CN108142939A - 一种含胎盘干细胞因子的口服液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含胎盘干细胞因子的口服液及其制备方法。本发明的含胎盘干细胞因子的口服液选用动物胎盘为原料,经预处理后保留羊膜和绒毛膜,将保留物净化消毒,再经过酸处理、静析浓缩,混合成最终物料,此物料均质后,经裂解、矫味乳化,制备成一种可口服的含胎盘干细胞因子的组织裂解液,作为一种特殊膳食用食品,具体作为一种特殊医学用途配方食品。本发明口服液能够满足特殊人群的营养需求,制备方法克服了产品的安全性、有效性、稳定性以及剂型、配方等问题,适合产业化生产。

Description

一种含胎盘干细胞因子的口服液及其制备方法
技术领域
本发明涉及特殊膳食用食品领域,具体涉及特殊医学用途配方食品领域,尤其涉及一种含胎盘干细胞因子的口服液及其制备方法。
背景技术
胎盘是哺乳动物母体与胎儿间进行物质交换的器官,是胚胎与母体组织的结合体,主要由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成。胎盘含有丰富的和高效的营养物。近年来,随着研究的深入,已经能够在脐血、脐带、胎盘等组织中提取培养各种干细胞,其中胎盘有"干细胞宝库"之称,是宝贵的生命资源。
干细胞因子是一类具有广泛生物学活性的细胞因子,活体研究表明,干细胞因子在再障等骨髓功能抑制性疾病中有良好的应用前景,造血干细胞在其发育的各个阶段均表达干细胞因子受体,因此,干细胞因子在促进造血和造血调节方面发挥着重要的作用。还有研究表明,某些急性髓细胞白血病(AML)细胞也表达干细胞因子受体,提示干细胞因子对此类白血病的发病有重要作用。干细胞因子在抗急性辐射损伤和基因治疗方面同样展现了良好的应用前景。有研究证实,干细胞因子对受电离辐射照射后的动物或人的造血恢复具有非常明显的作用。
干细胞因子是人类最重要的造血生长因子之一,是机体难以获取的功能性营养物质。作为造血类生长因子,特别是对早期造血细胞的发育生长有重要作用。天然的干细胞因子来源有限,难以大规模生产,虽然基因工程表达干细胞因子的研究已经完成,但未见规模化生产。因此,市场尚不能满足日益增长的临床需要,国内外都在加强相关的研究与开发力度。
虽然干细胞因子的药理药效明显而可靠,但把干细胞因子开发成临床药品且已上市的实例极少,其主要原因是受制于产业化技术。基因工程干细胞因子虽已问世,但成为药品还存在以下问题:一是产业化程度低,成本过高;二是通过发酵表达的干细胞因子纯化过程复杂,或杂蛋白含量过高,临床应用可能存在不良反应;三是作为成药的制剂、配方、稳定性、药代动力学方面等尚有需要进一步探讨的课题。而非基因工程法制备干细胞因子的技术没有形成,因此,干细胞因子真正意义的临床应用还有较长的路要走。
在我国,因放疗、化疗、骨骼疾病及其他原因而致的贫血症患者数量十分庞大,有人估计超过1000万人。这个特殊的群体在接受临床治疗的同时,迫切需要一种食补(疗)方法,仅以饮食的方式,摄取所需的特殊营养物质,从而产生具有特定功能的生理作用,以减轻病症,并改善治疗效果。然而,通过饮食补充干细胞因子的膳食用食品(包括口服液)在国内未见面市。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出了一种含胎盘干细胞因子的口服液,作为一种特膳食品,满足特殊人群的营养需求。
本发明的第二发明目的在于提出了该含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,该方法克服了产品的安全性、有效性、稳定性以及剂型、配方等问题,适合产业化生产。
为了实现本发明的目的,采用的技术方案为:
一种含胎盘干细胞因子的口服液,其特征在于,所述口服液选用动物胎盘为原料,经预处理后保留羊膜和绒毛膜,将保留物净化消毒,再经过酸处理、静析浓缩,混合成最终物料,此物料均质后,经裂解、矫味乳化,制备成一种可口服的含胎盘干细胞因子的组织裂解液,作为一种特殊膳食用食品。
本发明的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,包括以下步骤:胎盘预处理→羊膜、绒毛膜净化消毒→羊膜、绒毛膜酸处理→羊膜、绒毛膜静析浓缩→羊膜、绒毛膜均质→均质液裂解、矫味乳化→检验→口服液成品。
其制备方法具体为:
(1)胎盘预处理:称取胎盘原料,清洗后分离出胎盘羊膜和绒毛膜,处理成块状;
(2)羊膜、绒毛膜净化消毒:将羊膜、绒毛膜清洗后分别用含有双抗的无菌生理盐水浸渍消毒,之后用灭菌生理盐水清洗;
(3)羊膜、绒毛膜酸处理:用次氯酸溶液酸化羊膜、绒毛膜;
(4)羊膜、绒毛膜静析浓缩:无菌条件下,将羊膜、绒毛膜分别装入已消毒的容器,密封容器口,移至2~8℃恒温浓缩车间,分别静置存放60~150日;
(5)羊膜、绒毛膜均质:将羊膜、绒毛膜清洗后按质量比1:9混合成最终物料,再将此物料制成组织匀浆液;
(6)均质液裂解、矫味乳化:组织匀浆液中添加0.02~0.05%(V/V)甜菊糖甙裂解、乳化;
(7)检验:按酶标法(ELISA)检验裂解液的主要有效成分。
所述步骤(1)中,胎盘预处理过程为:定量称取胎盘原料,清洗后分离出胎盘羊膜和绒毛膜,分别将其处理成1.5×1.5cm块状;处理后的羊膜、绒毛膜按比例加入去离子水在2~8℃下分别溶血24小时,其间每隔6小时搅动1次;溶血后用去离子水清洗。
所述步骤(2)中,羊膜、绒毛膜净化消毒过程为:将羊膜、绒毛膜用去离子水清洗后,分别用含有双抗的无菌生理盐水浸渍消毒,15~20℃下浸渍12个小时;然后取出羊膜、绒毛膜用灭菌生理盐水清洗。
其中,所述双抗为青霉素500~1000U/L,链霉素300~500U/。
所述步骤(3)中,羊膜、绒毛膜酸处理过程为:按比例分别取羊膜、绒毛膜、pH为3.0的次氯酸溶液置于消毒后的容器内,15~20℃下酸处理24小时,期间每6小时搅动1次,之后更换液体重复上述酸处理过程2次;酸处理后用孔径0.5~1.0mm的筛筛分出羊膜、绒毛膜组织,甩干酸处理液,以蒸馏水清洗至清洗液的pH值到4.0。
其中,在步骤(3)中所述的酸化时羊膜与次氯酸溶液比例为1:3(W/V);绒毛膜与次氯酸溶液比例为1:3(W/V),所述的酸化后置于消毒后的容器内时要先加次氯酸溶液,后加羊膜或绒毛膜。
其中,在步骤(5)中使用超高速组织均质机将物料制成组织匀浆液,物料与注射用水的质量比为1:6~9;匀质时间为15~30min,工作温度为15~20℃,转速≥8000rpm。
其中,在步骤(6)中所述裂解、乳化条件为超高速裂解剪切机,温度15~20℃,转速10000~12000rpm,裂解、乳化2次,每次15~30min。
其中,在步骤(7)按酶标法(ELISA)检验裂解液的主要有效成分,所述口服液主要成分含量为:干细胞因子≥35ng/mL,蛋白质2.5~3.5mg/ml,氨基酸2.5~3.5mg/ml,以干细胞因子为功能成分及标示物。
胎盘干细胞因子口服液是一种组织裂解液,含有功能性营养素—胎盘干细胞因子,其它主要成分蛋白质、氨基酸,还有多种能与干细胞因子产生增效作用的其它细胞因子(如白介素等),因而其产生特定生理作用的效果更好。
本发明的有益效果在于:
第一,本发明结合生物化学与局域超高压、强力剪切等物理强化条件,同时实现对组织与大分子蛋白质的降解处理,在保护物料原有的生物活性成分不被破坏的同时,获取小分子胎盘干细胞因子和其他营养成分;
第二,本发明涉及的技术克服了产品的安全性、有效性、稳定性以及剂型、配方等问题,适合产业化生产。
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明,并不对本发明的内容构成限制。
实施例1
本发明是通过以下技术方案实现的。
(1)胎盘的筛选及其标准化:
称取山羊胎盘原料5kg,先用清水清洗,再按比例(W/W,1:3)加去离子水清洗后分离出胎盘羊膜和绒毛膜,并分别将其剪成1.5×1.5cm的块状。剪碎后的羊膜、绒毛膜按比例(W/W,1:7)加入去离子水在2~8℃下分别溶血24小时,其间每隔6小时搅动1次。溶血后按重量的3倍用去离子水清洗。
羊胎盘的筛选方法为:
A:动物健康检查
动物健康检查,即屠宰前检查。为取得健康羊胎盘,对供体羊群的健康状况进行准确评估,方法是依据当地的“畜群健康标准”并结合个体抽检进行评估,确认供体羊健康。
①畜群健康标准主要评价标准有以下5条:
--畜群主要生产性能(胴体重、产羔率、羔羊成活率、出栏率)不低于所在地平均水平(-10%);
--病死率、淘汰率和流产率不高于当地平均水平(+10%);
--有明确的免疫程序和免疫标识制度,接种密度达到100%;
--有完整的畜群健康管理程序;
--有良好的兽医保障体系。
②个体抽检
根据羊群大小随机抽取5~10%待宰羊只,按以下项目逐项检查:被毛有无光泽、可视粘膜是否正常,精神状态、呼吸是否均匀,皮肤有无结痂、鼻镜干湿状况、有无分泌物,食欲是否正常、营养状况,体温、体表淋巴结等是否正常,排便是否正常。
③判定标准
畜群健康标准5条符合,个体抽检包括体温在内的90%的指标合格,即判为合格,认定羊群健康。
B:质量标准
新鲜胎盘淡红色,无异味、赘生物,无创伤、变色或腐败,手感柔软无结节。子叶饱满,直径≥1.0cm,母体子叶和胎儿子叶结合完好,分离子叶数不超过子叶总数的10%。单只胎盘的重量应为800~1100g。
C:羊布鲁氏病检验法
3批供试胎盘各取样10g,剪成块状(1×1cm),加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后,取出胎盘组织,所留液体摇匀,各取1ml混匀。豚鼠3只皮下注射1.0ml/只,3~4周后剖杀豚鼠,如脾脏、肝脏与肾脏出现炎性坏死小病灶,并在脾脏、淋巴结涂片中找到病原体,可判为阳性。
D:结核病检验法
3批供试胎盘各取样10g,剪成块状(1×1cm),加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后,20日。
若无菌生长判为阴性。若有呈黄白色颗粒状、干燥、革兰氏染色阳性的菌落生长,判为阳性。
E:口蹄疫检验法
3批供试胎盘各取样10g,剪成块状(1×1cm),加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后,取出胎盘组织,所留液体摇匀,各取1ml混匀。取2~3日龄的乳鼠4~5只(不少于4只),颈部皮下接种0.1ml/只,连续观察7日,不出现以下症状并全部健活为阴性。
出现下述症状者可判为阳性:后腿运动障碍、进而麻痹,头部不能抬起,呼吸困难,终因心肌麻痹死亡。
F:衣原体检验法
3批供试胎盘各取样10g,剪成块状(1×1cm),加等量灭菌生理盐水分别浸泡30min后,取出胎盘组织,所留液体摇匀,各取1ml混匀。接种于小白鼠腹腔内(0.5ml/只),如全部健活可判为阴性;若接种动物在7~10日内死亡,取脾、肺、肝制涂片检查,检出衣原体和嗜硷性包涵体可判为阳性。
(2)羊膜、绒毛膜净化消毒:将羊膜、绒毛膜按重量的3倍加入去离子水清洗后,分别用含有双抗(青霉素500~1000U/L;链霉素300~500U/L)的无菌生理盐水浸渍消毒,15~20℃下,浸渍12个小时。之后,取出羊膜、绒毛膜用灭菌生理盐水洗2次;
(3)羊膜、绒毛膜酸处理:按比例分别称取羊膜、绒毛膜、次氯酸溶液(pH 3.0),其中羊膜:次氯酸溶液1:3,W/V;绒毛膜:次氯酸溶液1:3,W/V;置于消毒后的容器内(先加入次氯酸溶液,后加羊膜或绒毛膜),15~20℃下酸处理24小时,期间每6小时搅动1次,之后更换液体重复上述酸处理过程2次。酸处理后用筛分法(孔径0.5~1.0mm)取出羊膜、绒毛膜组织,甩干酸处理液,以蒸馏水清洗至清洗液的pH值到4.0为止;
(4)羊膜、绒毛膜静析浓缩:无菌条件下,将羊膜、绒毛膜分别装入已消毒的容器,密封容器口,移至恒温浓缩车间。在恒温(2~8℃)浓缩车间(净化级别:万级),羊膜、绒毛膜分别静置存放100日,使干细胞因子得到充分的生成、游离、释放与浓缩;
(5)羊膜、绒毛膜均质:
①羊膜、绒毛膜配比:完成静析浓缩后的羊膜、绒毛膜用注射用水清洗2次。羊膜、绒毛膜按1:9(W/W)混合成最终物料,备用。
②物料均质:使用超高速组织均质机(转速≥8,000rpm)将物料制成组织匀浆液。主要技术参数:物料与注射用水的质量比为1:8;均质时间为20min,工作温度为20℃
(6)均质液裂解、矫味乳化:上述组织匀浆液中添加0.03%(V/V)甜菊糖甙,用超高速裂解剪切机在20℃、10000rpm的条件下裂解、乳化2次,每次20min。
(7)检验:按酶标法(ELISA)等方法检验裂解液的主要有效成分,其含量为:(1)干细胞因子40ng/mL;(2)蛋白质3.0mg/ml;(3)氨基酸3.0mg/ml,以干细胞因子为功能成分及标示物。
其中干细胞因子含量检验方法酶标法(ELISA)为:
A标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μL,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μL,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μL分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉,再各取50μL分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μL分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μL,混匀后从第七、第八孔中分别取50μL加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μL,混匀后从第九第十孔中各取50μL弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μL,浓度分别为480ng/L,320ng/L,160ng/L,80ng/L,40ng/L)。
B加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
C温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
D配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
E洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
F加酶:每孔加入酶标试剂50μL,空白孔除外。
G温育:操作同C。
H洗涤:操作同E。
实施例2
羊膜、绒毛膜静析浓缩时,分别静置存放60日;均质裂解时,物质与注射用水的质量比为1:7,其余同实施例1。
实施例3
羊膜、绒毛膜静析浓缩时,分别静置存放150日;均质裂解时,物质与注射用水的质量比为1:9,其余同实施例1。
本口服液的疗效观察:
1.病例选择:
选择放疗、化疗后造血机能未恢复,有贫血症状的病例41个,其中,男性25人,女性16人。
2.治疗方法:
使用时,每日口服3次,每次10-20毫升。按照疗程口服。3个月1个疗程。
3.疗效评定标准:
治愈:症状消失,功能完全或基本恢复正常,观察半年疗效巩固者。
显效:原症状大部分消除,功能大部分恢复。
有效:原症状部分改善,功能部分恢复。
无效:原症状无变化或无明显变化。
4.结果统计:
在41个病例中,服用本发明所述胎盘干细胞因子口服液三个疗程后,治愈26例,治愈率占63.4%,好转12例,显效率占29.3%,总有效率为92.7%,无效3例,无效率占7.3%。作为一种辅助治疗的特膳食品,具体作为特医食品取得了较好的疗效。

Claims (10)

1.一种含胎盘干细胞因子的口服液,其特征在于,所述口服液选用动物胎盘为原料,经预处理后保留羊膜和绒毛膜,将保留物净化消毒,再经过酸处理、静析浓缩,混合成最终物料,此物料均质后,经裂解、矫味乳化,制备成一种可口服的含胎盘干细胞因子的组织裂解液。
2.一种如权利要求1所述的含胎盘干细胞因子的口服液,其特征在于,所述口服液功能成分及标示物胎盘干细胞因子含量≥35ng/mL。
3.一种如权利要求2所述的含胎盘干细胞因子的口服液,其特征在于,所述口服液其它主要成分含量为:蛋白质2.5~3.5mg/ml,氨基酸2.5~3.5mg/m。
4.一种如权利要求1所述的含胎盘干细胞因子的口服液,其特征在于,所述动物为绵羊、山羊、鹿。
5.一种如权利要求1所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:胎盘预处理→羊膜、绒毛膜净化消毒→羊膜、绒毛膜酸处理→羊膜、绒毛膜静析浓缩→羊膜、绒毛膜均质→均质液裂解、矫味乳化→检验→口服液成品。
6.根据权利要求5所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)胎盘预处理:称取胎盘原料,清洗后分离出胎盘羊膜和绒毛膜,处理成块状;
(2)羊膜、绒毛膜净化消毒:将羊膜、绒毛膜清洗后分别用含有双抗的无菌生理盐水浸渍消毒,之后用灭菌生理盐水清洗;
(3)羊膜、绒毛膜酸处理:用次氯酸溶液酸化羊膜、绒毛膜;
(4)羊膜、绒毛膜静析浓缩:无菌条件下,将羊膜、绒毛膜分别装入已消毒的容器,密封容器口,移至2~8℃恒温浓缩车间,分别静置存放60~150日;
(5)羊膜、绒毛膜均质:将羊膜、绒毛膜清洗后按质量比1:9混合成最终物料,再将此物料制成组织匀浆液;
(6)均质液裂解、矫味乳化:组织匀浆液中添加0.02~0.05%(V/V)甜菊糖甙裂解、乳化;
(7)检验:按酶标法(ELISA)检验裂解液的主要有效成分。
7.根据权利要求6所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,在步骤(2)中所述浸渍消毒条件为15~20℃下浸渍12个小时;所述双抗为青霉素500~1000U/L,链霉素300~500U/L。
8.根据权利要求6所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述酸化过程为:按比例分别取羊膜、绒毛膜、pH为3.0的次氯酸溶液置于消毒后的容器内,15~20℃下酸处理24小时,期间每6小时搅动1次,之后更换液体重复上述酸处理过程2次;酸处理后用孔径0.5~1.0mm的筛筛分出羊膜、绒毛膜组织,甩干酸处理液,以蒸馏水清洗至清洗液的pH值到4.0;所述的酸化时羊膜与次氯酸溶液比例为1:3(W/V);绒毛膜与次氯酸溶液比例为1:3(W/V),所述的酸化后置于消毒后的容器内时要先加次氯酸溶液,后加羊膜或绒毛膜。
9.根据权利要求6所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,在步骤(5)中,使用超高速组织均质机将物料制成组织匀浆液,物料与注射用水的质量比为1:6~9;匀质时间为15~30min,工作温度为15~20℃,转速≥8000rpm。
10.根据权利要求6所述的含胎盘干细胞因子的口服液的制备方法,其特征在于,在步骤(6)中所述裂解、乳化条件为超高速裂解剪切机,温度15~20℃,转速10000~12000rpm,裂解、乳化2次,每次15~30min。
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