CN103387951A

CN103387951A - 一种提高枯草芽孢杆菌生物量的发酵培养基及其发酵方法

Info

Publication number: CN103387951A
Application number: CN2013103617348A
Authority: CN
Inventors: 刘海明; 吕中文
Original assignee: BEIJING AEROSPACE HENGFENG TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING AEROSPACE HENGFENG TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-11-13

Abstract

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵生物量的培养基以及利用所述的培养基发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，通过对发酵培养基的调整，加入玉米淀粉、玉米面以及豆芽汁等使得单位体积内枯草芽孢杆菌的数目有显著提升；另外，本申请还付出了大量的创造性劳动对发酵条件进行了优化，包括发酵温度、pH值、装液量以及转速等进行了优化，获得了效果最佳的发酵条件，适用于枯草芽孢杆菌的大规模生产。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌生物量的发酵培养基及其发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种可显著提高枯草芽孢赶紧生物量的发酵培养基以及应用所述的培养基发酵枯草芽孢杆菌的方法。

技术背景

半个世纪以来,化学农药防治病虫害对农业生产起了重要的作用,但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害,而且对土壤、水体、大气造成严重污染,破坏生态平衡。同时,由于病菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大,出现了用药量与病害相互递增的恶性循环,增加了农产品中农药的残留量,对人畜安全构成极大的威胁。

近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和人的病原菌具有显著的拮抗作用，引起广大微生物和免疫学工作者的密切关注。目前,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等。而芽孢杆菌(Bacillus spp.)是目前生防细菌中研究较多的一类,因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子,所以是理想的生防菌筛选对象。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌,其生理特征多样,分布广泛,极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在,而且是植物体内常见内生细菌,尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征,而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖,并且批量生产工艺简单,成本较低,施用方便,储存期长,现已成为一种理想的生防细菌。

目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、以及枯草芽孢杆菌的产酶特性和在豆粕中的应用效果研究等。但是，在相同条件下获得更多生物量的枯草芽孢杆菌同样具有重要意义，而现有技术中虽有少量报道，但效果均不明显。本申请要解决的技术问题即为在现有技术的基础上通过调整培养基成分以及发酵条件获得更多生物量的枯草芽孢杆菌，为枯草芽孢杆菌在生防领域的应用奠定一个坚实的基础。

发明内容

本发明提供了一种可以显著提高枯草芽孢杆菌生物量的发酵培养基以及用所述培养基发酵培养枯草芽孢杆菌的方法。

本发明提供的发酵培养基为添加了一定量玉米淀粉，玉米面和豆芽汁的培养基，优选的添加量为：玉米淀粉0.3%-0.8%（质量分数）玉米面1%-3%(质量分数)，豆芽汁0.5-1.5%（体积分数），更优选为：玉米淀粉0.4%-0.6%（质量分数），玉米面1.5%-2.5%(质量分数)，豆芽汁1.0-1.5%（体积分数），最优选为玉米淀粉0.5%（质量分数），玉米面2%(质量分数)，豆芽汁1.2%（体积分数）。

本发明提供的发酵培养基具体为玉米淀粉0.5%，玉米面2%，豆芽汁1.2%（体积分数），蔗糖3%，1%蛋白胨，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，CaCO₃0.8%，MnSO₄0.01%，其余为双蒸水。

本发明提供了一种利用优化的培养基培养获得高生物量枯草芽孢杆菌的方法，所述的方法以枯草芽孢杆菌为出发菌株，经过活化后的发酵培养，得到生物量大幅上升的枯草芽孢杆菌菌株，其中包括在发酵培养基中同时加入一定量的玉米淀粉、玉米面以及豆芽汁。

如上述的方法，其优选的添加量为：玉米淀粉0.3%-0.8%（质量分数）玉米面1%-3%(质量分数)，豆芽汁0.5-1.5%（体积分数），更优选为：玉米淀粉0.4%-0.6%（质量分数），玉米面1.5%-2.5%(质量分数)，豆芽汁1.0-1.5%（体积分数），最优选为玉米淀粉0.5%（质量分数），玉米面2%(质量分数)，豆芽汁1.2%（体积分数）。

如上述的方法，其发酵培养基的更优选的为玉米淀粉0.5%，玉米面2%，豆芽汁1.2%（体积分数），蔗糖3%，1%蛋白胨，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，CaCO₃0.8%，MnSO40.01%，其余为双蒸水。

如上述的方法，其发酵条件为温度36℃，压力0.10Kpa，通气量：120m³/h，转速200转／分钟，接种量4%，pH7.0。

所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，37℃活化24h。

本申请还对发酵生产枯草芽孢杆菌的条件进行了优化，对发酵温度、pH值、转速以及装液量进行了条件优化，得到了效果最佳的发酵条件，适用于大规模的发酵生产。

经过以上条件优化，枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达7.32×109cfu/mL，比优化前（2.41×108cfu/mL）提高了30.37倍。

本发明的显著优点：本发明通过对培养基配方进行了调整，获得了可以显著提高发酵生物量的枯草芽孢杆菌的发酵培养基以及发酵方法，为枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌的生长曲线；

图2仅添加玉米淀粉对发酵生物量的影响；

图3仅添加玉米面对发酵生物量的影响；

图4仅添加豆芽汁对发酵生物量的影响；

图5同时添加三种物质对枯草芽孢杆菌安军生长的影响；

图6培养基初始pH值对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图7培养温度对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图8转速对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图9培养基装液量对枯草芽孢杆菌生长的影响。

具体实施方式

以下实施例采用的枯草芽孢杆菌为保藏号为CGMCC NO.1.1093，进行具体标书，但是本发明不仅限于此，也可以采用市场上可以购买得到的枯草芽孢杆菌菌株。

实施例1,枯草芽孢杆菌的活化

活化培养基的平板制备：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，121℃,高压灭菌，20min，每块平板倒入15-20ml，超净台中冷却凝固后，加盖板，封口，4℃保存备用。

讲购买得到的保存于半固体培养基中的菌株拿于室温下，超净台中用经高压灭菌过的牙签蘸取培养基，然后“之”字形划平板，37℃倒置培养过夜。

过夜后由平板中挑出单克隆，接种于液体活化培养基中，所述的培养基为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，，蒸馏水1000mL，121℃,高压灭菌，20min，37℃，180rpm摇床过夜，得到种子菌液，收集菌液，4℃保存备用。

实施例2枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

将枯草芽孢杆菌活化后，以5%（v/v）的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2）中，装液量100mL/300mL，在30℃、200r/min下培养，分别采用分光光度法和平板菌落计数法测定不同培养时间时的OD₆₀₀值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以OD₆₀₀值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图（图1）。由生长曲线确定枯草芽孢杆菌的最佳培养时间为16h。

实施例3．豆芽汁的配制

豆芽汁培养基：黄豆芽500g，加水1000mL，煮沸lh，过滤后补足水121℃湿热灭菌后存放备用，此即为50%的豆芽汁，用于细菌培养时，按照所需量加入。

实施例4培养基的调整以及对枯草芽孢杆菌发酵生物量的影响

以下实验中，除额外添加的成分外，以如下配比制成的培养基作为基础培养基：蔗糖3%，1%蛋白胨，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，CaCO₃0.8%，MnSO₄0.01%，所述的成分的含量均为质量分数。

4.1添加玉米淀粉对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

比较玉米淀粉不同添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响，其中，以玉米淀粉添加量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图2）。结果表明，随着玉米淀粉添加量的增加，OD₆₀₀增长量也不断提高；当玉米淀粉添加量为0.5%时，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.619；随之继续增加玉米淀粉的添加量，OD₆₀₀增长量有所下降。因此，确定枯草芽孢杆菌玉米淀粉的最适添加量为0.5%。

4.2添加玉米面对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在上述的基础培养基的基础之上，分别以不同质量分数的玉米面加入到培养基中，考察它们对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响，以玉米面添加量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图（图3）。结果表明，玉米面添加量在2.0%，OD₆₀₀增长量最高，为1.147；因此，确定玉米面的最佳添加量为2%。

4.3豆芽汁对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在上述所述基础培养基的基础上，以豆芽汁添加量为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图4）。结果表明，随着豆芽汁添加量的增加，OD₆₀₀增长量也随之提高；当蛋白胨添加量为1.2%时，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.847；随后继续增加蛋白胨的添加量，OD₆₀₀增长量有所下降。因此，确定枯草芽孢杆菌的蛋白胨最适添加量为1.2%。

4.4同时添加三种添加物对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在基础培养基的基础上，分别以上述三个实验获得的最佳添加量添加玉米淀粉、玉米面以及豆芽汁，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图5）。结果表明，当添加上述的三种物质后，与基础培养基的发酵相比，枯草芽孢杆菌的细胞生物量有显著提高，OD值增长量达到0.924。

实施例5培养条件的优化

5.1培养基初始pH值对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在上述优化的培养基基础上，调节枯草芽孢杆菌的发酵培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，以培养基初始pH值为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图6）。结果表明，随着培养基初始pH值的升高，其OD₆₀₀增长量也随之增加；当pH值为7时，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.731；继续升高培养基pH值，OD₆₀₀增长量下降，因此，确定枯草芽孢杆菌的最佳培养基初始pH值为7.0。

5.2培养温度对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

将枯草芽孢杆菌以5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下，在200r/min条件下培养16h，以培养时间为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图7）。结果表明，当温度为45℃时，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀值最高，为0.687。因此，确定45℃为枯草芽孢杆菌的最适培养温度。

5.3转速对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

将枯草芽孢杆菌以5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别在100rpm、130rpm、170rpm、200rpm、230rpm、260rpm的转速下，45℃培养16h。以转速为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图8）。结果表明，随着转速的增加，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量上升，当转速为170r/min时，OD₆₀₀增长量达到最大值，为0.885。当继续增加转速到200r/min时，OD₆₀₀增长量开始下降。因此，选择170r/min为枯草芽孢杆菌培养的最佳转速。

5.4培养基装液量对枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别选取40mL/300mL、60mL/300mL、80mL/300mL、100mL/300mL、120mL/300mL、140mL/300mL六种不同的培养基装液量，在45℃、170r/min下培养16h。以培养基装液量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图9）。结果表明，当装液量为100mL/300mL时，OD₆₀₀增长量最高，为1.147，因此，选择100mL/3000mL作为培养基的初始装液量。

5.5正交实验

设计正交试验L₂₇（3¹³）对枯草芽孢杆菌的培养条件进行优化，以考察温度、培养基初始pH、转速、装液量四个因素对菌株生长的影响，根据单因素的实验优化结果选取因素水平，

正交试验设计及分析见表1-3。

表1枯草芽孢杆菌培养条件优化因素水平表

表2枯草芽孢杆菌培养条件优化正交试验结果

表3方差分析表

从表3可以看出，温度和转速对枯草芽孢杆菌生长具有显著性影响。而在27组实验中，OD₆₀₀增，量最高的组合为A₁B₃C₃D_2，但是由于B因素和D因素即pH值和装液量影响并不显著，同时考虑较多装液量可以节约生产成本，因此选择有利于菌体生长的最优组合为A₁B₂C₃D₂。进一步进行枯草芽孢杆菌培养条件正交试验的验证试验，即选取A₁B₃C₃D₂和A₁B₂C₃D₂两种条件培养枯草芽孢杆菌，菌悬液稀释10倍后测定其OD₆₀₀值。在最优组合A₁B₂C₃D₂的条件下，其菌悬液的OD₆₀₀增长量为0.712，在组合A₁B₃C₃D₂的条件下，其菌悬液的OD₆₀₀增长量为0.637，因此经验证试验确定枯草芽孢杆菌培养条件的最优组合为A₁B₂C₃D₂，即温度37℃，培养基初始pH7.0，转速210r/min，装液量100mL/300mL。

经过上述优化后的枯草芽孢杆菌的培养基配方及培养条件为：玉米淀粉0.5%，玉米面2%，豆芽汁1.2%，蔗糖3%，1%蛋白胨，MgSO40.075%，KH2PO40.25%，CaCO30.8%，MnSO40.01%，所述的成分的含量均为质量分数；培养温度37℃、转速210r/min、装液量100mL/3000mL；接种量为5%（v/v），培养时间16h。

实施例6实施：优化试验

优化前培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2；

优化前的培养条件：培养温度30℃、转速200r/min、装液量100mL/300mL，接种量为5%（v/v），培养时间24h。

采用优化后的培养基配方及培养条件进行枯草芽孢杆菌的发酵生产。将菌悬液稀释25倍后测定OD₆₀₀，其优化前的OD600增长量为0.134，优化后的OD₆₀₀增长量为0.556；经过以上条件优化，枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达7.32×109cfu/mL，比优化前（2.41×108cfu/mL）提高了30.37倍。

Claims

1.一种提高枯草芽孢杆菌生物量的发酵培养基，其特征在于所述的培养基中含有一定量的玉米淀粉、玉米面和豆芽汁。

2.如权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的玉米淀粉含量为0.3%0.8%（质量分数），玉米面含量为1%-3%（质量分数），所述的豆芽汁的含量为0.5%-1.5%（体积分数）。

3.如权利要求1-2任一项所述的发酵培养基，其特征在于，其还包蔗糖3%， 1%蛋白胨，MgSO₄ 0.075%，KH₂PO₄0.25%，CaCO₃0.8%，MnSO₄ 0.01%，上述的各组分含量均为质量分数，其余为双蒸水。

4.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于所述的培养基的具体包括：玉米淀粉0.5%，玉米面2%，豆芽汁1.2%（体积分数），蔗糖3%， 1%蛋白胨，MgSO4 0.075%，KH2PO4 0.25%，CaCO3 0.8%，MnSO4 0.01%，其余为双蒸水。

5.一种枯草芽孢杆菌的高生物量培养方法，其特征在于：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为菌种，经活化后接种到权利要求1所述发酵培养基中培养；其中所述的发酵培养基加入了一定量的玉米淀粉、玉米面和豆芽汁。

6.根据权利要求5所述枯草芽孢杆菌高生物量的培养方法，其特征在于：在所述的发酵培养基中加入0.3%-0.8%（质量分数）的玉米淀粉，1%-3%（质量分数）的玉米面，0.5%-1.5%（体积分数）的豆芽汁。

7.根据权利要求5所述枯草芽孢杆菌高生物量的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基为玉米淀粉0.5%，玉米面2%，豆芽汁1.2%（体积分数），蔗糖3%， MgSO₄ 0.075%，KH₂PO₄0.25%，CaCO₃ 0.8%，MnSO₄ 0.01%。

8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述培养条件为：温度37℃，转速210转／分钟，接种量5%，pH 7.0，培养基装液量为每300ml装液100ml。

9.根据权利要求5所述的高密度培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，37℃活化24h。