CN103405674A - 黑米花色苷提取物在制备保护拘束应激性肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黑米花色苷提取物在制备保护拘束应激性肝损伤药物中的应用。本发明的相关研究表明，该黑米花色苷提取物具有显著的平衡体内的活性氧自由基的作用，能够降低病理状态下机体的GPT、MDA和XOD的水平，提高体内抗氧化物质GSH水平，可用于制备保护拘束诱发应激性肝损伤的药物。

Description

黑米花色苷提取物在制备保护拘束应激性肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及黑米花色苷提取物在制备保护肝损伤的药物中的应用。

背景技术

近年来氧化应激性疾病越来越受到人们的关注。机体在应激负荷状态下产生大量的活性氧自由基，当这些自由基不能被及时的清除在体内蓄积便会引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的结构与功能从而导致组织病变。拘束应激模型是经典的心理应激模型，拘束诱发应激性体内自由基反应从而促使细胞膜、蛋白质、酶和DNA中有害物质的产生；拘束应激还能降低机体免疫力、影响体内荷尔蒙分泌、促进脂质过氧化物产生和降低机体内源的抗氧化物质（GSH和Vitamin E）水平。体内的活性氧自由基失衡使机体处于氧化应激状态从而诱发肝损伤。

抗应激药物能减弱应激负荷对机体的作用，降低机体对应激负荷的反应性，通常有安定止痛剂、安定剂以及镇静剂等等，但是这些药物多具有副作用，在临床使用剂量上受到限制，在效果上也多局限于暂时性的缓解，不能从根本上达到治疗目的。

黑米(Oryza sativa L.)是稻米中的珍品，自古享有“贡米”之美誉，是一种药、食兼用的的大米，具有滋阴润脑肺、健脾开胃、补中益气、活血化瘀等功效。研究表明黑米中丰富的花色苷组分，使其具备潜在的抗氧化特性。《中国生化药物杂志》2010年第31卷第1期“中国黑米花色苷研究现状及展望”一文中公开了黑米花色苷提取物的药用用途，包括对动脉粥样硬化斑块发展的抑制、对癌细胞的浸润和转移的抑制、对高脂血症的治疗效果等，但未提及其对拘束诱发应激性肝损伤的保护作用。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种黑米花色苷提取物的新用途，以解决现有保护拘束诱发应激性肝损伤的药物存在的缺陷。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种黑米花色苷提取物在制备保护拘束应激性肝损伤药物中的应用。

上述技术方案中，所述黑米花色苷提取物中，以质量计，总花色苷含量为20~60%。

上述黑米花色苷提取物制备步骤如下:

(1)：将黑米粉碎形成黑米粉，加入黑米粉6~12倍量的35~60%乙醇溶液于20~40℃下震荡1~4h，抽滤收集滤液，剩余黑米粉滤渣； 

(2)：将步骤(1)中的黑米粉滤渣用同步骤(1)中等体积的35~60%乙醇溶液于20~40℃下震荡1~4h，抽滤收集滤液；

(3)：将步骤(1)与步骤(2)中的滤液合并，经减压浓缩除去乙醇得到浓缩液；

(4)：将步骤(3)的浓缩液经过大孔树脂吸附，待花色苷完全吸附后，用2~6倍柱体积的蒸馏水溶液清洗柱子，然后用62~82%乙醇溶液解析花色苷得到花色苷解析液；所述蒸馏水溶液含有体积分数为1%的盐酸；

(5)：将步骤(4)得到的花色苷解析液真空浓缩、干燥、研磨得到暗红色的粉末，即为所述的黑米花色苷提取物；

所述乙醇溶液中都含有乙醇体积分数1%的盐酸。

药理实验显示，黑米花色苷提取物能够降低病理状态下机体的谷丙转氨酶（GPT）、丙二醛（MDA）和黄嘌呤氧化酶（XOD）的水平，提高体内抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）水平；通过改善以上生化指标的水平使体内的活性氧自由基趋于平衡，从而在拘束诱发应激性肝损伤方面发挥保护作用。

本发明所述黑米花色苷提取物可以单独或与一种以上可接受的载体组合剂制成制剂给药。例如，溶剂、稀释剂等。可以口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%~90%重量活性成分，更常见约15%~60%之间的活性成分。本发明黑米花色苷提取物剂量可以是0.005~5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。本发明的制剂包括适于口服、直肠、局部、口腔、舌下、皮下、肌肉、静脉。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明提供了一种黑米花色苷提取物的新用途，该黑米花色苷提取物具有显著的平衡体内的活性氧自由基的作用，能够降低病理状态下机体的GPT、MDA和XOD的水平，提高体内抗氧化物质GSH水平，可用于制备保护拘束诱发应激性肝损伤的药物。

附图说明

图1是实施例3中黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠血清GPT水平的影响；

图2是实施例3中黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠血清MDA水平的影响；

图3是实施例3中黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠肝组织GSH水平的影响；

图4是实施例3中黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠肝组织XOD水平的影响；

图中，#表示与正常组相比p<0.05；##表示与正常组相比p<0.01；###表示与正常组相比p<0.001；*表示与模型组相比p<0.05，**表示与模型组相比p<0.01，***表示与模型组相比p<0.001。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：黑米花色苷提取物的制备

步骤(1)：将黑米粉碎，加入黑米粉8倍量的含1%盐酸的40%乙醇于30℃条件下震荡提取2h，抽滤收集滤液；

步骤(2)：将步骤(1)中的黑米粉滤渣再用同上等体积的含1%盐酸的40%乙醇震荡提取2h，抽滤收集滤液；

步骤(3)：将步骤(1)与步骤(2)中的滤液合并，经减压浓缩除去乙醇；

步骤(4)：将步骤(3)浓缩液上AB-8大孔树脂，待花色苷完全吸附后，用3倍柱体积的含1%盐酸的蒸馏水清洗柱子，然后用含1%盐酸的80%乙醇解析花色苷；

步骤(5)：将步骤(4)中花色苷解析液于经真空浓缩、干燥、研磨得到暗红色的黑米花色苷提取物粉末，该黑米花色苷提取物中总花色苷含量为45.1%。

实施例2：黑米花色苷提取物的制备

步骤(1)：将黑米粉碎，加入黑米粉8倍量的含1%盐酸的55%乙醇于25℃条件下震荡提取3h，抽滤收集滤液；

步骤(2)：将步骤(1)中的黑米粉滤渣再用同上等体积的含1%盐酸的55%乙醇震荡提取3h，抽滤收集滤液；

步骤(3)：将步骤(1)与步骤(2)中的滤液合并，经减压浓缩除去乙醇；

步骤(4)：将步骤(3)浓缩液上D101大孔树脂，待花色苷完全吸附后，用5倍柱体积的含1%盐酸的蒸馏水清洗柱子，然后用含1%盐酸的65%乙醇解析花色苷；

步骤(5)：将步骤(4)中花色苷解析液于经真空浓缩、干燥、研磨得到暗红色的黑米花色苷提取物粉末，该黑米花色苷提取物中总花色苷含量为35%。

实施例3：黑米花色苷提取物对拘束诱发小鼠应激性肝损伤的保护作用

材料与试剂：谷丙转氨酶(GPT)试剂盒(100T/50样，南京建成生物工程研究所)、还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒（规格：100T/96样，南京建成生物工程研究所）、丙二醛(MDA)测试盒（规格：100T/96样，南京建成生物工程研究所）、黄嘌呤氧化酶(XOD)测试盒（规格：50T/48样，南京建成生物工程研究所）；无水乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司）、浓盐酸（昆山金城试剂有限公司）、冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）。

实验动物：昆明清洁级小鼠，雄性，体重18-22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养温度23±1℃，照明时间12 h/d（7:00-19：00）。

小鼠40只适应性喂养3天后，称重后按体重均匀分为正常组、肾损伤模型组、黑米花色苷提取物高剂量组、黑米花色苷提取物低剂量组，每组10只。正常组：灌胃给以水，10mL/Kg小鼠；模型组：拘束且灌胃给以水，10mL/Kg小鼠；低剂量组：灌胃给以花色苷提取物的水溶液，100 mg花色苷提取物/Kg小鼠；高剂量组：灌胃给以花色苷提取物，200 mg花色苷提取物/Kg小鼠。黑米花色苷提取物中总花色苷含量为45.1%。

各给药组连续灌胃7天，每天一次，正常组和模型组均灌胃同体积蒸馏水。第7天给完药30 min后进行造模处理，将模型组和各给药组小鼠按照头朝尖底方向置于50 mL通风良好的尖底离心管中拘束，正常组小鼠不予处理。拘束期间禁食禁水。12 h后对小鼠进行摘眼球取血，并取出肝脏。

将血液于4℃下放置60min，置于离心机中4℃5000转离心10min，分离血清备用。将肝组织清洗后称重，剪碎后按照(m/v=1:9)加入9倍量的冷的生理盐水于手动匀浆器中充分研匀得10%肝组织生理盐水匀浆液。置于离心机中4℃10000转离心10min取上清液备用。

血清中GPT水平按照如下表格中操作方法进行测定：

混匀，室温放置5分钟，505 nm波长下，双蒸水调零，测定各管OD值，以(绝对OD值=测定管OD值-对照管OD值)，查标准曲线，求得相应的GPT活力。

血清中MDA水平按照如下表格中操作方法进行测定：

注：试剂一、试剂二、试剂三分别指丙二醛（MDA）测试盒中MDA试剂1、MDA试剂2、MDA试剂3。

混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴60 min，取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10 min。取上清液，532 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。将测得的光度值带入公式：

血清MDA含量=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

取10%肝组织匀浆液按照如下操作方法对GSH水平进行测定：

(1) 上清液制备：取10%匀浆上清0.5ml，加试剂一应用液2ml混匀，3500-4000转/分离心10分钟，取上清液1ml进行显色反应。

(2) 显色反应：

	空白管	标准管	测定管
				试剂一(ml)	1.0
20μmol/L GSH标准(ml)		1.0
				上清液 (ml)			1.0
试剂二(ml)	1.25	1.25	1.25
				试剂三 (ml)	0.25	0.25	0.25
试剂四 (ml)	0.05	0.05	0.05

注：试剂一、试剂二、试剂三、试剂四分别指还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒中GSH试剂一号、GSH试剂二号、GSH试剂三号、GSH试剂四号。

混匀，静置5分钟，420nm处，1cm光径，双蒸水调零，测定各管OD值。将测得的光度值代入公式：

组织中GSH含量=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度×GSH分子量×样本测试前稀释倍数÷匀浆蛋白浓度

取10%肝组织匀浆液按照如下表格中操作方法对XOD水平进行测定：

注：试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五分别指黄嘌呤氧化酶（XOD）测试盒中XOD试剂一号、XOD试剂二号、XOD试剂三号、XOD试剂四号、XOD试剂五号。

混匀，530nm，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度OD值。将测定结果带入公式：

组织匀浆XOD活力=（测定OD值-空白OD值）/呈色物摩尔消光系数×反应液总体积/取样量×1/光径×反应时间÷匀浆蛋白浓度。

实验结果以mean±S.E.M（平均数±标准误差） 表示，采用SPSS 13.0软件（统计产品与服务解决方案软件），利用单因素分析（one-way ANOVA）和最小显著差数（LSD）检验进行统计学处理，p<0.05 表示有显著性差异，有统计学意义。

黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠血清GPT和MDA水平的影响，测定如附图1和附图2所示：

从附图1中可以看出，模型组与正常组相比血清GPT水平显著升高(p<0.001)，而黑米花色苷提取物高剂量、低剂量治疗组与模型组相比较血清GPT水平显著降低，且高剂量组(p<0.01)的效果好于低剂量组(p<0.05)；从附图2中可以看出，模型组与正常组相比血清MDA水平显著升高(p<0.01)，而黑米花色苷提取物高、低剂量治疗组与模型组相比较血清MDA水平显著降低(p<0.01)且高剂量组的效果好于低剂量组。

黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤小鼠肝组织GSH和XOD水平的影响，测定如附图3和附图4所示。

从附图3中可以看出，模型组与正常组相比肝组织GSH水平显著降低(p<0.05)，而黑米花色苷提取物高剂量、低剂量治疗组与模型组相比较肝组织GSH含量显著升高，且高剂量组(p<0.001)的效果好于低剂量组(p<0.01)；从附图4中可以看出，模型组与正常组相比肝组织XOD水平显著升高(p<0.001)，而黑米花色苷提取物高、低剂量治疗组与模型组相比较肝组织XOD水平显著(p<0.05)降低，且高剂量组的效果好于低剂量组。

以上结果表明，黑米花色苷提取物对拘束诱发应激性肝损伤具有明显的保护作用。

Claims (3)

1.一种黑米花色苷提取物在制备保护拘束应激性肝损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黑米花色苷提取物中，以质量计，总花色苷的含量为20~60%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黑米花色苷提取物制备步骤如下:

(1)：将黑米粉碎形成黑米粉，加入黑米粉6~12倍量的35~60%乙醇溶液于20~40℃下震荡1~4h，抽滤收集滤液，剩余黑米粉滤渣； 

(2)：将步骤(1)中的黑米粉滤渣用同步骤(1)中等体积的35~60%乙醇溶液于20~40℃下震荡1~4h，抽滤收集滤液；

(3)：将步骤(1)与步骤(2)中的滤液合并，经减压浓缩除去乙醇得到浓缩液；

(4)：将步骤(3)的浓缩液经过大孔树脂吸附，待花色苷完全吸附后，用2~6倍柱体积的蒸馏水溶液清洗柱子，然后用62~82%乙醇溶液解析花色苷得到花色苷解析液；所述蒸馏水溶液含有体积分数为1%的盐酸；

(5)：将步骤(4)得到的花色苷解析液真空浓缩、干燥、研磨得到暗红色的粉末，即为所述的黑米花色苷提取物；

所述乙醇溶液中都含有乙醇体积分数1%的盐酸。

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