CN103405748B - 全新的双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全新的双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物。所述的释放组合物，在注射前为两种纳米粒的混合粉末，在人体内最终注射后形成目标组合物，其组成包括活性物质醋酸艾塞那肽的PLGA纳米粒，外包裹层骨架材料PLG-PEG。组合物在至少2周时间持续稳完的释放药物，无突释现象。

Description

全新的双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物

技术领域

本发明涉及多肽药物的长效制剂的新组合物，尤其涉及以艾塞那肽为治疗核心药物，技术要点包括组合物的组成及制备工艺。

背景技术

Exendin-4是南美洲大毒蜥的唾液中分离出来的一种由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽。Exendin-4与胰高血糖素样肽1(GLP-1)有53％的同源性。分子量：4186.6道尔顿，分子式：C₁₈₄H₂₈₂N₅₀O₆₀S。

exenadin临床用途为联合磺酰脲类或/和二甲双胍类或噻唑烷酮类药物用于控制或治疗II型糖尿病血糖。II型糖尿病发病机理主要体现为外周胰岛素抵抗(一般不是单独因素)和胰岛β-细胞功能的渐进性衰竭两个方面。胰岛β细胞促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌(葡萄糖浓度依赖性)，艾塞那肽可以刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。并且通过抑制食欲和胃排空运动，抑制营养的过度摄入，降低糖尿病患者体重，从而减少心血管等并发症。艾塞那肽相对人体自有的胰高血糖素样肽1(GLP-1)，活性是GLP-1的500～1000倍。据最近的流行病学调查显示，在发达国家，糖尿病居死亡主要原因第四位，居致盲和眼部损害以及截肢原因的首位。我国糖尿病患病人数超过4000万人，患病人数仅次于印度，位于世界第二。目前我国糖尿病发病率为3.21％，增长率：100万人口数/年。

迄今为止，市场上关于艾塞那肽的制剂分为两种，一种为普通短效注射液，商品名为Byetta，05年获FDA批准，为每日给药2次，频繁的给药使患者顺应性差；一种为醋酸艾塞那肽长效微球注射剂，商品名为Bydureon，为每周给药1次，但注射进入体内后，并不是立即释放，而是存在2～3周的延滞期，延滞期过后微球才开始释放，并且需要多次注射之后，利用不同次注射在体内所释放药物的累积作用方能在数周后达到治疗浓度，每次注射微球在皮下堆积分布差异大，导致注射后个体AUC差异大，此外，粒径较大，给药过程患者有显著的疼痛与恐惧感。

本新型缓释剂克服了上述已上市的艾塞那肽短效注射剂和微球长效注射剂的不足。

发明内容

本新型缓释剂与已上市的艾塞那肽微球相比，具有若干优势：在完成首次皮下注射后，随后的2-4天内，释放装置即开始释放药物，并且在5天内达到治疗浓度；更长的药物释放时间，给药频率为1次/月，减少病人高频率给药的痛苦；注射状态为纳米粒悬液，可以通过尖端外径0.2mm注射针，痛感不明显，提高了患者临床使用顺应性；本发明利用外层骨架材料在体内的重新固化，使得缓释装置在体内的配置更加均一，有效的减小了个体差异。

本发明所涉及的长效醋酸艾塞那肽释放组合物是一种全新的缓释释放组合物。释放组合物通如下过程形成：将活性多肽醇溶液和纳米粒骨架材料聚合物溶液在没有其他乳化剂存在的情况下，通过高压乳化形成均质的纳米乳液，纳米乳液再通过高压喷口雾化喷入低温的庚烷中，固化形成纳米粒。另外将外层骨架材料PLGA-PEG的醇水混合溶液通过另外的高压喷口雾化喷入同一低温庚烷溶液中。通过无菌管路将纳米粒通过阿法拉伐纳米过滤装置收集庚烷中的纳米颗粒，滤除弃去溶液，在低压氦气气氛保护下加热，除去相关的溶剂，得到纳米粉组合物。在组合物给药前，将纳米粉组合物及溶剂放入4度冰箱内遇冷10分钟以上，溶剂为乙醇和水的混合溶液。预冷后将溶剂注入装有两种纳米粒的西林瓶，放入4度冰箱，约10分钟后，PLGA-PEG纳米粒溶解，将西林瓶由冰箱内取出，与水平呈4度缓慢旋转，形成可注射的纳米粒水凝胶悬浮溶液。纳米悬浮液可以通过0.2mm的针头通过皮下或肌肉给药，注入后受体温加热以及溶液被吸收，温度敏感特性的PLG-PEG由液体转化为固体，并将纳米粒包裹其中，即形成最终的目标组合物。注射后组合物可以在4周以上的时间里持续稳定的释放艾塞那肽；PLG-PEG外层聚合物有效的进行了突释的控制；防止药物与酶的直接接触，降低了未释放药物降解速率；相对常规的注射微粒，组合物在生物体不同个体的注射部位的堆积更加一致，减小了个体差异；药物释放也更加稳定。给药装置可以更小直径针头注射，减少病患对微球制剂和植入制剂给药过程的恐惧与痛苦。

新型缓释剂的突释是由于纳米球在固化形成颗粒的过程中，有醋酸艾塞那肽溶液的乳滴停留在纳米球表面所形成的。突释效应造成在短时间内释放出大量的药物，使体内的血药水平陡然升高，产生不良反应。

本发明制备的新型缓释剂是几乎没有一般储库型缓释制剂的突释显现的。一方面，通过纳米乳向聚合物中分配醋酸艾塞那肽的方法，减少表面附着药物，突释降低。另一方面，使用时，将纳米球与聚乳酸水凝胶混悬，当注射到人体后，在体温状态下凝固，水凝胶把纳米球包裹在内，在药物与体液之间形成了隔离层，随着聚乳酸的不断溶胀、降解纳米球中药物释放出来，在最初的时间里几乎无药物释放出来。

附图说明

图1、实施例一艾塞那肽释放组合物在37摄氏度形成后的状态显微镜照片。

图2、实施例六艾塞那肽释放组合物体外释放曲线。

图3、实施例六艾塞那肽纳米粒粒径对释放装置体外释放度的影响。

图4、实施例六PLGA分子量对体外释放速度的影响。

图5、实施例六PLA-PEG占释放装置质量比对释放的影响。

图6、实施例七单次给药后体内释放曲线。

图7、实施例七多次给药后体内释放曲线。

图8、实施例八一次注射后HbA1浓度。

图9、实施例八一次注射后血糖浓度。

图10、实施例十释放度变化趋势图。

图11、实施例十纯度变化趋势图。

图12、实施例十粒径变化趋势图。

具体实施方式

一、工艺实施

1、乳液制备

称量5克醋酸艾塞那肽溶于50克乙醇与水的混合溶液，乙醇与水质量比为9∶1。称量75克PLGA溶于750克乙酸乙酯与丙酮的溶液，乙酸乙酯和丙酮的质量比为9∶1，磁力搅拌器搅拌溶解。将用细管艾塞那肽溶液加入PLGA溶液中，边加边采用高速均质机IKA T-50型匀浆乳化3min，乳化温度温度为5℃，取样采用贝克曼的LS 13 320型激光粒度仪进行分散状态检测，最大粒径不大于40纳米，如不满足要求，可以使用T-50再次乳化3分钟，直至形成符合要求的稳定乳液。将乳液放入4℃冰箱静置5min。

2、高压喷雾

量取20升无水乙醇液体于不锈钢罐，采用冷机预冷至零下30摄氏度。采用高压喷雾器，将乳液通过管道喷入预冷的乙醇溶液，喷雾压力为2.3bar。同时以1000转每分钟的速度对罐内的悬液搅拌，乳液完全由喷嘴喷入乙醇溶液后，在持续搅拌30分钟。采用阿法拉伐的纳米过滤装置，对悬浮液内的纳米粒进行回收。在真空箱内干燥24小时，真空度为100Pa。

3、聚乳酸水凝胶的配制

称量聚乳酸(PLGA-PEG)水凝胶20克，溶于180克溶剂，溶剂为水与N-甲基吡咯烷酮(95∶5)混合溶液，磁力搅拌器在室温下，边添加边搅拌，约8小时后完全溶解。

4、PLGA-PEG纳米粒的喷雾干燥

将配制的PLGA-PEG溶液，通过GEA Niro喷雾干燥机进行喷雾干燥，并对形成的纳米粒进行回收。

5、分装

将形成的艾塞那肽-PLGA纳米粒与PLGA-PEG纳米粒，按照质量比4∶1的比例混合，采用混合器混合均匀。对混合后的粉体，进行多点的取样，具有相同的艾塞那肽载药量，约为5％。载药量为艾塞那肽在混合纳米粒的中所占的质量比例。采用螺杆式分装机，按6mg艾塞那肽每瓶进行分装。

载药量的检测方法

称量样品100mg，全部转移到100ml量瓶中，加四氢呋喃20ml，密塞，振摇使溶解，加稀释溶液，加水溶解并稀释至100ml，摇匀稀释至刻度，摇匀，放置20分钟，使大分子沉淀，用滤膜(如Millex HV0.45μm)滤过，精密量取续滤液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。另精密量取艾塞那肽对照品适量，加稀释溶液制成每1ml中含50μg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

载药量＝样品峰面积/对照品峰面积*对照品峰浓度*样品溶液体积(100ml)/样品称量量*100％

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-1mol/L氢氧化四甲基铵溶液-水(100∶20∶880)并用磷酸调节pH值至2.5的溶液作为流动相A，乙腈-1mol/L氢氧化四甲基铵溶液-水(400∶20∶580)并用磷酸调节pH值至2.5的溶液作为流动相B，乙腈-1mol/L氢氧化四甲基铵溶液-水(800∶20∶180)并用磷酸调节pH值至2.5的溶液作为流动相C，按以下梯度法进行洗脱，流速为每分钟1.7ml。

检测波长为210nm。艾塞那肽主峰保留时间应在11分钟左右。

项目	载药量
		标准	5.0％
SC-776	5.12％
		SC-777	5.23％
SC-778	5.08％

6、注射实施

在2-8℃储存。使用前将纳米粉组合物及溶剂放入4度冰箱内遇冷10分钟以上，溶剂为乙醇和水的混合溶液。预冷后将溶剂注入装有两种纳米粒的西林瓶，放入4度冰箱，约10分钟后，PLGA-PEG纳米粒溶解，将西林瓶由冰箱内取出，与水平呈4度缓慢旋转，形成可注射的纳米粒水凝胶悬浮溶液。纳米悬浮液可以通过0.2mm的针头通过皮下或肌肉给药，注入后受体温加热，温度敏感特性的PLG-PEG由液体转化为固体，并将纳米粒包裹其中，既形成最终的目标组合物形成。

二、本发明中工艺参数对纳米粒粒径的影响

在本发明中，无论是艾塞那肽纳米粒或是PLA-PEG纳米粒，通过对聚合物的雾化的方法获得的。纳米粒的粒径大小与雾化过程中的工艺参数相关。主要体现三个方面：1、所需雾化的溶液的黏度。2、雾化时采用压缩空气的压力。3、雾化设备喷嘴的大小。所述的溶液黏度取决于在聚合物溶液溶质浓度，包括所采用溶剂的种类、溶质的浓度、采用聚合物的分子量、多肽溶液及多肽溶液和雾化时温度，所影响的聚合物溶液的黏度，黏度越大，纳米粒的粒径越大。雾化时雾化器所给予液体的压力，压力越大纳米粒的粒径约小，而压力与雾化时的压缩空气压力成正比，与雾化设备的喷嘴大小成反比。

在本发明中，经典的黏度为52(m^2)/s。这种溶质的综合指标为将10％(m/m)的醋酸艾塞那肽的乙醇和水的混合溶液，其中乙醇和水的比例为9∶1，上述溶液分散于10％(m/m)的4A型号(美国lakeshore)公司的乙酸乙酯和丙酮的混合溶液。在上述溶液中，所采用的溶剂为乙酸乙酯和丙酮的混合溶液，不同以外采用二氯甲烷等溶液。在此溶液中，相同的溶质溶度可以具备相对低的黏度，以提供更佳的雾化性能。在此溶液中，溶液的黏度随PLGA的分子量的大小呈显正影响的改变，PLGA型号的确定取决于所需释放周期而选择为美国lakeshore公司的4A，分子量为57KD，共聚物乙交酯和丙交酯的比例为50∶50。在本经典溶液中，溶液黏度的调节主要对PLGA在乙酸乙酯和丙酮混合液的浓度实现。

下表展示在恒定压力(2.3bar)雾化时，雾化液黏度对纳米粒的粒径影响。通过马尔文ZS90激光粒度仪进行检测。

三、有机试剂残留量控制

在经典的工艺过程中，三个环节对有机试剂去除，1、雾化过程的真空或加热环境，2、雾化后喷入乙醇冷溶液的萃取作用、3、100pa真空干燥24小时。

根据ICH的关于相关溶剂的安全限度的规定，结合本缓释装置160mg的装量预测，规定了个残留溶剂的标准。依照经典的工艺流程考察溶剂溶质方法的可行性。通过中国药典2010版附录VE气相色谱法进行检测。

溶剂	丙酮	乙酸乙酯	乙醇
				标准	0.5％	0.5％	0.5％
SC-776	0.12％	0.21％	0.05％
				SC-777	0.15％	0.25％	0.06％
SC-778	0.14％	0.25％	0.05％

四、制剂的注射性能：

本缓释装置在生产后为2ml西林瓶中承载的160mg的干粉，在实施给药时，采用1ml的乙醇和水的混合溶液(质量比9∶1)对持续释放装置的PLA-PEG纳米粒进行溶解，进而形成具有黏性的PLA-PEG水溶液结合艾塞那肽纳米粒的悬浮溶液。在实施注射前，倾斜西林瓶45度，轴向旋转，以确保悬浮溶液的形成。连续进行100次的该悬浮溶液的肌肉注射，没有出现注射不畅，或者是针头堵塞的情况。

五、制剂给药的精确性：

将制剂的注射性能项下，注射器及相应的西林瓶内的纳米球进行回收，并通过差重法对注射的剩余量进行测试。在所有进行的100次的注射试验中，最大残留量为8.16mg(0.051％)，最低残留量为6.08mg(0.038％)，均值为7.85mg(0.049％)

六、体外释放试验：

精密称定少量纳米球干粉与聚乳酸水凝胶混匀，在低温条件下近于澄明溶液，然后将溶液注入分子量为20000道尔顿的透析袋中，两端扎紧。将透析袋放入50ml三角瓶中，内部装有25ml中性释放液，三角瓶放入恒温振荡培养箱中释放，转速为每分钟60转，溶液温度保持在37±0.5℃，每个时间点取出20ml溶液，再另外补加空白中性释放液20ml，计算每次释放量时除去上个时间点的释放剩余量，所取溶液用滤膜(Millex HV0.45um)滤过，精密量取10μl，照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)检测。

艾塞那肽纳米粒均粒径对释放装置释放情况的影响

在本装置的组合物中，艾塞那肽纳米粒的大小，对于组合物的释放特性在一定的粒径范围内不产生显著的影响，体现出组合物的质量耐用性。艾塞那肽纳米粒平均粒径为100纳米、150纳米、200纳米、250纳米、300纳米结合于组合组后所获得的相对一致的体外释放释放曲线。

此外考察了艾塞那肽纳米粒的骨架材料PLGA的分子量对释放装置释放情况的影响

在本发明中，结合已完完成的验证试验，PLGA-PEG纳米粒的所占持续释放装置的比重，不应低于10％或高于30％，在15％-25％的范围内，聚合物的释放曲线趋势是一致。当PLGA-PEG纳米粒的比重低于10％时，释放装置在体内的固化过程中，存在内部艾塞那肽纳米粒暴漏的风险，进而提高了释放装置产生突释的风险。相反的，当PLGA-PEG纳米粒的质量比高于30％的情况，内层的艾塞那肽纳米粒将被过度的包裹，在注射后的一段时间内，多肽由释放装置内释放难度增加，影响制剂的起效时间。

七、动物体内释放试验

本发明制备的新型缓释剂在一定时间内能够平稳的释放，维持较长治疗作用时间，减少给药次数，降低了不良反应。例如，以Beagle犬为研究对象，后肢股二头肌皮下注射，前肢静脉取血，经过处理后按照血浆中艾塞那肽的elisa测定方法，测定不同时间点血浆中药物浓度。

动物给药方案如下：

实验动物：Beagle犬，雌雄各半，体重10.0(1.0kg。

给药途径：根据临床拟用给药途径，本试验采用犬后肢皮下注射。

给药方法：将犬固定在试验台上，给药部位剃毛标定位注射点，于皮肤消毒后以兽用注射针头(0.2mm)和2ml注射器，左后肢皮下注射。

给药剂量：根据临床常规剂量按人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表计算，根据预试验结果，确定剂量为0.83mg艾塞那肽/kg(为人临床常规剂量10mg)。

样品采集与处理：不同时间点在前肢静脉取血3ml，放入含肝素钠45U的离心试管中，摇匀，放入高速离心机中，以3500rpm离心20分钟，吸取上层血浆即得。

检测方法：采用R&D的elisa检测试剂盒。

溶液的配制：

包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)：称取0.32g碳酸钠、0.586g碳酸氢钠，用水溶解并稀释至200ml。

PBS(PH7.4)：称取8.0g氯化钠、0.20g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、加水溶解并稀释至1000ml，121℃灭菌15min。

洗涤液(PBS-Tween20)：量取0.5ml聚山梨酯20，加PBS稀释至1000ml。

稀释液：称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。

封闭液：称取牛血清白蛋白1.0g，用洗涤液溶解并稀释至100ml。

底物缓冲液(枸橼酸-PBS)：称取0.51g枸橼酸、1.84g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解并定稀释至100ml。

底物液：称取8mg邻苯二胺、30％过氧化氢溶液30μl，溶于20ml底物缓冲液中。临用前配制。

终止液：1mol/L硫酸。

I抗试液(艾塞那肽)：取艾塞那肽适量加入包被液中，使其浓度为0.8μg/ml。

II抗试液(IgG-HRP)：取II抗5μl加入20ml稀释液中(即1∶4000稀释)

操作步骤：

包被微孔板：用八道移液器吸取已配好的上述I抗试液加入到微孔板的小孔中，每孔100μl。加盖后放入4℃冰箱中过夜(16～18小时)。

洗涤微孔板：取出包被好的微孔板，甩净小孔内的液体，加入洗涤液350μl，静置5min后，甩净小孔内的液体并拍干微孔板，如此洗板三次，洗后将板在滤纸上拍干，保证没有残液。

封闭微孔板：用八道移液器吸取已配好的封闭液加入到微孔板的小孔中，每孔200μl。加盖后放入37℃培养箱中2h。

洗涤微孔板：取出封闭好的微孔板，甩净小孔内的液体，加入洗涤液350μl，静置5min后，甩净小孔内的液体并拍干微孔板，如此洗板三次，洗后将板在滤纸上拍干，保证没有残液。

孵育标准品和样品：取配好的标准品溶液做标准曲线，用稀释液做阴参，另做空白对照，加入标准品溶液和样品溶液，每孔100μl，加好后加盖放入37℃恒温箱1.0小时。

洗涤微孔板：取出微孔板，甩净小孔内的液体，加入洗涤液350μl，静置5min后，甩净小孔内的液体并拍干微孔板，如此洗板三次，洗后将板在滤纸上拍干，保证没有残液。

加II抗试液：用八道移液器吸取上述已配好的II抗试液加入到微孔板的小孔中(空白孔不加)，每孔100μl，加盖后放入37℃恒温箱30min。

洗涤微孔板：取出微孔板，甩净小孔内的液体，加入洗涤液350μl，静置5min后，甩净小孔内的液体并拍干微孔板，如此洗板三次，洗后将板在滤纸上拍干，保证没有残液。

显色：用八道移液器吸取已配好的底物液加入到微孔板的小孔中，每孔50μl，加盖后在37℃恒温箱中避光放置20min后，取出微孔板，用八道移液器吸取终止液加入微孔板的小孔中，每孔50μl。

读取数据：将微孔板放入酶标仪中，选择492nm波长测定吸光度，应用计算机分析软件进行数据分析。

工作曲线的制备取空白血浆400(l，加入艾塞那肽标准系列溶液100(l，配制成相当于血浆浓度为30，60，120，240，480，960pg/ml的血浆样品，每浓度3样本，制备工作曲线。以血浆中待测物浓度为横坐标，求得的直线回归方程，即为标准曲线。(需要检测数值)

线性范围根据标准曲线，艾塞那肽的线性范围为30-960pg/ml，定量下限为30pg/ml。

准确度与精密度按“工作曲线的制备”项下操作，制备艾塞那肽低、中、高三个浓度(分别为30、120、960pg/ml)的质量控制样品，每浓度6样本，连续测定三天。根据当日的工作曲线，计算样品的测得浓度，根据样品结果计算本法的准确度与精密度。

稳定性考察依据“血浆样品处理”项下方法制备稳定性样品，每浓度三样本，经反复三次20(C冰冻，室温溶解后，测定样品浓度。结果表明：所有冻融试验测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15％。即血浆样品可以进行反复冻融，保障了整个分析过程中的数据真实，可靠。

依据“血浆样品处理”项下方法制备稳定性样品，每浓度三样本，冰冻放置60天后测定样品浓度。结果显示所有长期稳定性试验测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15％(结果见表3)，表明长期冰冻放置血浆样品，不影响本方法对样品浓度进行准确测定。

试验中对8h室温放置处理后的样品(每浓度三样本)进行了稳定性考察，结果显示所有室温放置试验测定值与添加值的相对偏差(RE)均小于15％，说明分析测试过程中的样品较为稳定。

缓释药物组合在体内储存释放过程的保护作用

本发明的制剂，由于双层的骨架材料的存在，尤其是PLA-PEG所形成的空白药物层的存在，提高了骨架材料整体对药物的保护作用。降低了聚合物装置在体内的长期贮存释放过程中，酶类、免疫类细胞对多肽的侵蚀降解。在一组对比试验中，将本发明药物组合和参照专利CN200580019229所描述的工艺制备的艾塞那肽微球，同时进行的大鼠下腹的皮下给药，每组6只大鼠。分别在注射后第1天、第10天、第20天将大鼠皮下残留本发明释放装置和微球进行回收，结合未进行注射的样品做为零时进行如下的操作。用0.5ml的乙腈对微球溶解，并采用含有蛋氨酸的PH5.0的tris缓冲液进行萃取回收，采用反相高效液相色谱色谱对样品纯度进行检测。

新型缓释剂的代表性药代动力学曲线

药代动力学曲线显示了血浆中艾塞那肽浓度在给药后2小时开始释放药物，未大于平台期浓度。并在随后的时间内，血浆中艾塞那肽浓度逐渐升高，且达到治疗平台期后，药物平稳释放。并于此后的3-4周内保持相对稳定。在治疗平台期期内Cmax不大于Cave的2倍，约在第38天后，艾塞那肽的浓度伴随多聚体基质的终末降解相而缓慢下降。

在长达4周的时间里持续释放药物，没有显著的突释现象，体内血药浓度平稳。

数据表格如下：

本发明的体内释放曲线，不同于以往的长效制剂，需要连续的多次给药后，使释放曲线相叠加，才能达到所需的治疗浓度。本发明在首次给药后，既可以是体内的血药浓度达到治疗平台浓度，并且连续给药的衔接段，不产生药物浓度的叠加显现。

八、体内药效试验：

试验动物选取鼠龄6个月，体质量(250±20)g的雌性SD大鼠(N＝20)，采用高糖高脂饲料结合低剂量链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病大鼠模型。通过下腹部皮下注射给药。给药剂量为0.83mgkg人的剂量进行换算。血糖采用ACCU-CHEK血糖仪检测，糖化血红蛋白(AIC)采用。

本产品给药后，糖化血红蛋白及血糖浓度与空白对照组相比，均有理想的降低结果和降糖维持效应。

九、局部安全性试验：

目的：考察皮下给药后对组织细胞有无显著的吸附作用，增殖情况考察，是否有显著

的刺激性，由此对新剂型的安全性进行初步的评价。

动物：SD大鼠

鼠龄：6-7个月，

体重：250±20g

分组：单一载药组

数量：14只，雌雄各半

试药：自制，载药5％

给药剂量：0.83mg/kg，参考药效学试验

给药方式：下腹部皮下单次注射给药，根据药代试验，释药期(40天)结束，设一个月恢复期。

试验开展：

操作：每组动物给药后于第0、2、7、14、30、45、60天分别处死2只，将残留微球取出，冷冻干燥；同时将注射部位微球所接触的皮肤取下，置于福尔马林溶液中固定保存。

组织检查方法：皮肤组织样品固定后，石蜡切片，以苏木素-伊红染色，于倒置荧光显微镜下观察组织的反应，主要检查是否有中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的渗入浸润和浸润程度，同时观察表皮是否有增生等现象。

观察及检查结果：

给药后无精神及行为异常，在注射部位鼓包现象不明显，60天试验期间，全部大鼠的注射局部没有出现化脓、溃烂等异常现象，给药后1天，注射局部出现硬节，经解剖发现其外包包囊，且含有固化药物，并发现局部微小血管有充血，第7天，给药部位现肉芽肿，外包包囊囊壁有增厚，注射部位表皮细胞增生活跃，表皮增厚，皮下有炎细胞浸润，14天包囊内固化药物有所减少，局部出现表皮增生且出现部分细胞坏死，局部出现以中性粒细胞为主的炎性细胞的浸润。30天注射部位的鼓包不明显，局部皮肤组织未见明显的病理改变，45天，未观察到未降解完的固化药物。60天，鼓包消退，肉芽肿完全恢复。

结论：药物皮下注射后，早期组织无明显的炎症反应，未观察到显著的细胞增生、浸润以及沉积现象。所有观察的时间点切片中，未观察到明显血管与纤维的增生，恢复期结束已经恢复正常。

十、稳定性研究

稳定性试验显示，产品在避光的2-8度条件下长期储存，性质稳定，适宜在该条件下长期储存。

以上实施例为本发明的具体实施方式，是对本发明的进一步的详细说明，不能认定本发明的实施方式仅限于此。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物，其特征在于，由外层骨架材料PLGA-PEG包裹着含有醋酸艾塞那肽的纳米粒组成，其中含有醋酸艾塞那肽的纳米粒为聚（乙交酯共丙交酯）PLGA，外层骨架材料PLGA-PEG为聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇共聚物。

2.根据权利要求1所述的一种双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物，其特征在于，所述的聚（乙交酯共丙交酯）中乙交酯与丙交酯比例为45:55-55:45的范围，分子量为40KD-60KD。

3.根据权利要求1所述的一种双层聚合物包裹的多肽缓释释放组合物，其特征在于，其中的纳米粒不添加其他辅料。