CN103724356A - 一种富勒烯卟啉类衍生物光敏剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富勒烯卟啉类衍生物光敏剂及其制备方法与应用。富勒烯卟啉类衍生物光敏剂的结构式如式Ⅰ所示。本发明的富勒烯卟啉类衍生物可以克服传统光敏剂需要足够氧浓度这一缺陷，在低氧浓度条件下依旧可以产生有效活性氧，达到很好的治疗效果。本发明具有光毒性高、暗毒性小、对癌细胞选择性摄取等优点，同时还具有广谱性，不仅对癌细胞具有杀伤效果，同时还对细菌具有显著的杀伤作用。重要的是，本发明富勒烯卟啉类衍生物在小鼠体内是可以被代谢的，是一种具有诱人前景的新型光敏剂。

Description

一种富勒烯卟啉类衍生物光敏剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种富勒烯卟啉类衍生物光敏剂及其制备方法与应用。

背景技术

光动力治疗（Photodynamic therapy，简称PDT）是继传统的手术疗法、放疗、化疗等之后兴起的一种新的治疗癌症的方法。该方法具有选择性好、毒性低、创伤小、风险小、副反应小、抗瘤谱广、适用性好、易消灭隐性癌病灶、可重复治疗、便于与其他治疗癌症的方法联合使用等优点。目前PDT已被国内外批准，成为一项治疗肿瘤的常规手段，并在国际上获得公认和广泛应用。第一代光敏剂（血卟啉衍生物HpD）和第二代光敏剂（5-氨基酮戊酸ALA）已被美国食品药物管理局批准。卟啉环类光敏剂由于其优良的光化学性质和对肿瘤细胞的特殊选择性成为目前最常见的光敏剂。不足之处是，卟啉类光敏剂具有光漂白性、容易聚集，这大大影响了它产生活性氧的效率，从而降低了光动力治疗的效果。因此，需要提供一种结构新颖的光动力治疗光敏剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有电子给受体系的富勒烯卟啉类衍生物光敏剂及其制备方法与应用。

本发明提供的式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物，

本发明还提供了式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

（1）对甲酰基苯甲酸甲酯、4-吡啶甲醛和吡咯进行反应得到式1所示化合物；

（2）在LiAlH₄的作用下，式1所示化合物经还原反应得到式2所示化合物；

（3）式2所示化合物经Swern氧化反应得到式3所示化合物；

（4）式3所示化合物与C₇₀经Prato反应得到式4所示化合物；

（5）在溴苯中，式4所示化合物与甲基甲苯磺酸盐进行反应即得式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物。

上述的制备方法中，步骤（1）中，所述对甲酰基苯甲酸甲酯、所述4-吡啶甲醛与所述吡咯的摩尔比可为1：3：4；可以丙酸作为溶剂，在回流的状态下反应1.5h；

步骤（2）中，式1所示化合物与LiAlH₄的摩尔比可为1：8；在室温（25℃）下反应，具体可通过薄层色谱监测反应进程，展开剂为：CHCl3：EtOH=97：3，v/v）；

步骤（3）中，式2所示化合物与二甲基亚砜的摩尔比可为1：46；所述Swern氧化反应的温度为-60℃，时间可为75分钟；

步骤（4）中，式3所示化合物与C₇₀的摩尔比可为3：2；可在邻二氯苯溶液中进行，在氩气的气氛下加热回流1h即可。

步骤（5）中，式4所示化合物与所述甲基甲苯磺酸盐的摩尔比可为1：30；可在氩气气氛中回流1h，减压蒸馏得到粗产物。

本发明还提供了式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在作为光动力治疗中的光敏剂中的应用。

本发明还提供了式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在制备肿瘤光动力治疗药物中的应用；所述应用表现为下述1）或2）中任一种：

1）所述肿瘤光动力治疗药物光动力抑制肿瘤细胞的生长；所述肿瘤细胞可为癌细胞；所述癌具体可为肺癌

2）所述肿瘤光动力治疗药物光动力抑制肿瘤细菌的生长；所述肿瘤细菌可为大肠杆菌。

本发明式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物由于分子自身是电子给受体系，还可以用作太阳能电池的新型材料；也可以通过在卟啉环中修饰具有磁性的金属，作为磁共振成像试剂，使其在医药保健、化妆品等诸多领域有广泛的应用前景。

本发明式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物为两亲性的分子，可以自组装形成胶束，作为一种药物载体用于药物输运。

本发明提供的式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物由于分子自身形成一个电子给受体系，使得处于三线态的时间延长，增加了与基态氧相互作用几率，提高了氧气的利用率。即使在很低浓度的氧氛围下依然可以有效产生活性氧，保持光动力治疗的效果。在实体肿瘤组织中，由于肿瘤细胞的快速增殖和肿瘤血管的不完整性导致肿瘤组织处于一种缺氧状态，本发明的富勒烯卟啉类衍生物可以克服传统光敏剂需要足够氧浓度这一缺陷，在低氧浓度条件下依旧可以产生有效活性氧，达到很好的治疗效果。本发明具有光毒性高、暗毒性小、对癌细胞选择性摄取等优点，同时还具有广谱性，不仅对癌细胞具有杀伤效果，同时还对细菌具有显著的杀伤作用。重要的是，本发明富勒烯卟啉类衍生物在小鼠体内是可以被代谢的，是一种具有诱人前景的新型光敏剂。

附图说明

图1是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物的制备方程式。

图2是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物的核磁共振氢谱图。

图3是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物的质谱谱图。

图4是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物的粒径（图4（A））和电势（图4（B））表征谱图。

图5是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物（PC₇₀）与原卟啉（Por）在水中的紫外吸收光谱对比曲线。

图6是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物对A549细胞的毒性实验结果，其中图6（A）是富勒烯卟啉类衍生物在不同的浓度梯度下光照10min的光毒性，图6（B）是富勒烯卟啉类衍生物不同浓度梯度下的暗毒性结果，图6（C）是富勒烯卟啉类衍生物在不同浓度梯度以及不同光照时间下的光毒性结果，图6（D）是不同光照时间的共聚焦图像。

图7是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物癌细胞选择性的摄取，其中图7（A）是在不同孵育时间条件下，A549细胞对富勒烯卟啉类衍生物和卟啉的摄取对比；图7（B）是A549细胞对富勒烯卟啉类衍生物和卟啉摄取的共聚焦荧光成像，图7（C）是4℃和37℃下A549细胞对富勒烯卟啉类衍生物和卟啉摄取实验，图7（D）是A549细胞和HaCaT细胞对富勒烯卟啉类衍生物和卟啉摄取实验；图中PC₇₀表示本发明富勒烯卟啉类衍生物，Por表示卟啉。

图8是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物在低氧浓度下对A549细胞光动力实验，其中，图8（A）是氩气氛围下富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对A549细胞的光毒性实验对比（光照10min），图8（B）是氩气氛围下富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对A549细胞的光毒性实验的共聚焦图像（光照10min）；图中PC₇₀表示本发明富勒烯卟啉类衍生物，Por表示卟啉。

图9是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物在低氧浓度下对E.coli光动力杀伤，其中图9（A）是氩气氛围下富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的暗毒性实验对比，图9（B）是氩气氛围下富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的光毒性实验对比（光照10min），图9（C）是氩气氛围下富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的凝胶成像图（光照10min）；图中PC₇₀表示本发明富勒烯卟啉类衍生物，Por表示卟啉。。

图10是本发明实施例1富勒烯卟啉类衍生物在裸鼠体内的代谢分布图，其中，每1个组织所对应的第1列是1小时所取的时间点，第1列是4小时所取的时间点，第2列是24小时所取的时间点。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物的制备

反应方程式如图1所示。

（1）对甲酰基苯甲酸甲酯、4-吡啶甲醛和吡咯按照1：3：4（摩尔比）混合，用丙酸作溶剂，加热回流1.5h，反应后的混合物，先用甲醇重结晶，通过硅胶柱分离（淋洗液为三氯甲烷：甲醇=98：2，v/v）提纯得到式1所示化合物。

（2）式1所示化合物与LiAlH₄按物质的量比为1：8，在室温（25℃）下反应，反应物通过柱层色谱（展开剂为，氯仿：乙醇=97：3，v/v）监测得到式2所示化合物。

（3）式2所示化合物通过Swern氧化反应将羟基氧化成醛基，具体步骤如下：将0.5mL的草酰氯溶于5mL的CH₂Cl₂中，将0.5mL DMSO在-60℃下加入到上述溶液中，搅拌15min，而后将99.4mg的式2所示化合物的CH₂Cl₂溶液（50mL）缓慢滴加到上述混合液中，在-60℃下搅拌20min。反应结束后，加入2.5mL的三乙胺，在-60℃下继续搅拌30min。待反应温度恢复至室温后，有机层分别用水、0.5M的NaHCO₃和饱和氯化钠洗涤。蒸干之后通过硅胶柱纯化（展开剂为，氯仿：乙醇=97：3，v/v），得到式3所示化合物。

（4）式3所示化合物通过Prato反应与C₇₀偶联，具体步骤如下：97.5mg的C₇₀溶于100mL的邻二氯苯溶液中，分别加入50mg的式3所示化合物和12mg的肌氨酸，在氩气中加热回流1h。减压蒸馏，通过硅胶色谱分析（展开剂为，氯仿：乙醇=95：5，v/v）得到式4所示化合物。

（5）将103.6mg式4所示化合物溶于25mL溴苯中，加入0.5mL的甲基甲苯磺酸盐，在氩气中回流1h，减压蒸馏得到粗产物，通过离子交换树脂（氯离子交换树脂）得到式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物。

式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物的核磁共振氢谱如图2所示，其质谱如图3所示，其粒径和电势表征如图4所示，分别为图4（A）和图4（B），其与卟啉在水中的紫外吸收光谱对比曲线如图5所示，由质谱和核磁可以看出，本发明得到了目标产物：分子的理论分子量为1677，打掉三个氯之后所得到1572的峰值如质谱所示，该化合物的粒径在160nm左右，表面电荷平均为7.5mV左右，紫外图谱可以说明卟啉与C₇₀偶联之后在422nm处的吸收峰有所降低，同时由于存在电子传输使得吸收峰向红外方向有所移动。

实施例2、式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物对A549细胞的毒性效果评价

（1）复苏A549细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），调整细胞密度到5×10⁴/mL，将A549细胞接种到96孔板(6×6)中，在37℃、5%CO₂条件下孵育24h；

（2）待细胞贴壁后换成含不同浓度梯度的式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物的DMEM（康宁R10-013-CV，购买公司：拜尔迪）溶液在37℃、5%CO₂条件下继续培养24h。

按照使用说明，用cck-8检测A549细胞的活性，式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物对A549细胞的暗毒性实验结果如图6（B）所示。

由图6（B）可得知，富勒烯卟啉衍生物具有很低的暗毒性。

实施例3、式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物对A549细胞的光动力杀伤效果

（1）复苏A549细胞，调整细胞密度到5×10⁴/mL，将A549细胞接种到96孔板(6×6)中，在37℃、5%CO₂条件下孵育24h；

（2）待细胞贴壁后换成含不同浓度梯度的式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物的DMEM溶液在37℃、5%CO₂条件下继续培养3h；

（3）去掉含有式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物的培养基，换成新鲜的无色DMEM在20mW/cm^-2的光照强度下光照10min，之后更换新鲜的培养基，继续孵育24h。

按照使用说明，用cck-8检测A549细胞的活性，式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物对A549细胞的光毒性实验结果如图6（A）所示。

由图6（A）、图6（C）和图6（D）可得知，本发明富勒烯卟啉衍生物在很小浓度时是就有很高的光毒性，并且它的光毒性都呈现浓度依赖和时间依赖的关系，即光毒性会随时间浓度和时间的增加而增加。

图7为本发明富勒烯卟啉类衍生物对癌细胞选择性的摄取，由图7（A）和图7（B）可得知，本发明富勒烯卟啉衍生物相对于单独的卟啉的摄取更高，并且它们都在37℃下的摄取量要高于4℃时的摄取（如图7（C）所示），说明摄取是能量依赖的，图7（D）显示，由于纳米粒子对肺癌细胞（A549）的摄取量要高于正常的表皮细胞（HaCaT，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）的摄取量，说明对癌细胞具有一定的选择性。

实施例4、式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物在低氧条件下对A549细胞的光动力杀伤效果

（1）复苏A549细胞，调整细胞密度到5×10⁴/mL，将A549细胞接种到小皿中，在37℃、5%CO₂条件下孵育24h；

（2）待细胞贴壁后换成浓度为2μM的式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物的DMEM溶液在37℃、5%CO₂条件下继续培养3h；

（3）去掉含有式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物的培养基，换成新鲜的无色DMEM，在氩气氛围中采用20mW/cm^-2的光照强度光照10min，之后更换新鲜的培养基，继续孵育24h。

按照使用说明，用cck-8检测A549细胞的活性，式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物和卟啉在低氧浓度下对A549细胞的光毒性实验结果对比图如图8（A）所示，其共聚焦图像如图8（B）所示。

由图8（A）和图8（B）可得知，在氩气氛围下光照10分钟，本发明富勒烯卟啉衍生物的光毒性要比单独的卟啉的光毒性要高的多，共聚焦图像也可以很直观的看出来，经过被富勒烯卟啉衍生物孵育过的细胞的细胞膜发生了损坏，因此可以被碘化吡啶染成红色，而卟啉分子没有破坏细胞膜，因此没有被染色。

实施例5、式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物在低氧条件下对细菌的光动力杀伤效果

（1）取10mL的LB培养基，加入10μL氨苄西宁，挑一个E.coli菌（大肠杆菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：CMCC44817），放在30℃，180rap的摇床12h，让其进行单克隆生长；

（2）测试菌液的O.D值，准备12mL，0.5O.D值的菌液，每组2mL放于小皿中，其中三组用于光毒性测试，另外三组用于暗毒性测试，于37℃恒温箱中孵育30min；

（3）10000r离心机离心3min，去除上清液，加入新的培养基，在氩气氛围下光照10min；

（4）将菌液稀释10000倍，取100μL涂在固体培养基中，12h后计数生长的菌落的个数。

式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在低氧浓度下对E.coli菌的光毒性实验结果如图9所示，其中，图9（A）为氩气氛围下式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的暗毒性实验对比，图9（B）为氩气氛围下式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的光毒性实验对比（光照10min），图9（C）为氩气氛围下式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物和卟啉对E.coli的凝胶成像图（光照10min）。

由图9（A）、图9（B）和图9（C）可得知，在没有光照的条件下，细菌的存活率很高，在氩气保护下光照10分钟，本发明富勒烯卟啉衍生物的抑菌率可以达到98%，而单独的卟啉只能达到45%左右的抑菌率。从图9（C）也可以直观的看出菌落生长的个数。

实施例6、式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物在裸鼠体内的代谢分布

（1）首先用过量乙酸（20μL）将⁶⁵ZnCl₂转变成乙酸锌（加热至80～100度），用约26uCi的⁶⁵ZnCl₂，反应3小时候将过量乙酸加热除去。

（2）得到的乙酸锌与100μL式Ⅰ所示富勒烯卟啉衍生物溶液反应过夜（90nmol）（室温搅拌），得到的产物用超滤管（30K Da）超滤，除去未反应的Zn-65，得到产物16uCi，放射性反应收率为61.5%。

（3）反应用的Zn(65)Cl₂的（作为储存液）为3.36mCi/mg。动物实验选取1、4和24h三个时间点，每个时间点三只裸鼠（取平均值），每只老鼠0.5-1uCi的剂量（尾静脉注射），式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在裸鼠体内的代谢分布图如图10所示。

由图10可得知，最开始这些纳米粒子累积在肺，肝脾。因为巨噬细胞会清除这些粒子，从血液循环的角度来看，经过静脉注射后心脏会立刻将血液输送到肺部，所以在1小时的时候肺的相对放射性剂量很高，但是纳米粒子很快从肺中排出，24小时候肺中的累积很低了，类似的排出也见于肝脏，但是比肺慢，随着时间延长，纳米粒子在各器官中的含量有所降低，说明这种纳米粒子是可代谢的。

Claims (9)

1.式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物，

2.式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

（1）对甲酰基苯甲酸甲酯、4-吡啶甲醛和吡咯进行反应得到式1所示化合物；

（2）在LiAlH₄的作用下，式1所示化合物经还原反应得到式2所示化合物；

（3）式2所示化合物经Swern氧化反应得到式3所示化合物；

（4）式3所示化合物与C₇₀经Prato反应得到式4所示化合物；

（5）在溴苯中，式4所示化合物与甲基甲苯磺酸盐进行反应即得式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中，所述对甲酰基苯甲酸甲酯、所述4-吡啶甲醛与所述吡咯的摩尔比为1：3：4；

步骤（2）中，式1所示化合物与LiAlH₄的摩尔比为1：8；

步骤（3）中，式2所示化合物与二甲基亚砜的摩尔比为1：46；

步骤（4）中，式3所示化合物与C₇₀的摩尔比为3：2；

步骤（5）中，式4所示化合物与所述甲基甲苯磺酸盐的摩尔比为1：30。

4.式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在作为光动力治疗中的光敏剂中的应用。

5.式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在制备肿瘤光动力治疗药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用表现为下述1）或2）中任一种：

1）所述肿瘤光动力治疗药物光动力抑制肿瘤细胞的生长；

2）所述肿瘤光动力治疗药物光动力抑制肿瘤细菌的生长。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为癌细胞；

所述肿瘤细菌为大肠杆菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述癌为肺癌。

9.式Ⅰ所示富勒烯卟啉类衍生物在下述1）-3）中任一种中的应用：

1）作为太阳能电池材料；

2）作为药物载体；

3）磁共振成像试剂。

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