CN103396419A - 肿瘤光动力治疗药二氢卟吩e6-15-乙酯及其制备方法 - Google Patents

肿瘤光动力治疗药二氢卟吩e6-15-乙酯及其制备方法 Download PDF

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沈凤明
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Abstract

本发明提供（I）所示化合物，化学名称2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩（通俗名：二氢卟吩e6-15-乙酯，或二氢卟吩e6-15-乙酰氧乙基，国际通用新药申报名：汉本泊芬）：
Figure DDA00003657094400011
。本发明还提供该化合物的制备及纯化方法以及包含该化合物的肿瘤光动力治疗剂。本发明化合物是一种化学结构明确、纯度高（≧98%）的单体，其光动力敏化作用光谱处于红光最佳波段（660nm)吸收系数高出目前临床用光动力治疗药泊芬钠（Sodium Porfimer，加拿大产）和喜泊芬（国产）约一个数量级，达到ε≧104M-1cm-1，对肿瘤组织杀伤作用強（于iv1mg.kg-1剂量和90J.cm2光剂量下，动物移植瘤达到近期治愈）。

Description

肿瘤光动力治疗药二氢卟吩e6-15-乙酯及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及新型的四吡咯化合物，更具体涉及肿瘤光动力治疗药二氢卟吩e6-15-乙酯及其制备方法。
背景技术
肿瘤光动力疗法（Photodynamic Therapy,PDT）是一种上世纪八十年代兴起的恶性肿瘤新疗法，被称为肿瘤第四疗法，系借助可见光和病灶区特定化学物质（或称光敏剂,Photosensitizer）的联合作用产生活性氧物质（Active oxygen speices），后者诱发光氧化反应导致病灶区生物大分子损伤，进而导致细胞器和细胞的损伤和坏死，最终达到肿瘤治疗的目的。与肿瘤传统疗法相比，其突出优点是：（1）选择性损伤肿瘤组织而不危及机体正常组织；（2）与化疗和放疗有一定程度协同作用；（3）能借助荧光指示肿瘤的范围或浸潤深度，有助于指引并缩小手术范围；（4）整体毒副反应轻微和使用相对比较方便等（许德余：肿瘤光动力疗法，中国医药科技出版社，1996年5月，北京；Shigenobu Yano,Shiho Hirohara,Makoto Obataet al:Current states and future views in photdynamic therapy.J PhotochemPhotobiol C:Photchemistry Reviews2011,12:46-67）。三十年来，PDT发展中存在的主要障碍是缺乏良好的药物或光敏剂。目前肿瘤-PDT临床使用的药物存在三个缺点：1、化学组成不定，有效成分化学结构不明：国外最早使用和应用最广的光敏素或泊芬钠（Photofrin or Sodium Porfimer）和国内使用的喜泊芬均系化学组成不定、肿瘤光生物活性成分不明的混合卟啉制剂，有报道称光敏素至少含六十种以上结构不明的化合物（Detty MR,Gibson SL and Wagner SJ:Current clinical an preclinical photosensitizers foruse in photodynamic therapy.J Med Chem2004,47(16):3897-3915.）;而喜泊芬其初上市的名称为血卟啉钠，是仿照国外早年报道的血卟啉衍生物（Hematoporphyrin derivative,HpD），其主要成分为血卟啉，上世纪五十年代中期已研究证明其均匀分布于体内、对肿瘤组织无选择性潴留作用（Schwartz SK,Absolon K and Vermund H:Some relationship of porphyrin,X-ray and tumors.Univ Mini Med Bull1955,27:7-8.）。有研究表明，HpD血卟啉等三种主要组成分（约占总量近90%）均对肿瘤组织无选择性潴留（kessel D and Chou TH:Porphyrin localizing phenomena.In Advances inexperimental medicine and biology Vol.160:Porphyrin photosensitization.Edited by Kessel D and Dougherty TJ:Prenum Press New York and London1983,pp.115-127.）；2、红光区吸收系数相对较小[ε=103M-1cm-1(630nm)]，限制了辐照光的有效穿透和PDT治疗效果;3、在体内均匀分布的光敏化杂质含量高，或结构本身导致正常组织的光毒性或暗毒性高（如替姆泊芬Temoporfin或Phoscan)。上述缺点从安全、有效和质量控制三方面限制了它们作为法定新药的发展。
本发明的目的，是针对当前临床使用的肿瘤PDT药物存在的上述缺点，提供一种化学结构明确、纯度高的具有肿瘤光动力损伤作用的化合物。
本发明的目的还在于提供这种化合物的制备方法及含这种化合物的肿瘤光动力治疗剂。
发明概述
本发明提供式（I）所示化合物，2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩：
Figure BDA00003657094200021
式（I）所示化合物的分子量为624，分子式为C36H40N4O6。
本发明还提供式（I）化合物的两种制备方法：
A.从市售粗品二氢卟吩e6制备，包括以下步骤：
（1）将市售粗品二氢卟吩e6经色谱分离纯化后，在硫酸存在下和乙醇反应生成二氢卟吩e6-15,17-二乙酯，和
（2）将上述（1）所得二氢卟吩e6-15,17-二乙酯水解脱去17位的乙酯基，得到二氢卟吩e6-C-15-乙酯；
B.从叶绿素生产中间体脱镁叶绿酸a制备，包括将脱镁叶绿酸a在乙醚中与5%KOH/乙醇反应的步骤。
本发明进一步提供含化合物（I）的注射剂，包括用碱性物质配制的含化合物（I）30～60g的溶液；或包含化合物（I）30～60g和聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP,分子量：k30）30～60g的溶液。
发明详述
本发明提供式（I）所示化合物是叶绿素a降解产物二氢卟吩e6衍生物：2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩（通俗名二氢卟吩e6-C-15-乙酯或二氢卟吩e6-C-15-乙酰氧乙基，国际新药申报名称为汉本泊芬)。为方便描述，以下说明书中“式（I）所示化合物”用“汉本泊芬”表示。
汉本泊芬作为一种新物质，其化学结构经核磁共振碳-氢谱和高分辨质谱等测定结果证明其化学结构为：2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩（见I式）；分子式为C36H40N4O6。
HPLC分析结果表明，上述（I）为一单体，其纯度达到99.63%（见附图1）。其化学结构测定如下：
汉本泊芬核磁共振13碳-1氢谱测定结果如下表1、2所示。
测试条件：Bruker Avance III500核磁共振仪(DMSO作为溶剂)
测试结果：
表1.1H谱线归属及1H-1H COSY数据
Figure BDA00003657094200041
表2.13C谱线归属及HSQC和HMBC数据
Figure BDA00003657094200042
Figure BDA00003657094200051
Figure BDA00003657094200061
注:*信号分别可互换
图谱解析及结论：
(1)1H-NMR给出24组峰，其积分比（除了最低场和最高场的4个活泼氢外，由低场至高场）为1∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶1∶1∶2∶2∶3∶3∶3∶1∶1∶1∶6∶1∶3，共36个质子，与Hanbenbofen的质子数相符。两个氨基活泼质子(δ-1.63ppm，δ-1.88ppm)由于受芳香环流正屏蔽的影响而出现在异常的高场；加重水交换后，最低场和最高场处的各两个质子信号分别消失和减弱。此结构式中的偶合关系比较简单，因此在1H-1H COSY谱中，偶合的相关峰较易判别，除了孤立的3个CH和3个CH3，其余的H均可以通过1H-1H COSY并结合化学位移得到识别。
(2)在13C-BB谱中一共有36个信号碳，与Hanbenbofen结构的36个碳相符。由DEPT图可知，本品结构中含6个伯C，6个仲C，6个叔C、18个季C,与Hanbenbofen碳的类型相符。由碳谱、DEPT谱和相关二维谱可知：
a.在HSQC谱上根据1H信号的归属结果,带有质子的13C信号可以随之加以确认。
b.在HMBC谱上，H-18和δ94.2处的叔碳有相关，所以此处的叔碳即为C-20，根据HSQC，H-20也可以得到归属；H-20、C3-CH=CH2、NH(δ-1.63ppm)和δ3.49ppm的3个H均与δ130.5ppm的碳信号有相关，据此δ3.49ppm处的H可归属为C2位上的CH3，同时此处的NH也得到指认。同样的方法，其余的季碳也可以通过HMBC中的远程相关峰得到归属。
(3)羰基碳信号应当出现在图谱的最左边（最低场），在这个范围内共有五个谱峰。在HMBC谱中，δ174.4ppm处的季碳与C17-CH2CH2COOH侧链上的两个CH2基团均有远程相关，这一季碳可归属为此侧链上的羰基碳。δ172.2ppm的季碳与C-15位侧链上的CH2及酯乙基(δ4.16ppm)有相关，所以此碳为C-15位侧链的羰基。δ169.9处的季碳与在C-12位上的甲基相关，所以此碳归属为C-13位侧链的羰基。δ170.0的碳信号和H-17、H-18及C-18位上的甲基相关；δ168.0的碳信号和C-15位侧链上CH2基团中的一个氢、H-18、H-17及C17-CH 2CH2COOH的相关，则可分别归属为C-19和C-16。
(4)从分子模型分析，如H-17和H-18处于顺式，则两者的二面角较小（接近0度），根据偶合常数J的Kaplus曲线，J较大；反之，如处于反式，则二面角较大（接近90度），J较小。结合1H的同核去偶实验结果：当对C18-CH3进行自旋去偶时，H-18由原来的四重峰变为尖锐的单峰，可以推断H-17和H-18间的偶合常数很小（小于1Hz），由此断定两者处于反式，即C-18位的甲基为α取向。
结论:1H和13C数据表明，化合物为2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩，与汉本泊芬结构相符(见图2）。
汉本泊芬的高分辨质谱分析结果:
高分辨质谱测定结果表明，汉本泊芬的分子式为C36H40N4O6Na1,其中Na系测试中加入的基质，测定所示M=647减去钠原子量23，汉本泊芬的分子量为624，测定所示的碳、氢、氮、氧各元素比均与汉本泊芬（见式1）结构完全一致（见图3）。
本发明提供化合物（I）的两种制备方法（见流程I）。
Figure BDA00003657094200081
流程I
第一种方法包括如下步骤：
（1）将市售粗品二氢卟吩e6经色谱分离纯化后，在硫酸存在下和乙醇反应，生成二氢卟吩e6-15,17-二乙酯；和
（2）将二氢卟吩e6-15,17-二乙酯水解脱去17位的乙酯基，得到二氢卟吩e6-C-15-乙酯。
第二种方法：将叶绿素生产中间体脱镁叶绿酸a在乙醚中与5%KOH/乙醇反应一步制备得二氢卟吩e6-C-15-乙酯。
本发明的第一种方法中，采用的原料粗品二氢卟吩e6先用Chembox中压制备色谱仪进行色谱分离。
展开条件：
展开剂：二氯甲烷/甲醇/丙酮/甲酸（10:0.8:0.8:0.08V/V/V/V)；
柱压:：10MPa；
流速：12L/h；
柱温：20±1℃。
借薄层检测流出液，收集淡雪青色二氢卟吩e6洗脱液。
本发明的制备汉本泊芬方法，还包括用Biotage Isolera One快速制备色谱仪分离纯化式（I）化合物，其中
展开剂为溶剂A:二氯甲烷;溶剂B:展开剂极性调节剂；
展开剂极性调节剂：甲醇/丙酮/甲酸为10/10/1(V/V/V)；
洗脱流速：30ml/min；
检测波长：666nm；
开始自动收集洗脱液的最低吸收值：1000mV；
梯度洗脱如下：
溶剂A/B
3%-3%     300ml
3%-5%     400ml
5%-6%     500ml
6%-7%     1000ml
7%-7%     1500ml
借TLC检测，确认收集目标化合物洗脱液，减压浓缩后干燥，得到纯品。
本发明进一步提供含化合物（I）的注射液。本品结构中具有羧基，具弱酸性。故可由碱性物质如氢氧化钠、碳酸钠、精氨酸等成盐后，溶于注射用水或生理盐水中制成注射液；或用聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP,分子量为k30）制成混合物后溶于注射用水制成注射液。本发明的注射液处方为：
A.
汉本泊芬                   30～60g
碱性物质                   适量
注射用水或生理盐水加至     3000ml
B.
汉本泊芬                   30～60g
PVPk30                     30～60g
注射用水或生理盐水加至     3000ml。
本发明提供的肿瘤PDT新药汉本泊芬是一种化学结构明确、纯度高（≧98%）的单体，其作用光谱处于红光最佳波段（660nm)吸收系数高出泊芬钠和喜泊芬一个数量级（ε≧104M-1cm-1）、对肿瘤组织杀伤作用強（于iv1mg.kg-1;90J.cm2下，达到动物移植瘤近期治愈）。本发明的注射液使用方便，可经静脉注射给药，也可经动脉注射进行介入疗法，还可局部注射于肿瘤体内或局部涂覆肿瘤表面。
附图的简单说明
图1为汉本泊芬高效液相色谱分析图。图中4号峰即为汉本泊芬，占总峰面积的99.63%。
图2为汉本泊芬结构的核磁共振碳-氢谱测定图谱。采用Bruker AvanceIII500核磁共振仪，以DMSO为溶剂。
图3为汉本泊芬结构的高分辨质谱分析。
图4显示汉本泊芬对不同人癌细胞株的光动力学杀伤作用。
具体实施方案
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明。
实施例1市售粗品二氢卟吩e6的分离纯化
取市售二氢卟吩e6干燥粗品，置于背光阴凉处，于干燥气流下挥去有机溶剂，室温下减压干燥（-0.1MPa，16h）。上述干燥粗品265g粉碎后，加入440g硅胶（300～400目）混合均匀，制得柱层样品。采用Chembox中压制备层析仪对该样品进行分离。
展开条件：
展开剂：二氯甲烷/甲醇/丙酮/甲酸（10:0.8:0.8:0.08V/V/V/V)；
柱压:：10MPa；
流速：12L/h；
柱温：20±1℃。
时时借薄层检测流出液，收集二氢卟吩e6洗脱液，合并后，减压回收溶剂，所得固体真空干燥后得到纯度90%的二氢卟吩e630～35g，为墨绿色粉末状固体，收率11～12%。
结构测定：UV/Visλmaxnm：401，501，530，557，607，662nm;IR(KBr)cm-1:3340，2970-2880，1710(c=0)，1600(c=c)，1440，1215cm-1;1H-NMR(CDCl3,TMS,δppm):1.65(3H，t，4b-CH3)，2.20-2.46(4H，m，7a、7b-CH2)，3.26(3H，s，3a-CH3)，3.45(3H，s，1a-CH3)，3.53(3H，s，5a-CH3)，4.42-4.63(2H，m，7、8-CH)，5.36(2H，s，10-CH2)，6.16(1H，dd，2b-Ha)，6.40(1H，dd，2a-Hb)，8.21-8.32(2H，m，2a-H)，9.10(1H，s，δ-H)，9.66(1H，s，(-H)，9.75(1H，s，(-H)ppm，FAB m/z：598(M+2)，597(M+1)，596(M)。上述波谱数据确认该化合物为二氢卟吩e6。
实施例2汉本泊芬的制备（一）
在1750mL无水乙醇中缓慢加入按上述实施例1制得的粉状二氢卟吩e670g，搅拌下缓缓滴加35mL浓硫酸，65℃水浴加热。直至反应液经TLC检测表明，二氢卟吩e6二乙酯化反应完全。减压蒸发回收溶剂（60℃）。冷却后将所得残存物溶于3000mL水中，用110.4g NaHCO3和2000mL水所成的溶液缓缓搅拌中和至pH6-7，静置18h后，滤集析出的固体，减压干燥6h后，即得二氢卟吩e6-15,17-二乙酯粗品。
取75g上述粗品二氢卟吩e6-15,17-二乙酯，用粉碎机粉碎，加入150g硅胶混合均匀，作为上样层，借chembox层析仪，以1000g硅胶（300-400目）为固定相，以压力10MPa，流速约1.6L/h进行洗脱。展开剂：二氯甲烷：甲醇：丙酮：甲酸=10:0.3:0.3:0.03（V/V/V/V）。借TLC检测，收集含二氢卟吩e6二乙酯的洗脱液约12L。减压蒸发收集二氢卟吩e6二乙酯，直至二氢卟吩e6-15,17-二乙酯干燥贴壁无流动状为止，加水搅碎、浸泡，放置过夜。滤集二氢卟吩e6二乙酯，置于真空干燥箱中，常温下减压（-0.1MPa）干燥16h，得到26g分离纯化后的二氢卟吩e6-15,17-二乙酯。
取1040无水乙醇，缓缓加入26g上述二氢卟吩e6-15,17-二乙酯粉末状固体，搅拌下加入7.8g KOH与104mL H2O所成的溶液，45℃水浴搅拌加热。反应液TLC检测，直至二氢卟吩e6-15,17-二乙酯水解反应完全。滴加入9mL冰醋酸，继续搅拌1h，放置冷却。反应液减压蒸发（温度：60℃，压力：-0.08Mpa），直至残存物固体贴壁。放冷后加水2000mL浸泡2-3h，减压滤集所得二氢卟吩e6-15-乙酯固体。后者室温减压干燥18h，即得本发明的产品汉本泊芬。
实施例3汉本泊芬的制备（二）
将脱镁叶绿酸a粗品5g溶解于200mL乙醚，通入N2，加入0.5%KOH/CH3CH2OH溶液500mL，搅拌反应5h后，加HCl中和至pH6-7，减压回收乙醇至近干，加入适量水，滤集沉淀物，后者用水反复洗净。所得固体P2O5减压干燥，得粗品二氢卟吩e6-15-乙酯4.8g。经硅胶柱层析（展开剂：氯仿/甲醇/甲酸20:1:0.2V/V/V），分离得二氢卟吩e6-15-乙酯墨绿色固体900mg，HPLC分析，保留时间13.5min。
实施例4二氢卟吩e6-15-乙酯（汉本泊芬）粗品的分离纯化
用Biotage Isolera One快速制备色谱仪分离纯化化合物（I），其中
展开剂为溶剂A:二氯甲烷;溶剂B:展开剂极性调节剂；
展开剂极性调节剂：甲醇/丙酮/甲酸为10/10/1(V/V/V)；
洗脱流速：30ml/min；
检测波长：666nm；
开始自动收集洗脱液的最低吸收值：1000mV；
梯度洗脱如下：
溶剂A/B
3%-3%     300ml
3%-5%     400ml
5%-6%     500ml
6%-7%     1000ml
7%-7%     1500ml
借TLC检测，确认收集目标化合物洗脱液，减压浓缩后干燥，得到汉本泊芬纯品。
实施例5二氢卟吩e6-15-乙酯（汉本泊芬）的纯度测定
称取汉本泊芬样品50mg，用甲醇溶解并定容至50ml，再从中取1ml溶液，用甲醇-磷酸氢二钠溶液（77：23）流动相稀释定容至10ml，作为受试样品溶液。用高效液相色谱分析法测定汉本泊芬的纯度。
色谱展开条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以甲醇-磷酸氢二钠溶液（取磷酸氢二钠4.3g，加水1200ml使溶解，用磷酸调pH至6.85）（77:23）为流动相，检测波长为405nm。进样量：10μl；流速：1ml/min；柱温：25℃；保留时间：7.2min。
高效液相色谱测定结果表明，本发明方法得到的汉本泊芬其纯度为98-99%（见图1）。图中4号峰即为汉本泊芬，占总峰面积的99.63%。
实施例6二氢卟吩e6-15-乙酯（汉本泊芬）结构的波谱测定
波谱测定结果为：
HPLC分析结果表明，上述（I）为一单体，其纯度达到99.63%（见图1）。其化学结构测定如下：
核磁共振碳-氢谱测定结果：
测试条件：Bruker Avance III500核磁共振仪(DMSO作为溶剂)
测试结果：
表1.1H谱线归属及1H-1H COSY数据
Figure BDA00003657094200131
Figure BDA00003657094200141
表2.13C谱线归属及HSQC和HMBC数据
Figure BDA00003657094200142
注:*信号分别可互换
图谱解析及结论：
1H-NMR给出24组峰，其积分比（除了最低场和最高场的4个活泼氢外，由低场至高场）为1∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶1∶1∶2∶2∶3∶3∶3∶1∶1∶1∶6∶1∶3，共36个质子，与Hanbenbofen的质子数相符。两个氨基活泼质子(δ-1.63ppm，δ-1.88ppm)由于受芳香环流正屏蔽的影响而出现在异常的高场；加重水交换后，最低场和最高场处的各两个质子信号分别消失和减弱。此结构式中的偶合关系比较简单，因此在1H-1H COSY谱中，偶合的相关峰较易判别，除了孤立的3个CH和3个CH3，其余的H均可以通过1H-1H COSY并结合化学位移得到识别。
在13C-BB谱中一共有36个信号碳，与Hanbenbofen结构的36个碳相符。由DEPT图可知，本品结构中含6个伯C，6个仲C，6个叔C、18个季C,与Hanbenbofen碳的类型相符。由碳谱、DEPT谱和相关二维谱可知：
a.在HSQC谱上根据1H信号的归属结果,带有质子的13C信号可以随之加以确认。
b.在HMBC谱上，H-18和δ94.2处的叔碳有相关，所以此处的叔碳即为C-20，根据HSQC，H-20也可以得到归属；H-20、C3-CH=CH2、NH(δ-1.63ppm)和δ3.49ppm的3个H均与δ130.5ppm的碳信号有相关，据此δ3.49ppm处的H可归属为C2位上的CH3，同时此处的NH也得到指认。同样的方法，其余的季碳也可以通过HMBC中的远程相关峰得到归属。
羰基碳信号应当出现在图谱的最左边（最低场），在这个范围内共有五个谱峰。在HMBC谱中，δ174.4ppm处的季碳与C17-CH2CH2COOH侧链上的两个CH2基团均有远程相关，这一季碳可归属为此侧链上的羰基碳。δ172.2ppm的季碳与C-15位侧链上的CH2及酯乙基(δ4.16ppm)有相关，所以此碳为C-15位侧链的羰基。δ169.9处的季碳与在C-12位上的甲基相关，所以此碳归属为C-13位侧链的羰基。δ170.0的碳信号和H-17、H-18及C-18位上的甲基相关；δ168.0的碳信号和C-15位侧链上CH2基团中的一个氢、H-18、H-17及C17-CH 2CH2COOH的相关，则可分别归属为C-19和C-16。
从分子模型分析，如H-17和H-18处于顺式，则两者的二面角较小（接近0度），根据偶合常数J的Kaplus曲线，J较大；反之，如处于反式，则二面角较大（接近90度），J较小。结合1H的同核去偶实验结果：当对C18-CH3进行自旋去偶时，H-18由原来的四重峰变为尖锐的单峰，可以推断H-17和H-18间的偶合常数很小（小于1Hz），由此断定两者处于反式，即C-18位的甲基为α取向。
结论:1H和13C数据表明，化合物为2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩，与汉本泊芬结构相符(见图2）。
汉本泊芬的高分辨质谱分析结果：
高分辨质谱测定结果表明，汉本泊芬的分子式为C36H40N4O6Na1,其中Na系测试中加入的基质，测定所示M=647减去钠原子量23，汉本泊芬的分子量为624，测定所示的碳、氢、氮、氧各元素比均与汉本泊芬（见式1）结构完全一致（见图3）。
实施例7二氢卟吩e6-15-乙酯（汉本泊芬）对体外培养人癌细胞株的光动力灭活作用
采用以下细胞株，采用常规方法，测定汉本泊芬对体外培养人癌细胞株的光动力灭活作用。
表3.实验用人癌细胞
Figure BDA00003657094200171
结果见图4和表4。
表4.汉本泊芬对不同人癌细胞株的半数光动力灭活作用（IC50）
Figure BDA00003657094200172
结果表明，汉本泊芬对体外培养的不同人癌细胞株均具有较強的光动力学灭活作用，对6种体外培养人癌细胞株半数光动力灭活作用（IC50值）在0.86-4.36μg/mL之间（见表2）其敏感性依次为Hela＞A459＞MMP2＞ KB＞BEL-7402＞耐药BEL-7402细胞。上述结果表明，汉本泊芬对I外培养人癌细胞的光灭活作用明显较目前国际广泛使用的肿瘤光动力治疗药物泊芬钠为強（彭迁、董荣春：癌光啉和Photofrin对人体肿瘤细胞系光敏杀伤作用的比较。第二军医大学学报1986,7940:280-282.）。
实施例8二氢卟吩e6-15-乙酯（汉本泊芬）对动物移植瘤的光动力治疗效果
KM株小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，背部皮下植入S-80肉瘤制成动物模型，待肿瘤直径长成约5-6mm后，经尾静脉注射给药，1h后实施激光辐照，光斑直径15mm；优化的光剂量为2[mg/kg]×50[J/cm2]，或1[mg/kg]×100[J/cm2]，或4[mg/kg]×25[J/cm2]，可实现宽度<10mm、厚度<8mm的肿瘤（未侵入肌层）。结果表示为：++++光照后48h，所有肿瘤原先隆起的外表均趋于平整甚至下陷，整个光照区几乎完全被覆黑褐色干痂，未见肿瘤残留迹象（近期治愈）；+++光照后48h，所有肿瘤原先隆起的外表均趋于平整甚至下陷，上覆黑褐色干痂，肿瘤外光照区内的皮肤显灰白，未见肿瘤残留迹象；++光照后48h，直径小于8mm的肿瘤原先隆起的外表趋于平整，上覆小块黑褐色干痂，直径大于8mm的肿瘤仅有中心区下陷并形成黑褐色干痂，周边微隆起，外缘皮肤颜色仍显红润，可见肿瘤残留迹象；+光照后48h，肿瘤仅表层受损，中心区颜色暗淡略有下陷，但质地仍硬，边缘隆起且潮红，肿瘤外光照区内的皮肤略发红；-光照后48h，肿瘤继续生长，与单纯肿瘤组比较未见差异。结果见表5、表6。
表5.汉本泊芬（静脉注射）对小鼠S-80肉瘤的光动力治疗效果
Figure BDA00003657094200181
表6.两批汉本泊芬样品（A及B）对小鼠S180-肉瘤的光动力治疗效果
Figure BDA00003657094200191
注：表5、表6中数据表明，给药1mg.kg-1，1h后以100J.cm-1剂量660nm波长光辐照肿瘤部位，可获肿瘤近期治愈（即完全消失）；给药2mg.kg-1，1h后以50J.cm-1、2h后以65J.cm-1、2h后以110J.cm-1、4mg.kg-11-6h后以25-90J.cm-1、6mg.kg-1,6h后以60J.cm-1剂量,用660nm波长光辐照肿瘤部位，均可获肿瘤近期治愈（即完全消失）。与泊芬钠及喜泊芬等目前临床使用的光动力治疗药物达到上述结果的药物剂量5-10mg.kg-1光剂量180-200J.cm-1相比（Xu Deyu,Yin Xiangsheng,Chen Wenhui et al:Studies onthe new tumor-photolocalizingand and Photochemothe-rapeutic agentphotocarcinorin(PsD-007).SPIE1991,Vo.1616,pp.305-309.)，汉本泊芬明显优于前两者。
实施例9组织光学数据摘要（KM鼠S180模型）
660nm激光经带Microlens光纤输出，对在活体KM小鼠右侧臀部约13mm直径的近球形S180肿瘤进行表面照射，光斑直径15mm、功率密度100mW/cm2。由带点状传感端的200μm石英光纤插入瘤组织中实施光信号采集，然后传输到高灵敏度OMA系统进行检测，所获结果见表7。
表7
组织深度(mm) 4 6 8 10 15
光能流率(mW/cm2) 47.7 31.8 22.0 14.9 5.6
实施例10汉本泊芬注射剂液及其配制方法
本品结构中具有羧基，具弱酸性。故可由碱性物质如氢氧化钠、碳酸钠、精氨酸等成盐后，溶于注射用水或生理盐水中制成注射液；或用聚乙烯吡咯烷酮PVPk30制成混合物后溶于注射用水制成注射液。本发明的处方为：
1、汉本泊芬                     30～60g
碱性物质                        适量
注射用水或生理盐水加至          3000ml
2、
汉本泊芬                        30～60g
PVPk30                          30～60g
注射用水或生理盐水加至          3000ml
配制方法：
A:按处方1要求配制0.2%、0.5%氢氧化钠溶液、10%碳酸钠溶液、10%精氨酸溶液备用；正确称取汉本泊芬30g～60g，分别溶于上述碱性物质的溶液中，调节pH值为7.0～10.0，加入注射用水或生理盐水，稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬溶液的含量、有关物质、pH值，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
B：按处方2正确称取汉本泊芬、聚乙烯吡咯烷酮（PVPk30）各30～60g，混合均匀，加热熔融，制成混合物，溶于注射用水或生理盐水中，调节pH值5.0～8.5，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬溶液的含量、有关物质、pH值，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
稳定性：
例1：
按处方量准确称取汉本泊芬30g，加0.2%氢氧化钠溶液搅拌使溶解完全，调节pH至7.5～8.5，加注射用水或生理盐水，稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入安瓿每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
例2：
按处方量准确称取汉本泊芬45g，加0.2%氢氧化钠溶液搅拌使溶解完全，调节pH至8.0～9.0，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
例3：
按处方量准确称取汉本泊芬45g，加0.5%氢氧化钠溶液搅拌使溶解完全，调节pH至8.5～9.5，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
例4：
按处方量准确称取汉本泊芬45g，加10%碳酸钠溶液搅拌使溶解完全，调节pH至7.5～8.5，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
例5：
按处方量准确称取汉本泊芬45g，加10%精氨酸溶液搅拌使溶解完全，调节pH至8.0～8.5，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入3ml安瓿，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
例6：
按处方量准确称取汉本泊芬45g，加PVPk3045g，加热熔融，放冷后，加注射用水或生理盐水搅拌使溶解完全，调节pH至6.0～8.5，加注射用水或生理盐水稀释至3000ml，过滤，测定汉本泊芬的含量、有关物质、pH，合格后分装入安瓿，每支3ml，制成1000支，115℃灭菌30分钟，检查、检漏，测定汉本泊芬含量、pH值和有关物质，合格后避光保存。
影响因素试验：
将上述例1-例6的成品分别裸置于60℃恒温烘箱、360nm光照、0～4℃低温冰箱和-20℃冻融各10天，并于0、5、10天取样测定汉本泊芬含量、有关物质、pH值，并与0天比较，结果除光照不稳定外，均未发现明显变化。
加速试验：
将上述例1-例6的成品以市售包装置于40℃恒温烘箱放置6个月，分别于0、1、2、3、6个月取样测定汉本泊芬含量、有关物质、pH值，并与各月比较，结果均未发现明显变化。

Claims (10)

1.式（I）所示化合物，2,7,12,18-四甲基-3-乙烯基-8-乙基-13-羧基-15-乙酰氧乙基-17-丙酸基-17,18-二氢卟吩：
Figure FDA00003657094100011
2.式（I）所示化合物的制备方法，选自以下两种方法：
A.从市售粗品二氢卟吩e6制备，包括以下步骤：
将市售粗品二氢卟吩e6经色谱分离纯化后，在硫酸存在下和乙醇进行酯化反应，生成二氢卟吩e6-15,17-二乙酯，后者进一步水解脱去17位的乙酯基，得到二氢卟吩e6-C-15-乙酯（I）；和
B.从叶绿素生产中间体脱镁叶绿酸a制备：包括将脱镁叶绿酸a在乙醚中与5%KOH/乙醇反应的步骤。
3.如权利要求2所述的制备方法，其中所述原料粗品二氢卟吩e6的色谱分离采用Chembox中压制备色谱仪进行分离。
4.如权利要求2所述的制备方法，进一步包括将所得化合物（I）用Biotage Isolera One快速制备色谱仪分离纯化，得纯度达≥98%的化合物（I），其中
展开剂为溶剂A:二氯甲烷;溶剂B:展开剂极性调节剂；
展开剂极性调节剂：甲醇/丙酮/甲酸为10/10/1(V/V/V)；
洗脱流速：30ml/min；
检测波长：666nm；
开始自动收集洗脱液的最低吸收值：1000mV；
梯度洗脱如下：
Figure FDA00003657094100021
借TLC检测，确认收集目标化合物洗脱液，减压浓缩后干燥，得到化合物（I）纯品。
5.含化合物（I）的注射剂，包括用碱性物质配制的含化合物（I）30～60g的溶液；或包含化合物（I）30～60g和PVPk30 30～60g的溶液。
6.如权利要求5所述的注射剂，其中所述碱性物质选自氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液和精氨酸溶液。
7.如权利要求5所述的注射剂，所述注射剂由式（I）化合物与所述碱性物质溶液混合均匀而制成；或式（I）化合物与平均分子量k30的聚乙烯吡咯烷酮混合均匀、加热融化后溶于注射用水或生理盐水而制成。
8.如权利要求5所述的注射剂，所述注射剂由选自氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、精氨酸溶液的pH调节剂调节pH值为7.0～10.0。
9.如权利要求5所述的注射剂，其中所述包含化合物（I）30～60g和PVPk3030～60g的溶液的pH值调节为5.0～8.5。
10.如权利要求5所述的注射剂，其中所述溶液的体积为3000ml，分装成1000支安瓿。
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