CN103387596A - 一种原人参二醇衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原人参二醇衍生物及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，具有式Ⅰ结构：

Description

一种原人参二醇衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种原人参二醇衍生物及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物以及在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，我国每年约有150万人新患肿瘤，每年约有80多万人死于肿瘤。现有的肿瘤药物都不能彻底有效地治愈。同时由于新型肿瘤的不断发现，迫使人们努力寻找新的抗肿瘤药物。

20(S)-原人参二醇是原人参二醇型皂苷，如人参皂苷Rh2、Rg3、C-K的苷元。20(S)-原人参二醇具有明显的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞分化，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制肿瘤血管形成，提高机体抗肿瘤的免疫力以及拮抗肿瘤细胞沾附等作用。

目前，已有学者设计、合成了一些20(S)-原人参二醇的衍生物，如20(S)-原人参二醇的邻二醇、羧酸衍生物、环氧衍生物以及氨基酸衍生物等，并测定了其体外抗肿瘤活性。为此类抗肿瘤化合物的进一步研究开发提供了科学依据。

发明内容

本发明利用微生物转化的方法制备了一系列的原人参二醇衍生物，发现了一些具有较好的抗肿瘤活性的新衍生物，特别提供了一种侧链上连有乙氧基团的原人参二醇衍生物：23,24-双键-25-乙氧基-20(S)-原人参二醇，及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物以及在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。

本发明具体技术方案如下：

一种侧链上连有乙氧基团的原人参二醇衍生物：23,24-双键-25-乙氧基-20(S)-原人参二醇，及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，具有式Ⅰ结构：

上述式Ⅰ化合物药学上可接受的盐包括各种无机或有机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐、甲基磺酸盐或对甲苯磺酸盐等；各种无机或有机碱盐如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锂盐、镁盐、锌盐、胆碱盐、二乙醇胺盐、乙醇胺盐、N-甲基-葡萄糖胺盐等。

上述式Ⅰ化合物的酯包括式3位、12位以及20位中的一个或多个羟基与C1-6的羧酸反应制得的羟基酯。

上述式Ⅰ化合物的溶剂合物包括水合物和有机溶剂合物，有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等。

本发明所提供的原人参二醇衍生物可以利用微生物转化的方法制备获得，或者通过合成以及半合成手段获得。由于上述式Ⅰ具有多个手性中心，本领域技术人员也可通过根据本发明公开的结构合成以及半合成得到式Ⅰ化合物的光学异构体。

本发明的化合物或其及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的化合物或其及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物及可药用载体。较佳的，本发明的药物组合物有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐。“可药用载体”不会破坏本发明的化合物或其可药用盐的药学活性，同时其有效用量，即能够起药物载体作用时的用量对人体无毒。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。“可药用载体”包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统（SEDDS）如d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β-、γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的化合物、及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物的药物传递。

其他可药用辅料如填充剂（如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖）、粘合剂（如微晶纤维素）、崩解剂（如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP）、润滑剂（如硬脂酸镁）、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。

上述本发明的化合物或其及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。

上述本发明的化合物或其及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物以及药物组合物的治疗有效量为0.001-100mg/kg/d之间，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。

本发明通过实验证实，本发明的原人参二醇衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

本发明还提供了式Ⅰ化合物或其及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。上述化合物可用于抑制肿瘤细胞增殖，优选的，用于治疗和/或预防宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌或乳腺癌。

本发明利用微生物转化技术，对原人参二醇成功地进行了结构修饰，获得了一种新的原人参二醇衍生物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物对多种肿瘤细胞具有抑制作用，可以作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤药物开发利用。

附图说明

图1是本发明化合物的¹H NMR谱。

图2是本发明化合物的¹³C NMR谱。

图3是本发明化合物的HSQC谱。

图4是本发明化合物的HMBC谱。

图5是本发明化合物的液相色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1、结构式为式Ⅰ的原人参二醇衍生物的制备

本发明采用微生物转化方法，以原人参二醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括：犁头霉（Absidia），小克银汉霉（Cunninghamella），毛霉（Mucor），链格孢（Alternaria），红酵母（Rhodotorula），共头霉（Syncephalastrum）或根霉（Rhizopus）属的微生物；其中转化能力较强的是犁头霉（Absidia）和毛霉（Mucor）属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心（CICC），于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。真菌培养基选用马铃薯培养基，细菌培养基选用LB培养基。

马铃薯培养基的配制（PDA培养基）：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80℃保温1h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3%琼脂。

细菌培养基的制备（LB培养基）：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5%琼脂。

以伞枝犁头霉Absidia corymbiferaAS3.3387为例，制备结构式为式Ⅰ的化合物的过程如下：

1）发酵、转化以及萃取

将伞枝犁头霉Absidia corymbiferaAS3.3387接入2个250mL三角瓶（装有100mL马铃薯培养基）中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶（装有400mL马铃薯培养基）中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg原人参二醇（0.2mL，125mg/mL无水乙醇溶液），共用500mg底物。相同条件下继续转化10天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣约1.8g。

2）硅胶柱纯化

将所得残渣溶于少量甲醇，与2.0g柱色谱硅胶（200–300目）混合拌样，自然干燥，加至装有60g硅胶（200–300目）的色谱柱顶，用二氯甲烷–无水乙醇系统梯度洗脱（6:1-1:8），收集洗脱组分，采用TLC分析方法（硅胶G薄层板，二氯甲烷–无水乙醇（5:1）展开，10%硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色）将所得到的相似洗脱组分合并。

3）反相高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱进行纯化。制备条件为半制备用色谱柱Hedera C₁₈A-5μm，10.0I.D×250mm（江苏汉邦科技），甲醇-水（83:17，V/V），流速3.0mL/min，检测波长203nm，收集保留时间为22.6min的色谱峰，色谱图如图5所示，旋转蒸发后得到结构式为式Ⅰ的化合物。

化合物Ⅰ，23,24-双键-25-乙氧基-20(S)-原人参二醇[23,24-en-25-ethoxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)527.4081[M+Na]⁺(calculated forC₃₂H₅₆O₄Na[M+Na]⁺,527.4076)。

其¹H-NMR及¹³C-NMR数据如表1所示，¹H NMR谱图如图1所示，¹³C NMR谱图如图2所示，HSQC谱图如图3所示，HMBC谱图如图4所示。

表1

Position	δc	δH
			1	39.3	1.62(m),0.88(m)
2	28.2	1.80(m)
			3	78.0	3.39a
4	40.0
			5	56.3	0.80(m)
6	18.8	1.60(m)
			7	35.2	1.47a,1.24a
8	37.4
			9	50.5	1.50a
10	39.6
			11	32.2	2.09(m)
12	71.0	3.89(m)
			13	48.9	1.96(m)
14	51.7
			15	31.3	1.56a,1.00a
16	26.8	1.90a
			17	54.2	2.34a
18	16.5	1.03(s)
			19	16.4	0.87(s)
20	73.1
			21	27.6	1.36(s)
22	39.9	2.76(dd,5.0,15.3),2.37a
			23	127.0	6.03(m)

24	138.4	5.64(d,16.0)
			25	74.7
26	26.7	1.29(s)
			27	26.7	1.29(s)
28	28.7	1.19(s)
			29	15.9	1.00(s)
30	17.0	0.90(s)
			1′	57.7	3.36(m)
2′	16.3	1.12(t,7.0)

以上结果表明，所得化合物结构正确。

实施例2本发明化合物Ⅰ的抗肿瘤活性

1）实验材料

仪器与试剂：CO₂培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPM I1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。

测试用肿瘤细胞株：Hela细胞（人宫颈癌细胞）、K562细胞（人白血病细胞）、K562/ADR细胞（人白血病耐药细胞）、SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）、Du-145（人前列腺癌细胞）、HePG2细胞（人肝癌细胞）、MCF-7细胞（人乳腺癌细胞），购于中国医学科学院肿瘤研究所。

测试样品：20(S)-原人参二醇(PPD)及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ，纯度在90%以上；各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2）实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC₅₀值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPM I1640培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM I1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5%CO₂培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0..1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定570nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%]。实验重复3次。应用SPSS11.5软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(IC₅₀)。

3）实验结果

根据MTT法测试结果，计算20(S)-原人参二醇(PPD)及本发明化合物Ⅰ对上述细胞的IC₅₀值，结果如表2所示。

表2.测试样品体外细胞毒活性筛选结果

结果表明，本发明的化合物Ⅰ对各种肿瘤细胞的增值均显示出较强的抑制作用，即具有较强的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

Claims (3)

1.一种原人参二醇衍生物及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，具有式Ⅰ结构：

2.如权利要求1所述原人参二醇衍生物及其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述治疗和/或预防肿瘤药物为治疗和/或预防宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌药物。

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