
（7）本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对皮肤成纤维细胞氧化损伤保护作用的DNAladder电泳
取对数生长期的皮肤成纤维细胞消化、吹打，并调整细胞密度为8×104mL-1，在96孔细胞培养板中，每孔加入180μL细胞悬液，置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，H2O2处理1h后，收集洗涤皮肤成纤维细胞，然后按北京天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，取4uLDNA样品和1ul上样缓冲液混合，取5uL加入1.5%琼脂糖凝胶样品池内，开始电泳，100V电压5min后改用70V电压60min，凝胶成像仪照像，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对皮肤成纤维细胞氧化损伤保护作用的DNAladder电泳图见图1。
在图1中，a:对照组；b:模型组；c:H2O2+200μg·mL-1药物；d:H2O2+100μg·mL-1药物；e:H2O2+50μg·mL-1药物；f:H2O2+12.5μg·mL-1药物；从图1可以看出，本发明马胎盘水溶性蛋白提取物对H2O2氧化损伤造成的细胞内DNA损伤有一定程度的保护作用。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (3)
1.一种马胎盘水溶性蛋白提取物，其特征在于按下述步骤得到：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升至4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次至8次，每次组织匀浆时间为1min至2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min至4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h至4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍至10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍至10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物；其中：在第一步中，取适量新鲜马胎盘用清水将血污洗净，再用蒸馏水漂洗3次至5次，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；小块马胎盘的粒径为0.5cm3至2cm3；在第六步中，将收集后的透析液用2h至3h的时间冷冻至-40℃，然后用24h的时间在压力为1Mpa下抽真空干燥使温度上升至10℃后，得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物；在第二步中，匀浆机的转速为10000r/min至12000r/min；在第四步中，离心机的转速为10000r/min至12000r/min。
2.一种马胎盘水溶性蛋白提取物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，取适量新鲜马胎盘用清水清洗干净，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；第二步，按每克小块马胎盘中加入1毫升至4毫升的磷酸盐缓冲液计，向剪碎的小块马胎盘中加入pH为7.2、摩尔浓度为0.01摩尔每升的磷酸盐缓冲液，将小块马胎盘连同磷酸盐缓冲液放在匀浆机中组织匀浆5次至8次，每次组织匀浆时间为1min至2min，每次组织匀浆的间隔时间为2min至4min；第三步，组织匀浆后的匀浆液在温度为30℃下静置1h至4h；第四步，将静置后的匀浆液放置在温度为4℃的离心机中离心15min，收集上清液；第五步，将收集的上清液放入分子量为3500的透析袋中，然后把透析袋连同透析袋中的上清液放在温度为4℃的去离子水中进行透析24h，去离子水的量为上清液体积的8倍至10倍，每8h换一次去离子水，每次去离子水的换水量为上清液体积的8倍至10倍，透析后收集透析液；第六步，将收集后的透析液冷冻干燥后得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物；其中：在第一步中，取适量新鲜马胎盘用清水将血污洗净，再用蒸馏水漂洗3次至5次，去除筋膜、血管，剪碎得到小块马胎盘；小块马胎盘的粒径为0.5cm3至2cm3；在第六步中，将收集后的透析液用2h至3h的时间冷冻至-40℃，然后用24h的时间在压力为1Mpa下抽真空干燥使温度上升至10℃后，得到棕褐色絮状粉末即为马胎盘水溶性蛋白提取物；在第二步中，匀浆机的转速为10000r/min至12000r/min；在第四步中，离心机的转速为10000r/min至12000r/min。
3.一种根据权利要求1所述的马胎盘水溶性蛋白提取物在制备免疫调节或/和抗氧化方面药物或/和保健品或/和化妆品的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310298255.6A CN103408634B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310298255.6A CN103408634B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103408634A CN103408634A (zh) | 2013-11-27 |
| CN103408634B true CN103408634B (zh) | 2016-04-13 |
Family
ID=49601689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310298255.6A Active CN103408634B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | 马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103408634B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108014328A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 吴广印 | 一种预防脱发、促进生发物质的配方及其制备方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108323750A (zh) * | 2017-01-20 | 2018-07-27 | 内蒙古草原鑫河食品有限公司 | 一种具有肝脏保护作用的活性成分及其提取方法和应用 |
| CN108236039A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-07-03 | 佛山汇沐化学科技有限公司 | 一种螳螂卵蛸蛋白的提取方法及其应用 |
| CN108142939A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-06-12 | 内蒙古康肽生物工程有限公司 | 一种含胎盘干细胞因子的口服液及其制备方法 |
| JP6739472B2 (ja) * | 2018-05-30 | 2020-08-12 | 株式会社粧薬研究所 | ウマプラセンタエキスを有効成分とする剤 |
| CN109575103A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-04-05 | 刘力伟 | 一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法 |
| CN114886925B (zh) * | 2022-05-25 | 2023-10-13 | 兰州大学 | 羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101092448A (zh) * | 2007-07-06 | 2007-12-26 | 长春中医药大学 | 人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法 |
| CN101182358A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-21 | 长春中医药大学 | 鹿茸胶原的分离纯化制备方法 |
-
2013
- 2013-07-16 CN CN201310298255.6A patent/CN103408634B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101092448A (zh) * | 2007-07-06 | 2007-12-26 | 长春中医药大学 | 人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法 |
| CN101182358A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-21 | 长春中医药大学 | 鹿茸胶原的分离纯化制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 梅花鹿胎衣中蛋白质的提取分离;刘朋;《现代食品科技》;20060430;第22卷(第4期);153-155 * |
| 马胎盘提取物对淋巴细胞的免疫调节作用;王晓然;《天然产物研究与开发》;20130615;第25卷(第6期);第822-825，829页 * |
| 鹿角托盘水溶性蛋白的提取分离与鉴定;黄萍;《亚太传统医药》;20100131;第6卷(第1期);28-30 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108014328A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 吴广印 | 一种预防脱发、促进生发物质的配方及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103408634A (zh) | 2013-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103408634B (zh) | 马胎盘水溶性蛋白提取物及其制备方法和应用 | |
| CN101433620B (zh) | 一种龙眼水溶性活性物质及其提取方法和应用 | |
| CN102106873B (zh) | 一种鳄鱼肉提取物及其制备方法和用途 | |
| CN104498425A (zh) | 雪莲干细胞的分离培养方法及在制备抗衰老产品中的应用 | |
| CN103393585B (zh) | 一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法 | |
| CN105722974A (zh) | 全能干细胞的诱导方法、及用该方法制备的全能干细胞 | |
| CN104523547A (zh) | 一种大鲵面膜的制备工艺研究及其使用方法 | |
| KR20150039263A (ko) | 천연 식물 발효 추출물 및 해양 유래 물질을 함유하는 화장료 조성물 | |
| CN115772550A (zh) | 一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法 | |
| CN103960587B (zh) | 一种橡子保健挂面的制备工艺 | |
| CN104543666A (zh) | 一种具有抗辐射功能的复合多糖保健食品及其制备工艺 | |
| CN104473834A (zh) | 蚂蚁提取物作为有效成分在制备化妆品中的应用 | |
| CN103262939A (zh) | 一种源自鸡胚的抗氧化活性混合肽的制备方法 | |
| CN103755417B (zh) | 一种富硒猴头菌菌丝体液体发酵的生产方法 | |
| CN103830280B (zh) | 一种螺旋藻提取物的制备方法 | |
| CN101766662B (zh) | 一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺 | |
| CN205115437U (zh) | 一种虫草酒加工装置 | |
| CN106172255B (zh) | 一种提高水蛭体内水蛭甲素含量的方法 | |
| CN101638444A (zh) | 海滨锦葵多糖制备工艺及用途 | |
| CN103392747A (zh) | 一种白芍提取物的应用 | |
| CN109260070A (zh) | 一种芍药原花青素低温处理工艺及其应用 | |
| CN109874891A (zh) | 一种防治高血压的植物茶 | |
| CN107897808A (zh) | 一种牡丹酵素果冻制备方法 | |
| CN107114745A (zh) | 一种枸杞多糖果蜜及其制备方法和应用 | |
| CN102286450B (zh) | 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |