CN103370340B - 包含dhFas-1结构域和MMP底物的融合肽及其在预防和治疗类风湿性关节炎中的应用 - Google Patents

包含dhFas-1结构域和MMP底物的融合肽及其在预防和治疗类风湿性关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含dhFas‑1结构域和MMP底物的融合肽及其应用。更具体而言，本发明涉及一种融合肽及其在预防和治疗炎性疾病中的应用，所述融合肽包含：a)dhFas‑1结构域，其为β ig‑h3的缺乏H1和H2区的第四fas‑1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。本发明的融合肽抑制因滑膜细胞的粘附和迁移而导致的类风湿性关节炎扩大，并且可以用来通过抑制免疫细胞的浸润而预防或治疗炎性疾病。

Description

包含dhFas-1结构域和MMP底物的融合肽及其在预防和治疗类 风湿性关节炎中的应用
技术领域
本申请要求于2010年12月2日递交的韩国专利申请第10-2010-0121894号的优先权和权益，并为所有目的通过援引将其并入，如同在本文中将其全文叙述一样。
本发明涉及一种包含dhFas-1结构域和MMP底物的融合肽及其在预防和治疗炎性疾病中的应用。更具体而言，本发明涉及一种融合肽及其在预防和治疗炎性疾病中的应用，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
背景技术
炎症反应由组织(细胞)损伤或外源病原体感染引起，并且表现出一系列的复杂的生理学应答(例如酶激活、炎症介质释放、体液浸润、细胞移动和组织破坏)以及外部症状(例如红斑、水肿、发烧和疼痛等)，其中涉及了局部血管和体液中的各种炎症介导因子和免疫细胞。另外，在一些情况下，这些炎症反应会导致急性炎症、肉芽肿和慢性炎症(例如类风湿性关节炎)(Goodwin J.S.等，J.Clin.Immunol.,9:295-314,1989)。
类风湿性关节炎(RA)是在整个身体(包括关节)内引起慢性炎症的自身免疫病，并且在女性中比在男性中出现得更频繁。其起因仍不清楚，但推定是由遗传因素和环境因素引起的。因此，为了查明类风湿性关节炎的起因，已进行了大量研究。而且，根据最近的报道，遗传因素在类风湿性关节炎的易感性和预后预测中起重要作用，对整体免疫应答的外遗传控制的失衡会引起包括类风湿性关节炎在内的自身免疫病(Richardson B.等，ClinImmunol,109,72-79,2003)。
在类风湿性关节炎中，炎症主要出现在体内关节的滑膜中，特别而言，炎症持续6周以上。在类风湿性关节炎发作时，包含各种炎性细胞的肿块(“血管翳”)会由滑膜组织的血液形成，其会破坏软骨、引起关节变形并使关节周围的骨骼弱化。作为关节炎症的结果，关节变得肿胀而疼痛，关节的活动范围受限，且关节周围变红且在触摸时较热。
该疾病由身体免疫系统的紊乱引起。通常，体内的免疫系统起到保护身体不受诸如细菌等异物侵害的作用。然而，免疫系统的功能失常会因未知因素而攻击身体本身，从而引发疾病。这种状态称为“自身免疫性”，其中，根据上述原理，对称的炎症出现在各种关节中，尤其是手部关节，从而在数年至数十年期间导致关节的逐渐破坏。有时，除关节外，该炎症可以侵袭其他器官(例如肺、心脏、眼、血管、神经)。此外，该疾病主要在寿命的青春期(约30多岁时)引起身体机能紊乱，由此降低健康品质和工作效率，造成巨大的经济损失。
迄今为止，虽然对类风湿性关节炎的成因已进行了大量的研究，但类风湿性关节炎的确切成因仍然未知。不过，针对类风湿性关节炎的各种临床治疗方法已经建立，这些方法分为一般保守治疗、药物疗法和手术治疗等。由于该疾病引起慢性炎症所致的关节疼痛以及关节的变形和功能障碍，因此治疗类风湿性关节炎的目标是抑制疼痛和炎症，并使关节功能障碍最小化，从而使患者能够恢复正常生活。目前，最常使用的疗法是药物疗法。对于药物疗法，根据症状，使用阿司匹林及非甾体抗炎药、低剂量口服类固醇、疾病调节性抗风湿药物(DMARD)(例如抗疟疾药、柳氮磺胺吡啶、金化合物、青霉胺和免疫抑制药(氨甲喋呤(MTX)、硫唑嘌呤)等)、关节内类固醇注射剂及生物试剂(例如肿瘤坏死因子阻断剂(依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗)、白细胞介素-1受体拮抗剂(阿那白滞素)和抗CD20抗体(利妥昔单抗))。然而，此类药物疗法的不利之处在于其可能引起副作用(例如胃肠道病症、肝病、肾衰竭和感染)。因此，迫切需要开发先进的治疗剂，其具有减少的副作用，能够改善类风湿性关节炎的表现(例如炎症、水肿、新生血管形成异常、骨及软骨破坏)。
胶原诱导性关节炎(CIA)已用作T淋巴细胞类风湿性关节炎的动物模型(Autoimmunity to Type II collagen:Experimental model of arthritis,J.Exp.Med.146;857-868(1977))。当用II型胶原注射对关节炎易感的实验小鼠时，在2周内引发关节炎，同时还形成血管翳和对骨和软骨的侵蚀。像类风湿性关节炎一样，胶原诱导性关节炎(CIA)也引起对胶原的体液/细胞免疫应答。
此外，细胞基质蛋白是在组织框架构造中发挥重要功能的组分，据大量研究报导，其在保持和控制组织的形状和功能方面起重要作用。TGF-β可诱导的基因-h3(β ig-h3)，即，由转化生长因子β(TGF-β)诱导的基质，是一种最近分子结构才已知的蛋白，其在控制细胞功能(例如粘附、迁移、分化和增殖)方面起重要作用。
β ig-h3已知是与TGF-β有关的基因，最初由Skonier等鉴定出。其在经TGF-β1处理的A549细胞系(人类肺腺癌细胞系)中在cDNA选择过程中被鉴定出，据报道，其在用TGF-β1处理后2天增加到20倍以上(Stonier,J.等，DNA cell Biol.11,511,1992)。通过分析β ig-h3的DNA序列，发现β ig-h3蛋白包含683个氨基酸，并且具有氨基末端分泌序列和能够被整联蛋白识别为配体的羧基末端Arg-Gly-Asp(RGD)序列。
发明内容
[技术问题]
在本发明的发明人对β ig-h3的功能进行研究时，他们确认：包含dhFas-1结构域(dhFas-1结构域是β ig-h3的缺乏H1区和H2区的第四fas-1结构域，下文称之为“dhFas-1”；人dhFas-1：“hsdhFas-1”；小鼠dhFas-1：“mdhFas-1”)的融合肽，更具体而言，包含dhFas-1结构域(dhFas-1结构域是β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域)、MMP(基质金属蛋白酶)底物和含RGD的肽的融合肽，对炎性疾病具有效果；并随后根据这一发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种融合肽，其包含：a)dhFas-1结构域，所述dhFas-1结构域为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物，和MMP共有底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的另一目的是提供编码所述融合肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供一种包含启动子和与所述启动子可操作地连接的所述多核苷酸的载体。
本发明的另一目的是提供一种用所述载体转化的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述肽作为活性成分。
本发明的另一目的是提供一种用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述载体作为活性成分。
本发明的另一目的是提供一种预防和治疗炎性疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用有效量的融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的另一目的是提供一种预防和治疗炎性疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用有效量的载体，所述载体包含启动子和与所述启动子可操作地连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物和MMP共有底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的另一目的是提供融合肽的应用，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的另一目的是提供载体在制备用于预防和治疗类风湿性关节炎的试剂中的应用，其中，所述载体包含启动子和与所述启动子可操作地连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
[技术方案]
为了实现上述目的，本发明提供一种融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
为了实现另一目的，本发明提供编码所述肽的多核苷酸。
为了实现另一目的，本发明提供一种包含启动子和与所述启动子可操作地连接的所述多核苷酸的载体。
为了实现另一目的，本发明提供一种用所述载体转化的宿主细胞。
为了实现另一目的，本发明提供一种用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述肽作为活性成分。
为了实现另一目的，本发明提供一种用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述载体作为活性成分。
为了实现另一目的，本发明提供一种预防和治疗炎性疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用有效量的融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
为了实现另一目的，本发明提供一种预防和治疗炎性疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用有效量的载体，所述载体包含启动子和与所述启动子可操作地连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为βig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
为了实现另一目的，本发明提供融合肽在制备用于预防和治疗炎性疾病的试剂中的应用，其中，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
为了实现另一目的，本发明提供载体在制备用于预防和治疗炎性疾病的试剂中的应用，其中，所述载体包含启动子和与所述启动子可操作地连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
在下文中将对本发明进行详细描述。
本发明提供一种融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的发明人已研究了提高dhFas-1的治疗功效的方法。随后，发明人发现，当使dhFas-1片段与包含RGD基序的肽融合时，其效果并未明显增大。但是，当用MMP(基质金属蛋白酶)底物将dhFas-1结构域和包含RGD基序的肽连接起来时，对炎性疾病的治疗效果显著增大。
本发明的融合肽的特征在于，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽，且所述上述组分是依次连接的。
β ig-h3是在包括人黑色素瘤细胞、哺乳动物上皮细胞、角质形成细胞和肺成纤维细胞在内的多种细胞(Skonier,J.等，DNA Cell Biol.,13,571,1994)以及成纤维细胞样滑膜细胞(Nam,E.J.等，Arthritis Rheum.,54,2734,2006)中由TGF-β诱导的细胞外基质蛋白。β ig-h3包含4个重复的同源内部结构域以及RGD基序。在包括哺乳动物、昆虫、海胆、植物、酵母和细菌在内的各种物种的分泌蛋白或膜蛋白中，发现上述结构域是高度保守的序列。已发现，包含该保守序列的蛋白包括骨膜素(periostin)、成束蛋白I、海胆HLC-2、海藻CAM和分支杆菌MPB70等(Kawamoto,T.等，Biochem.Biophys.Acta.,1395,288,1998)。保守性地存在于这些蛋白中的同源结构域(称为fas-1结构域)包含110～140个氨基酸，尤其是包含两个具有约10个高度同源的氨基酸的分支(H1和H2)。
dhFas-1是指从β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而制得的氨基酸链。βig-h3蛋白包含作为配体识别部位的RGD基序和作为4个重复的内部结构域的fas-1结构域。第四fas-1结构域包含与α3β1整联蛋白相互作用的基序和包含酪氨酸-组氨酸氨基酸序列的YH基序，并且介导成纤维细胞的粘附。此外，在第四fas-1结构域中，存在由约10个高度同源的氨基酸构成的H1和H2。
在本发明中，作为dhFas-1，可以使用任何氨基酸链，只要其是通过从已知的β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而制得的即可。优选的是，其可以是源自小鼠的dhFas-1(mdhFas-1)或源自人的dhFas-1(hsdhFas-1)。更优选的是，其可以是由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。此外，dhFas-1可以用常规方法(韩国专利公开第10-2004-0086708号)来制备。
在本发明中，作为包含RGD的氨基酸链，可以使用任何氨基酸链，只要其包含能够阻断整联蛋白的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列即可。优选的是，其可以是由SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列。
MMP底物是指被基质金属蛋白酶(MMP)分解的短氨基酸链。
已知的是，在类风湿性关节炎中，滑膜细胞通过分泌诸如MMP和组织蛋白酶等酶来破坏软骨基质。在类风湿性关节炎的滑液组织中，MMP-1和MMP-3高度表达且处于活化状态，并且与MMP一起还发生表达上调。这些MMP包括约19种不同的酶，大体分为4类MMP，即，胶原酶、明胶酶、基质裂解素(stromelysin)和膜类MMP(MT-MMP)。特别是，已知胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶2(MMP-2)和胶原酶3(MMP-13)是破坏最初胶原的主要胶原酶。
这些不同的MMP与炎性疾病有关。MMP-9的表达与内毒素休克(一种急性炎性疾病)有关；MMP-2和MMP-9与多发性硬化(一种炎性疾病)有关；MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-12和MMP-13与动脉粥样硬化有关，包括卒中与心肌梗塞。此外，MMP-2和MMP-9与二尖瓣狭窄有关；MMP-8和MMP-9与牙周炎和种植体周围炎(Peri-Implantitis)有关；MMP-12与慢性阻塞性肺疾病有关；MMP-2、MMP-8和MMP-9与哮喘有关；MMP-7和MMP-12与肺纤维化有关；MMP-2、MMP-3、MMP-8和MMP-9与肝炎有关；MMP-2、MMP-8和MMP-9与胰腺炎和脑膜炎有关(Jialiang Hu.等，Nat.Rev.Drug.Discov.6:480-498,2007)。因此，MMP底物可以视病症类型而有所不同。所以，本发明的MMP底物可以包括多种类型。
本发明的MMP底物是指被MMP降解的短肽，但并不限于此，具体而言，为MMP-1底物、MMP-2底物、MMP-3底物、MMP-7底物、MMP-8底物、MMP-9底物、MMP-12底物、MMP-13底物和MMP共有底物。MMP-1底物是指被MMP-1分解的短氨基酸链。MMP-2底物是指被MMP-2分解的短氨基酸链。MMP-3底物是指被MMP-3分解的短氨基酸链。MMP-7底物是指被MMP-7分解的短氨基酸链。MMP-8底物是指被MMP-8分解的短氨基酸链。MMP-9底物是指被MMP-9分解的短氨基酸链。MMP-12底物是指被MMP-12分解的短氨基酸链。MMP-13底物是指被MMP-13分解的短氨基酸链。MMP共有底物是指被MMP-1、MMP-2和MMP-3分解的短氨基酸链。
在本发明中，作为MMP底物，可以使用任何氨基酸链，只要该氨基酸链满足以下条件即可：该氨基酸链存在于dhFas-1与能够阻断整联蛋白的含RGD的氨基酸链之间，并且通过在炎症进程开始时被分解而提高dhFas-1和所述含RGD的氨基酸链的粘附效率。优选的是，其可以是包含由LGVR、QGIA、LGLW或LGIA表示的氨基酸序列的氨基酸链。更优选的是，其可以是包含由GPLGVRG、GPQGIAG、GPLGLWARG或GPLGIAG表示的氨基酸序列的氨基酸链。最优选的是，其可以是由氨基酸序列SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8表示的氨基酸链。
在包含a)dhFas-1结构域(其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域)、b)MMP(基质金属蛋白酶)底物和c)包含RGD基序的肽的融合肽(在下文中，该融合肽称作：“dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽”，还称作具有依次连接的mdhFas-1、MMP2底物和包含RGD基序的肽的融合肽：MFK23；“dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽”，又称具有依次连接的mdhFas-1、MMP1底物和包含RGD基序的肽的融合肽：MFK24；具有依次连接的mdhFas-1、MMP3底物和包含RGD基序的肽的融合肽：MFK27；具有依次连接的mdhFas-1、MMP共有底物和包含RGD基序的肽的融合肽：MFK25；具有依次连接的hsdhFas-1、MMP1底物和包含RGD基序的肽的融合肽：hsFJ24；具有依次连接的hsdhFas-1、MMP3底物和包含RGD基序的肽的融合肽：hsFJ27；具有依次连接的hsdhFas-1、MMP共有底物和包含RGD基序的肽的融合肽：hsFJ25)中，优选的是，所述包含RGD基序的肽可以是包含序列RGDSP或QERGDSLA的氨基酸链，或者所述MMP底物可以是包含序列GPQGIAG、GPLGLWARG或GPLGIAG的氨基酸链。
优选的是，本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽可以是包含dhFas-1结构域(其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域)、MMP底物和二者之间的由1～5个氨基酸组成的连接肽的肽；或者是包含MMP底物、RGD和二者之间的由1～5个氨基酸组成的连接肽的肽。
位于dhFas-1结构域(其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域)和MMP底物之间的本发明的连接肽由1～5个氨基酸组成。该连接物是在dhFas-1结构域和MMP底物之间进行连接的短肽，并且优选但并不限于的是，其可以是VD(缬氨酸-天冬氨酸)或VDG(缬氨酸-天冬氨酸-甘氨酸)。
此外，位于MMP底物和包含RGD基序的肽之间的本发明的连接肽由1～5个氨基酸组成。该连接物是在MMP底物和包含RGD基序的肽之间进行连接的短肽，并且优选但并不限于的是，其可以是LE(亮氨酸-谷氨酸)或EF(亮氨酸-苯丙氨酸)。
本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽可以更优选地是，RGD肽由以RGDSP或QERGDSLA表示的氨基酸序列组成，或MMP底物由以GPLGVRG、GPQGIAG、GPLGLWARG或GPLGIAG表示的氨基酸序列组成。最优选的是，其可以是具有氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQ IDNO:17的肽。
本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽可以是包含dhFas-1、MMP底物和包含RGD基序的肽的融合肽的功能等价物，优选的是，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQ IDNO:17的肽及其功能等价物。术语“功能等价物”是指与dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽、优选与氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17的氨基酸序列同源性为至少60%、优选70%、更优选80%、最优选90%的肽，而且，其是指显示出与优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQID NO:17的本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽等价的活性的肽。术语“基本等价的生理学活性”是指预防和抑制类风湿性关节炎的活性。所述功能等价物可以包括例如dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽，优选包括通过在具有氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17的肽的氨基酸序列中进行添加、取代或缺失而得到的氨基酸序列变体。优选的是，所述氨基酸取代是保守性取代。天然存在的氨基酸的保守性取代的实例可以是以下各氨基酸组中的氨基酸在同一氨基酸组内的取代：脂肪族氨基酸组(Gly、Ala、Pro)、疏水性氨基酸组(Ile、Leu、Val)、芳香族氨基酸组(Phe、Tyr、Trp)、酸性氨基酸组(Asp、Glu)、碱性氨基酸组(His、Lys、Arg、Gln、Asn)和含硫氨基酸组。氨基酸缺失优选指在本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽中的缺失，更优选为在与氨基酸序列为SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17的肽的活性无关的氨基酸区域中的缺失。氨基酸添加是指在不影响肽的活性的范围内的氨基酸添加，包括用于肽纯化的组氨酸标签或用于基因工程的限制性内切酶位点。
此外，功能等价物的范围包括对本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的部分化学结构进行了修饰的肽衍生物，优选为具有氨基酸序列SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17但保留了其主干和生理学活性的肽。例如，其可以包括在保留了用于改变本发明的肽的稳定性、储存性、挥发性或溶解性的结构变化及其生理学活性的同时，通过融合其他蛋白(例如GFP)而制得的融合蛋白。
用于制造本发明的肽的基因可以从任何来源的基因组DNA或cDNA文库中分离出，优选的是，其可以从人或小鼠的基因组DNA或cDNA中分离出。用于制造编码本发明的肽的基因的一般方法在现有技术中已有详细描述(Sambrook,Fitsch&Manatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版(1989))。此外，可以提供任何动物细胞来作为用于对编码本发明的肽的基因进行分子克隆的氨基酸来源。DNA可以用本领域中公知的技术从克隆的DNA中获得，而且，其可以从由表达蛋白的细胞制得的cDNA文库中获得，非常优选使用下述方法获得：化学合成或cDNA克隆或对基因组DNA或其片段的克隆或对某些细胞的分离片段的克隆(Sambrook，等1989,见上:Glover,D.M.(编).1985,DNA Cloning;Apractical Approach.MRL Press.Ltd.,Oxford.U.K.Vol.I,II)。从基因组DNA克隆的基因包括调控区和内含子区以及编码区。
本发明的肽可以由本领域的技术人员用本领域中公知的方法来制备。这些肽通常作为更大的肽的一部分表达自编码本发明的肽序列的多核苷酸，并且能够在原核细胞和真核细胞中制得。至于其他方法，这些肽可以通过化学合成来制备。重组宿主中的异种蛋白表达、多肽的化学合成和在试管中进行转录的方法在本领域是公知的，并且在以下参考文献中有详细描述：Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989),第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.；Berger和Kimmel,Methods in Enzymology,第152卷,Guide toMolecular Cloning Techniques(1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken I.M.(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser等，(1989)Ann.Rev.Biochem.57:957；和Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins,Wiley Publishing。
同时，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽，所述dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽包含a)dhFas-1结构域、b)MMP(基质金属蛋白酶)底物及MMP共有底物和c)包含RGD基序的肽。
所述多核苷酸可以不受限制，只要其是编码本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的多核苷酸即可，并且可以包括DNA、cDNA和RNA。优选的是，RGD结构可以是由包含RGDSP或QERGDSLA的氨基酸序列构成的肽，更优选的是，其可以是由氨基酸序列RGDSP或QERGDSLA构成的肽。MMP1底物是(但不限于)被MMP-1切割的MMP底物，MMP2底物是被MMP-2切割的MMP底物，MMP3底物是被MMP-3切割的MMP底物，MMP7底物是被MMP-7切割的MMP底物，MMP8底物是被MMP-8切割的MMP底物，MMP9底物是被MMP-9切割的MMP底物，MMP12底物是被MMP-12切割的MMP底物，MMP13底物是被MMP-13切割的MMP底物，MMP共有底物是被MMP-1、MMP-2和MMP-3切割的MMP底物。
在本发明中，作为MMP1底物、MMP3底物或MMP共有底物，可以使用任何氨基酸链，只要该氨基酸链满足以下条件即可：该氨基酸链存在于dhFas-1与能够阻断整联蛋白的含RGD的氨基酸链之间，并且通过在炎症进程开始时被降解而提高dhFas-1和含RGD的肽的粘附效率。优选的是，其可以包括由LGVR、QGIA、LGLW或LGIA表示的氨基酸序列。更优选的是，其可以包括由GPLGVRG、GPQGIAG、GPLGLWARG或GPLGIAG表示的氨基酸序列。
最优选的是，多核苷酸可以包括由SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:24表示的碱基序列。
所述多核苷酸可以从天然来源分离，或者可以用本领域已知的基因工程方法来制备。
此外，本发明提供一种包含启动子和与所述启动子可操作地连接的多核苷酸的载体，其中，所述多核苷酸编码肽(dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽)，所述肽包含：a)dhFas-1结构域；b)选自由MMP1底物、MMP3底物和MMP共有底物组成的组的MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽。
在本发明中，“载体”是指包含DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作地连接于能够影响该DNA在适合的宿主中的表达的适合的控制序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入序列。一旦被转化到适合的宿主中，载体便可以独立于宿主基因组而进行复制并发挥功能，或者，在一些情况下，载体可以整合到基因组本身中。由于质粒是目前最常用的载体形式，所以，在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用。为实现本发明的目的，优选使用质粒载体。用于此目的的常见质粒载体具有包含下述(a)、(b)和(c)的结构：(a)复制原点，用于有效地进行复制从而在一个宿主细胞中能够具有数百个质粒载体，(b)抗生素抗性基因，用于选择转化有该质粒载体的宿主细胞；(c)限制性内切酶切割位点，在该位点中能够插入外源DNA片段。虽然没有适合的限制性内切酶切割位点，但是，按照常规方法使用合成寡核甘酸适配子或连接序列，可以容易地将载体与外源DNA连接。
“启动子”是指对与该启动子可操作地连接的核酸序列在特定宿主细胞中的表达进行调控的DNA序列，术语“可操作地连接”是指一个核酸片段与另一个核酸片段连接以使得其功能或表达受到所述另一个核酸片段的影响。此外，启动子可以包括用于控制转录的操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译的终止的序列。作为启动子，其可以是组成性地诱导靶基因表达的组成型启动子，或者是诱导靶基因在特定位置和特定时间表达的诱导型启动子。
本发明的载体的实例包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体，但并不限于此。优选的表达载体包括针对基因表达的调控元件，例如启动子、操纵基因、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子，并且可以根据目的来制备多种载体。本发明的载体是用于将编码本发明的肽的核酸递送到宿主细胞内的手段，并且优选的病毒载体是诸如逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒等病毒载体。因此，通过使用病毒载体或直接导入DNA，在体内、离体或体外导入编码本发明的肽的基因。在靶组织中的表达可以通过以下方法来进行：使用病毒载体或受体配体或者使用组织特异性启动子，或二种方法都使用，使突变载体靶向特定细胞，。
对于DNA病毒载体，其可以包含减弱的或缺损的DNA病毒，例如但不限于：单纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疫苗病毒。优选的是，其可以是使全部或大部分病毒基因缺失而得到的缺损病毒。由于缺损病毒没有复制能力，其在导入细胞后不能引发病毒感染。因此，如果使用缺损病毒载体，在施用时可以不必担心其会感染其他细胞。所以，可以靶向特定组织。
同时，本发明中所用的重组DNA和分子克隆的标准技术在本领域是公知的，且在以下参考文献中有所描述：Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)；Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with GeneFusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984)；和Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,由Greene Publishing Assoc.和Wiley-lnterscience出版(1987)。
此外，本发明提供一种用本发明的载体转化的宿主细胞。
所述宿主细胞可以选自对插入序列的表达进行调控或推进优选的遗传程序的那些细胞。关于蛋白的翻译和翻译后的加工及修饰，不同的宿主细胞具有特定的机制。对于适合的细胞系或宿主细胞系统，其可以选自对异种蛋白进行优选的修饰和加工的那些细胞系或宿主细胞系统。在酵母中的表达可以产生具有生物活性的产物。在真核细胞中的表达可以增加“天然”折叠的可能性。
本领域中已知的任何宿主细胞都可以使用，只要其能够稳定且持续地克隆并表达本发明的载体即可，例如，可以使用大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21DE、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776、大肠杆菌W3110。此外，可以使用土壤杆菌属物种(例如土壤杆菌A4)、芽孢杆菌属物种(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌(鼠伤寒沙门菌或粘质沙雷菌)和各种假单胞菌属物种。
此外，在用本发明的载体转化真核细胞时，对于宿主细胞，可以使用酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞和人类细胞(例如，CHO细胞系(中华仓鼠卵巢)、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞系)。
本发明的宿主细胞优选可以是大肠杆菌。
可以使用通过将载体导入宿主细胞来转化宿主细胞的任何方法，但不限于此。例如，可以通过磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖法、电穿孔、直接微注射、装载有DNA的脂质体、脂质转染胺(Lipofectamine)-DNA复合体、细胞超声、使用高速微弹(microprojectile)的基因轰击、多聚阳离子和受体介导的转染来进行转化。为了在体内或体外应用，可以对这些技术中的一些进行修改。
导入到宿主细胞中的载体能够表达，在此情况下，可以获得大量重组的肽或蛋白。例如，在载体包含lac启动子的情况下，可以通过用IPTG处理宿主细胞来诱导基因表达。
在本发明的方法中，可以使用本领域中常规使用的培养基来进行培养经转化的宿主细胞。例如，当转化体是原核细胞(例如，大肠杆菌)时，可以使用LB(Luria-Bertani)培养基来培养转化体。当转化体是动物细胞时，例如，可以使用Eagle氏MEM(Eagle氏最低基础培养基，Eagle,H.Science130:432(1959))来培养转化体。
转化体的各种培养方法对与本领域的技术人员来说是熟知的，并且在Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中有所描述，并通过援引将该文献并入本公开中。
本发明的融合肽对炎性疾病具有效果。本发明的炎性疾病可以包括但不限于：常见炎症症状，例如水肿、炎性肠病、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝织炎、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、囊性纤维化病、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性毛细支气管炎、慢性毛细支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、莱特尔氏综合征、银屑病性关节病、与炎性肠病相关的脊柱炎、少年关节病、少年强直性脊柱炎、反应性关节病、感染性关节病、感染后关节炎、淋病性关节炎、结核性关节炎、病毒性关节炎、真菌性关节炎、梅毒性关节炎、莱姆病、与“血管炎综合征”相关的关节炎、结节性多动脉炎、超敏性血管炎、韦格纳氏肉芽肿病、风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、钙晶体沉积型关节病、假性痛风、非关节性风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、神经性关节病、关节腔出血症(关节积血(hemarthrosic))、亨诺-许兰氏紫癜、多中心网状组织细胞增多症、血红蛋白病、家族性地中海热、贝切特氏病、全身性红斑狼疮、败血病、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎。此外，炎性疾病的实例包括炎性皮肤病，例如急性和慢性湿疹、特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、日光性皮炎和银屑病。优选的是，本发明的炎性疾病可以是类风湿性关节炎。
本发明的肽对类风湿性关节炎的治疗效果非常优异。
本发明的组合物的特征通过实施例来描述。
在本发明的一个实施方式中，制备了mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽(MFK24和MFK25)、mdhFas-1和hsdhFas-1及mdhFas-1-RGD结构肽(MFK12)，并测量了对滑膜细胞的粘附和迁移的抑制效果。
结果发现，与常规的YH18基序、mdhFas-1和mdhFas-1结构修饰肽相比，MKF24和MKF25对细胞的粘附和迁移显示出非常高的抑制效果。此外，当在同一细胞粘附试验中单独使用或组合使用mdhFas-1和RGDSP时，发现MFK24与mdhFas-1和RGDSP相比显示出最高的细胞粘附抑制效果(见实施例3和比较例1和2)。
在本发明的另一个实施方式中，在胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型中，发现本发明的肽显示出关节炎治疗效果。
在预定的时期内施用本发明的肽，同时测量关节炎指数并与对照组进行比较。结果发现，本发明的包含被MMP-1分解的MMP1底物的肽显示出较高的关节炎抑制效果，甚至在以0.1mg/kg的剂量施用的组中也是如此，而且这一效果得到了保持；同时，以30mg/kg的剂量施用了mdhFas-1或MFK12的对照组显示出了关节炎抑制效果，而包含被MMP-2分解的MMP2底物的mdhFas-1-MMP2底物-RGD结构肽(下文称之为“MFK23”)则显示出不足的关节炎抑制效果。
此外，当检查实验小鼠的足部组织时，观察到在施用了本发明的肽的组中，即使在以0.1mg/kg的剂量施用的组中，滑膜细胞的增殖也受到了抑制，且软骨和骨的变形有所减少。此外，在测量炎症介质的量时，发现施用了本发明的肽的组(即使是以0.1mg/kg的剂量施用的组)有效地抑制了炎症介质。
对于MFK12的情况，在以10mg/kg的剂量施用的组中，观察到关节区遭到了破坏，而且滑膜细胞过度增殖，还发现，血管化诱导和细胞粘附蛋白的表达增加到与对照组中的一样多。同时，以30mg/kg施用的组显示出一定程度的疗效。此外，通过测量炎症介质，发现以10mg/kg的剂量施用了MFK12的组与对照组的炎症介质表达水平没有显著差异，而以30mg/kg的剂量施用的组显示出下降的表达水平(见实施例4和比较例3和4)。
因此确定，本发明的肽具有非常高的关节炎治疗效果，该效果是常规肽的100倍以上。
因此确定，与dhFas-1和MKF12相比，本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽，即使在剂量非常低时也显示出较高的对类风湿性关节炎的效果。
因此，本发明提供一种用于预防和治疗类风湿性关节炎的药物组合物，所述药物组合物包含dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽作为活性成分。
本发明的组合物包含一种融合肽作为活性成分，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，其为β ig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物，和MMP共有底物；和c)包含RGD基序的肽。
本发明的MMP底物是指被MMP降解的短肽，但并不限于此，具体而言，为MMP-1底物、MMP-2底物、MMP-3底物、MMP-7底物、MMP-8底物、MMP-9底物、MMP-12底物、MMP-13底物和MMP共有底物。在本发明中，MMP底物优选可以是包含由LGVR、QGIA、LGLW或LGIA表示的氨基酸序列的氨基酸链。更优选的是，其可以是包含由GPLGVRG、GPQGIAG、GPLGLWARG或GPLGIAG表示的氨基酸序列的氨基酸链。
在本发明的用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物中，含RGD的氨基酸链可以是包含由RGDSP或QERGDSLA表示的氨基酸序列的氨基酸链。更优选的是，所述肽可以具有由SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列，并且包括其功能等价物。在使用本发明的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽时，其与dhFas-1相比，可以显示出更高的功效，即使在剂量低时也是如此。此外，由于其片段相对较短，蛋白不会簇集在一起。因此，在其配制过程中，调控更加容易，而且在药物递送方面也具有优势。
另外，通过在体内表达包含编码dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的多核苷酸的载体，可以产生可有效预防和治疗炎性疾病的物质。因此，本发明提供一种用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含载体作为活性成分，所述载体包含编码dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的多核苷酸。
本发明的组合物的适用疾病为炎性疾病，优选为类风湿性关节炎。
本发明的药物组合物可以仅包含dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽或含有编码dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的多核苷酸的载体，或者还可以一起包含一种或多种额外的药学上可接受的载剂。
药学上可接受的载剂可以包括例如胃肠外制剂用载剂或口服制剂用载剂。口服制剂用载剂可以包含乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸。此外，其可以包含用于口服施用肽试剂的各种药物递送物质。另外，胃肠外制剂用载剂可以包含水、油、盐水、水性葡萄糖和甘醇以及稳定剂和防腐剂。稳定剂的实例可以是抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。防腐剂的实例可以是氯化苄烷铵、对羟苯甲酸甲酯或苯酯以及氯丁醇。药学上可接受的载剂的列表在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版)，MackPublishing Company,Easton,PA,1995中公开。
本文所用的术语“有效量”是指对受试对象的相关疾病显示出治疗效果的量，而“受试对象”指的是哺乳动物，且优选是指包括人在内的哺乳动物。受试对象可以是需要治疗疾病的患者。
本发明的药物组合物可以通过各种途径对包括人在内的哺乳动物施用。对于肠胃外施用(但不限于此)，可以通过静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜下、心内、皮内、皮下、腹膜内、鼻内、胃肠道、胃肠外、舌下或直肠途径进行施用。
可以根据上述施用途径将本发明的药物组合物配制成口服制剂或胃肠外制剂。
对于口服施用制剂的情况，可以使用本领域中已知的方法用适当的用于口服施用的载剂将本发明的组合物配制成粉末、颗粒剂、片剂、丸剂和糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆剂(slurry)和乳剂。例如，片剂或糖衣片剂的口服制剂可以通过将活性成分与固体赋形剂混合、研磨、添加适当的佐剂并加工成颗粒混合物来获得。对于适合的载剂的实例，其可以包括：糖，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇和麦芽糖醇；淀粉，包括玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和土豆淀粉；纤维素，包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；和填充剂，包括明胶和聚乙烯吡咯烷酮。如有需要，其可以包含交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为固溶化剂(solutionizer)。此外，本发明的药物组合物可以包含抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和杀菌剂。
对于胃肠外制剂，可以根据本领域公知的技术将其制备成注射剂、乳膏、洗剂、软膏剂、油剂、保湿剂、凝胶剂、气雾剂和鼻吸入剂。这些制剂在参考文献Remington'sPharmaceutical Science,第15版,1975.Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,第87章:Blaug,Seymour中有所公开。
本发明的组合物中的dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的总有效量可以以单一剂量施用给患者，或者按照分段治疗方案以多剂量施用。根据施用目的，本发明的药物组合物可以包含可变量的有效成分。然而，优选的是，其每天可以以0.01ug～1,000mg/kg体重/日的量、优选以0.1ug～100mg/kg体重/日的量进行施用。但是，该剂量可以通过考虑各种因素来适当确定，例如需要治疗的受试对象的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄情况以及施用时间和施用途径等因素。因此，当考虑这些因素时，本领域技术人员可以确定dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的用于预防和治疗类风湿性关节炎的适合剂量。本发明的药物组合物可以不限制制剂、施用途径和施用方法，只要其显示出本发明的效果即可。
[有益效果]
因此，本发明的融合肽抑制因滑膜细胞的粘附和迁移而导致的类风湿性关节炎扩大，并且可以用来通过抑制免疫细胞的浸润而预防或治疗炎性疾病。
附图说明
图1是免疫印迹结果，其显示了hsdhFas-1(人β ig-h3的fas-1结构域的经结构修饰的肽)的序列和hsdhFas-1重组肽的表达。
图2是免疫印迹结果，其显示了mdhFas-1(小鼠β ig-h3的fas-1结构域的经结构修饰的肽)的序列和mdhFas-1重组肽的表达。
图3是免疫印迹结果，其显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到hsdhFas-1的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度)。
图4是免疫印迹结果，其显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到mdhFas-1的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度)。
图5是免疫印迹结果，其显示了包含与氨基酸序列RGDSP连接的mhdFas-1的肽(MFK12)的序列和MFK12重组肽的表达。
图6的结果显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到MFK12的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度)。
图7是免疫印迹结果，其显示了MKF23的序列和MKF23重组肽的表达。
图8是免疫印迹结果，其显示了MKF24的序列和MKF24重组肽的表达。
图9是免疫印迹结果，其显示了MKF25的序列和MKF25重组肽的表达。
图10是MMP-1、MMP-2和MMP-3以及组织蛋白酶K、L和D对具有MMP-2底物的MFK23肽的酶解消化试验的结果(MFK23(ug)：所施用的MFK23肽的量(ug)；MMP1(ng)、MMP2(ng)、MMP3(ng)：在该消化酶试验中使用的MMP(基质金属蛋白酶)1、MMP2或MMP3的量；组织蛋白酶D(ng)、组织蛋白酶L(ng)和组织蛋白酶K(ng)：在该消化酶试验中使用的组织蛋白酶D、组织蛋白酶L或组织蛋白酶K的量；Ab-组氨酸：结合到抗组氨酸抗体上的肽的量；Ab-bigh3：结合到抗Bigh3抗体上的肽的量；标准化比率(组氨酸/big-h3)：组氨酸的量/big-h3的量)。
图11是MMP-1、MMP-2和MMP-3以及组织蛋白酶K、L和D对具有MMP-1底物的MFK24肽的酶解消化试验的结果(MFK24(ug)：所施用的MFK24肽的量(ug)；MMP1(ng)、MMP2(ng)、MMP3(ng)：在该消化酶试验中使用的MMP1、MMP2或MMP3的量；组织蛋白酶D(ng)、组织蛋白酶L(ng)和组织蛋白酶K(ng)：在该消化酶试验中使用的组织蛋白酶D、组织蛋白酶L或组织蛋白酶K的量；Ab-组氨酸：结合到抗组氨酸抗体上的肽的量；Ab-bigh3：结合到抗Bigh3抗体上的肽的量；标准化比率(组氨酸/big-h3)：组氨酸的量/big-h3的量)。
图12是MMP-1、MMP-2和MMP-3以及组织蛋白酶K、L和D对具有MMP共有底物的MFK25肽的酶解消化试验的结果(MFK25(ug)：所施用的MFK25肽的量(ug)；MMP1(ng)、MMP2(ng)、MMP3(ng)：在该消化酶试验中使用的MMP1、MMP2或MMP3的量；组织蛋白酶D(ng)、组织蛋白酶L(ng)和组织蛋白酶K(ng)：在该消化酶试验中使用的组织蛋白酶D、组织蛋白酶L或组织蛋白酶K的量；Ab-组氨酸：结合到抗组氨酸抗体上的肽的量；Ab-bigh3：结合到抗Bigh3抗体上的肽的量；标准化比率(组氨酸/big-h3)：组氨酸的量/big-h3的量)。
图13是关于用人滑膜细胞分泌的MMP-1切割MFK24肽的酶解消化试验的结果(βig-h3：用抗β ig-h3测得的肽量；组氨酸：用抗组氨酸测得的肽量；MMP-1：MMP-1的量；未处理：未用MKF24处理；MFK24 3小时：用MFK24处理后3小时测得的结果；MFK246小时：用MFK24处理后6小时测得的结果；纯化的MFK24：用抗β ig-h3和抗组氨酸处理的纯化的MFK24)。
图14的结果显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到MFK23的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度)。
图15的结果显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到MFK24的浓度依赖性抑制。图15C是MFK24、dhFas-1肽与RGDSP肽的混合组合物、dhFas-1肽和RGDSP肽对NIH3T3细胞系的粘附的抑制程度的比较性实验结果图(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度；MFK24：所添加的MFK24的浓度；dhfas-1：所添加的dhfas-1的浓度；RGDSP：所添加的包含氨基酸序列RGDSP的肽的浓度)。
图16的结果显示出，β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附(A)和迁移(B)受到MFK25的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%)；迁移(%)：细胞迁移(相对迁移，以对照组为100%)；浓度(uM)：所添加的肽的浓度)。
图17显示了在小鼠CIA模型中利用临床关节炎指数对MFK23的关节炎抑制效果进行测量的结果(A)，以及对实验小鼠的体重的测量的结果(B)(临床关节炎指数：临床关节炎指数；天数：施用诱导关节炎用的胶原注射剂后的天数；对照：施用PBS来代替肽的对照组；MFK23 1mg/kg、MFK23 10mg/kg、MFK23 30mg/kg：以每日1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK23的组；重量(g)：体重(g)；之前：施用肽之前(第22天)；之后：施用肽之后(第48天))。
图18显示了通过HE染色观察到的用MFK23处理过的CIA小鼠模型的滑膜组织(对照：施用PBS来代替肽的对照组；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg：以每日1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK23的组；H&E：显示出苏木素、曙红染色结果的照片；CD31：显示出使用抗CD31抗体作为内皮细胞标志物进行的免疫组化试验的结果；ICAM-1：显示出使用抗ICAM-1(胞间粘附分子-1)抗体进行的免疫组化试验的结果)。
图19显示了在小鼠CIA模型中利用临床关节炎指数对MFK24的关节炎抑制效果进行测量的结果(A)，以及对实验小鼠的体重进行测量的结果(B)(临床关节炎指数：临床关节炎指数；天数：施用诱导关节炎用的胶原注射剂后的天数；对照：施用PBS来代替肽的对照组；MFK24 0.1mg/kg、MFK24 1mg/kg、MFK24 10mg/kg、MFK24 30mg/kg：以每日0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK24的组；重量(g)：体重(g)；之前：施用肽之前(第22天)；之后：施用肽之后(第48天))。
图20显示了通过HE染色观察到的用MFK24处理过的CIA小鼠模型的滑膜组织(对照：施用PBS来代替肽的对照组；0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg：以每日0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg的量施用MFK24的组；H&E：显示出苏木素、曙红染色结果的照片)。
图21显示了在用MFK24处理过的CIA小鼠模型关节组织中炎症介质的转录本数量(对照：施用PBS来代替肽的对照组；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg：以每日1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK24的组；TNF-α：肿瘤坏死因子α；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；IL-1β：白细胞介素1β；CCL-2：趋化因子(C-C基序)配体2；MMP-1：基质金属蛋白酶-1；MMP-3：基质金属蛋白酶-3；IL-6：白细胞介素6；VCAM-1：血管细胞粘附分子-1)。
图22是免疫印迹结果，其显示出，在用MFK24处理过的CIA小鼠模型中，ICAM-1和RANKL的表达受到了依赖于处理浓度的抑制(正常：未诱导关节炎的组；对照：施用PBS来代替肽的对照组；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg：以每日1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK24的组；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；ICAM-1：胞间粘附分子-1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶)。
图23显示了在小鼠CIA模型中利用临床关节炎指数对mdhFas-1的关节炎抑制效果进行测量的结果(A)，以及对实验小鼠的体重进行测量的结果(B)(临床关节炎指数：临床关节炎指数；天数：施用诱导关节炎用的胶原注射剂后的天数；对照：施用PBS来代替肽的对照组；mdhFas-1 10mg/kg、mdhFas-1 30mg/kg：以每日10mg/kg和30mg/kg的量施用mdhFas-1的组；重量(g)：体重(g)；之前：施用肽之前(第22天)；之后：施用肽之后(第48天))。
图24显示了在小鼠CIA模型中利用临床关节炎指数对MFK12的关节炎抑制效果进行测量的结果(A)，以及对实验小鼠的体重进行测量的结果(B)(临床关节炎指数：临床关节炎指数；天数：施用诱导关节炎用的胶原注射剂后的天数；对照：施用PBS来代替肽的对照组；MFK12 10mg/kg、MFK12 30mg/kg：以每日10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK12的组；重量(g)：体重(g)；之前：施用肽之前(第22天)；之后：施用肽之后(第48天))。
图25显示了通过HE染色观察到的用MFK12处理过的CIA小鼠模型的滑膜组织(对照：施用PBS来代替肽的对照组；10mg/kg、30mg/kg：以每日10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK12的组；H&E：显示出苏木素、曙红染色结果的照片；CD31：显示出使用抗CD31抗体作为内皮细胞标志物进行的免疫组化试验的结果；ICAM-1：显示出使用抗ICAM-1(胞间粘附分子-1)抗体进行的免疫组化试验的结果)。
图26显示了在用MFK12处理过的CIA小鼠模型关节组织中炎症介质的转录本数量(对照：施用PBS来代替肽的对照组；10mg/kg、30mg/kg：以每日10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK12的组；TNF-α：肿瘤坏死因子α；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；IL-1β：白细胞介素1β；CCL-2：趋化因子(C-C基序)配体2；MMP-1：基质金属蛋白酶-1；MMP-3：基质金属蛋白酶-3；IL-6：白细胞介素6；VCAM-1：血管细胞粘附分子-1)。
图27是免疫印迹结果，其显示出，在用MFK12处理过的CIA小鼠模型中，ICAM-1和RANKL的表达受到了依赖于处理浓度的抑制(正常：未诱导关节炎的组；对照：施用PBS来代替肽的对照组；10mg/kg、30mg/kg：以每日10mg/kg和30mg/kg的量施用MFK12的组；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；ICAM-1：胞间粘附分子-1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶)。
图28显示出了MFK27肽的序列，其中，作为基本结构的mdhFas-1与MMP3底物肽和QERGDSLA肽连接。
图29显示出了hsFJ24肽的序列，其中，作为基本结构的hsdhFas-1与MMP1底物肽和QERGDSLA肽连接。
图30显示出了hsFJ25肽的序列，其中，作为基本结构的hsdhFas-1与MMP共有底物肽和QERGDSLA肽连接。
图31显示出了hsFJ27肽的序列，其中，作为基本结构的hsdhFas-1与MMP3底物肽连接。
图31是免疫印迹结果，其显示了HsFJ27的序列和HsFJ27重组肽的表达。
图32的结果显示出β ig-h3介导的NIH3T3细胞系的粘附受到MFK27的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%))。
图33的结果显示出β ig-h3介导的FLS细胞系的粘附受到HsFJ24的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%))。
图34的结果显示出β ig-h3介导的FLS细胞系的粘附受到HsFJ25的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%))。
图35的结果显示出β ig-h3介导的FLS细胞系的粘附受到HsFJ27的浓度依赖性抑制(粘附(%)：细胞粘着(相对粘着，以对照组为100%))。
具体实施方式
在下文中将参照实施例对本发明进行详细描述。
然而，以下实施例是阐明本发明而不试图限制本发明。
<比较例1>
调查dhFas-1肽对细胞的粘附和迁移的影响
合成了人β ig-h3的fas-1结构域的经结构修饰的肽作为重组肽(下文中称之为“hsdhFas-1肽”)(见图1)。
将人β ig-h3以5ug/ml的浓度加入96孔平板中，并在4℃下包被14小时。在DMEM+0.5%BSA(牛血清清蛋白)培养基中，加入人成纤维细胞(NIH3T3)，并向其中注射各种浓度的hsdhFas-1肽，随后进行混合。将所得的混合物在37℃下培养30分钟，并将其平板接种在经包被的孔上。将其培养2小时，而后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤以除去未吸附的细胞，随后添加将被细胞内的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活化的底物(4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，Simga，U.S.)，随后在37℃下培养1小时。随后，向其中添加甘氨酸EDTA溶液(0.5MEDTA，50mM甘氨酸，pH10.4)，通过吸光度来测量视吸附的细胞的数量而定的着色程度。
在调查hsdhFas-1肽对滑膜细胞的粘附和迁移的抑制效果时发现，如图3所示，在人滑膜细胞中，β ig-h3介导的粘附受到了浓度依赖性抑制。
此外，还合成了小鼠β ig-h3的fas-1结构域的经结构修饰的肽作为重组肽(下文中称之为“mdhFas-1肽”，见图2)，并按照与使用人β ig-h3的试验中相同的方式，使用小鼠细胞系(即NIH3T3细胞系)测试了mdhFas-1肽对滑膜细胞的粘附和迁移的抑制效果。
结果如图4所示，发现mdhFas-1像hsdhFas-1一样，以浓度依赖性方式抑制了β ig-h3介导的粘附/迁移。
<比较例2>
调查MFK12肽对细胞的粘附和迁移的影响
基于mdhFas-1以处理浓度依赖性方式抑制小鼠CIA模型中的关节炎活性这一结果，为了设计能够在低剂量施用时显示出高治疗效果的肽，制备了将mdhFas-1(基本结构)与RGDSP肽连接在一起的肽(下文称之为“MFK12肽”)(见图5)。
将mdhFas-1-RGD结构肽克隆至pET29b表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss或Rosetta(DE3)中。培养转化后的大肠杆菌以表达mdhFas-1-RGD结构肽。
通过使用小鼠β ig-h3(NM_009369)作为模板和引物(正向5'-TATCATATGCAAGCCATGCC-3'，反向5'-TCACCGAATTCCATGATGTC-3')，对编码从小鼠β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而得到的肽(即mdhFas-1)的基因进行PCR扩增。使用限制性内切酶Nde I和EcoR I将扩增产物克隆到pET29b表达载体中。此外，在RGDSP肽中，使引物(正向5'-AATTCGGAGGACGAGGAGATTCACCCGATGATGATGATGATC-3'，反向5'-TCGAGATCATCATCATCATCGGGTGAATCTCCTCGTCCTCCG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含dhFas-1序列的pET29b表达载体上的限制性内切酶EcoR I和Xho I中。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21DE中。
[表1]
载体用引物
以与比较例1相同的方式测试MFK12肽对小鼠成纤维细胞的粘附和迁移的影响。
结果如图6所示，发现MFK12抑制了细胞的粘附和迁移，甚至在比比较例1的浓度更低的情况下也是如此。
<实施例1>
dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的制备和分离
<1-1>mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的制备和分离I
将mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽克隆至pET29b表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss或Rosetta(DE3)中。培养转化后的大肠杆菌以表达mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽。将mdhFas-1(基本结构)与MMP2底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“MFK23肽”(见图7)；将mdhFas-1(基本结构)与MMP1底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“MFK24肽”(见图8)；将mdhFas-1(基本结构)与MMP共有底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“MFK25肽”(见图9)。
通过使用小鼠β ig-h3(NM_009369)作为模板和引物(正向5'-tatcatatgcaagccatgcc-3'，反向5'-tcaccgaattccatgatgtc-3')，对编码从小鼠β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而得到的肽(即mdhFas-1)的基因进行PCR扩增。
使用限制性内切酶Nde I和EcoR I将扩增产物克隆到pET29b表达载体中，并且，使针对MMP底物序列的引物(针对MMP1底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3'；针对MMP2底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACTGGGAGTCCGAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTCGGACTCCCAGTGGTCCG-3'；针对共有底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG-3'；)互补地结合到模板上，随后将其插入包含dhFas-1的pET29b表达载体上的限制性内切酶EcoR I和Sal I中。
此外，在QERGDSLA肽中，使引物(正向5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'，反向5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含dhFas-1-MMP底物序列的pET29b表达载体上的限制性内切酶Sal I和Xho I中。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21DE中。
[表2]
载体用引物
<1-2>mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的制备和分离II
将mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽克隆至pET29b表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss或Rosetta(DE3)中。培养转化后的大肠杆菌以表达mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽。将mdhFas-1(基本结构)与MMP3底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“MFK27肽”(见图28)。
为了提高mdhFas-1-MMP3底物-RGD结构肽在大肠杆菌中的表达，通过使用小鼠βig-h3(NM_009369)作为模板和引物(正向5'-AGTACATATGATGGCGCTCCT-3'，反向5'-AGTACATATGATGGCGCTCCT-3')，对小鼠β ig-h3的信号肽序列进行了PCR扩增。使用限制性内切酶Nde I和Bgl II将扩增产物克隆到pET29b表达载体中。
通过使用小鼠β ig-h3(NM_009369)作为模板和引物(正向5'-ACAGATCTCAAGCCATGCCT-3'，反向5'-ACGAATTCCATGATGTCGGT-3')，对编码从小鼠β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而得到的肽(即mdhFas-1)的基因进行PCR扩增。使用限制性内切酶Bgl II和EcoR I将扩增产物克隆到包含信号肽序列的pET29b表达载体中。
使针对MMP3底物的引物(正向5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含信号肽序列和dhFas-1的pET29b表达载体上的限制性内切酶EcoR I和Sal I中。
此外，在QERGDSLA肽中，使引物(正向5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'，反向5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含信号肽序列、dhFas-1和MMP3底物序列的pET29b表达载体上的限制性内切酶Sal I和Xho I中。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21DE中。
[表3]
载体用引物
<1-3>mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的制备和分离I
将hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽克隆至pET29b表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss或Rosetta(DE3)中。培养转化后的大肠杆菌以表达hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽。将hsdhFas-1(基本结构)与MMP1底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“hsFJ24肽”(见图29)；将hsdhFas-1(基本结构)与MMP共有底物肽和QERGDSLA肽连接在一起的肽称作“hsFJ25肽”(见图30)。
通过使用人β ig-h3(M77349)作为模板和引物(正向5'-TATATCATATGCGAGCCCTG-3'，反向5'-TATATCATATGCGAGCCCTG-3')，对编码从人β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而得到的肽(即hsdhFas-1)的基因进行PCR扩增。使用限制性内切酶Nde I和EcoR I将扩增产物克隆到pET29b表达载体中。随后，使针对MMP底物序列的引物(针对MMP1底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3'；针对MMP3底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'，反向5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'；针对共有底物的引物：正向5'-AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG-3'；)互补地结合到模板上，随后将其插入包含dhFas-1的pET29b表达载体上的限制性内切酶EcoR I和Sal I中。
此外，在QERGDSLA肽中，使引物(正向5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'，反向5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含dhFas-1-MMP底物序列的pET29b表达载体上的限制性内切酶Sal I和Xho I中。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21DE中。
[表4]
载体用引物
<1-4>hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的制备和分离II
将hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽克隆至pET29b表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss或Rosetta(DE3)中。培养转化后的大肠杆菌以表达hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽，将hsdhFas-1(基本结构)与MMP3底物肽连接在一起的肽称作“hsFJ27肽”(见图31)。
为了提高hsdhFas-1-MMP3底物-RGD结构肽在大肠杆菌中的表达，通过使用人βig-h3(M77349)作为模板和引物(正向5'-ATGCATATGATGGCGCTCTTC-3'，反向5'-AAATAGATCTCGCCAGGGTCGC-3')，对人β ig-h3的信号肽序列进行了PCR扩增。使用限制性内切酶Nde I和Bgl II将扩增产物克隆到pET29b表达载体中。
通过使用人β ig-h3(M77349)作为模板和引物为(正向5'-AAGATCTTTCCGAGCCCTG-3'，反向5'-ACCGAATTCCATGATGTCAGG-3')，对编码从人β ig-h3的第四fas-1结构域中除去H1和H2区而得到的肽(即hsdhFas-1)的基因进行PCR扩增。使用限制性内切酶Bgl II和EcoRI将扩增产物克隆到包含该信号肽序列的pET29b表达载体中。
使针对MMP3底物的引物(正向5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'，反向5'-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含信号肽序列和dhFas-1的pET29b表达载体上的限制性内切酶EcoR I和Sal I中。
此外，在QERGDSLA肽中，使引物(正向5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'，反向5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')互补地结合到模板上，随后将其插入包含信号肽序列、dhFas-1和MMP3底物序列的pET29b表达载体上的限制性内切酶Sal I和Xho I中。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21DE中。
[表5]
载体用引物
[表6]
dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽
<1-5>dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的分离和鉴定
通过对在实施例<1-1>至<1-4>中转化的菌株进行培养，过表达了dhFas-1-MMP底物-RGD结构肽，并随后对其进行了分离和鉴定。
对过表达后获得的培养基进行20分钟的离心(4℃，2000g)。除去上清液，仅收集细胞。按每100ml培养基添加4ml的量，将裂解缓冲液(50mM Tris-Cl(pH8.0)、500mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT、1%Triton X114)添加到细胞球团(pellet)中，并搅拌混合物。随后，用超声波破碎细胞。对破碎的细胞进行15分钟的离心(4℃，13000rpm)，而后将上清液(50ml)转移到试管中。均匀混合Ni-NTA琼脂糖珠(QIAGEN)，并取其3ml转移到试管中，而后用结合缓冲液(50mM Tris-Cl(pH8.0)、500mM NaCl、5mM咪唑(pH7.8))洗涤两次。向处于50%悬浮状态的洗涤后的Ni-NTA琼脂糖珠中添加上述上清液，用搅拌器于4℃将其搅拌2小时，而后转移到柱中。随后，在4℃下，向Ni-NTA琼脂糖珠中添加该琼脂糖珠10倍体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-Cl(pH8.0)、500mM NaCl、20mM咪唑(pH7.8)、0.1%Triton X-114)并用该缓冲液进行洗涤，从而除去非特异性结合的蛋白。使用洗脱缓冲液(50mMTris-Cl(pH8.0)、500mM NaCl、300mM咪唑(pH7.8))来提取本发明的肽。为了在所产生的重组蛋白中保持每只小鼠1EU以下的LPS(脂多糖)，使用了Triton X-114来除去LPS。随后，使用LPS去除柱(Cambrex，德国)从分离的肽中再次除去LPS。
结果如图7～9和图28～31中所示，发现MFK23、MFK24、MFF25、MFK27、HsFJ24、HsFJ25和HsFJ27过表达且通过纯化过程得到了分离。
<实施例2>
对mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽进行的酶解消化试验
为了确定特定的MMP切割了MFK24和MFK25，进行了酶分析和培养物分析。
<2-1>对mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽进行的酶解消化试验
将3ug合成的mdhFas-1-MMP底物结构修饰蛋白以及MMP1(5ng、10ng和50ng)、MMP2(100ng、200ng和800ng)、MMP3(10ng、50ng和100ng)、组织蛋白酶D(5ng、10ng和50ng)、组织蛋白酶L(100ng、200ng和800ng)和组织蛋白酶K(10ng、50ng和100ng)与酶缓冲液(150mMNaCl、5mM CaCl2、20mM Tris-HCl pH7.5)混合，并使之在37℃下反应4小时。使所得产物电泳通过15%的聚丙烯酰胺凝胶，转移到硝酸纤维膜(Schleicher&Schuell)上，在室温下用含3%BSA的TBST溶液(20mmole/l Tris-HCl、137mmole/l NaCl、0.1%Tween-20)封闭1小时，用TBST溶液洗涤3次(每次10分钟)，并与一抗(抗组氨酸或抗Bigh3)反应1小时。所得产物用TBST溶液洗涤3次(每次10分钟)，使之与偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗反应1小时，用TBST溶液洗涤3次(每次10分钟)，并用ECL(Amersham Biosciences，英国)使之可视化，从而检测mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的量的变化。
结果如图10所示，发现MFK23在用MMP-2处理时受到浓度依赖性切割，而且在用其他类型的MMP(例如MMP-1或MMP-3)处理时未受到切割。此外还发现，MFK23在用组织蛋白酶K、L或D(半胱氨酸蛋白酶)处理时未受到切割。
此外，如图11所示，发现MFK24在用MMP-1处理时受到浓度依赖性切割，而在用其他类型的MMP(例如MMP-2或MMP-3)或者组织蛋白酶K、L或D处理时未受到切割。
此外，如图12所示，发现MFK25在用MMP-1、MMP-2和MMP-3处理时受到浓度依赖性切割，特别是被MMP-1和MMP-3受到更好地切割。但发现MFK25在用组织蛋白酶K、L或D(半胱氨酸蛋白酶)处理时未受到切割。
<2-2>对mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的酶解消化进行的培养物分析
为了确定MFK24是否良好地粘附于细胞并实际上被MMP-1切割，用IL-1β处理了人FLS(成纤维细胞样滑膜细胞)以扩大MMP-1的表达。随后，将MFK24添加到培养基中并进行培养。
在DMEM+10%FBS(胎牛血清)+2%青霉素、链霉素的培养基中，培养人滑膜细胞系2天，并向其添加0.1ng/ml的IL-1β并刺激24小时。用mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽(1uM)处理该细胞系，并刺激3小时和6小时。随后，使用识别mdhfas-1的抗β ig-h3抗体和识别C端组氨酸标签的抗组氨酸抗体，确定了肽的量。
结果如图13所示，发现使用抗组氨酸抗体测得的MFK24的量小于使用抗β ig-h3抗体测得的MFK24的量。因此，发现MFK24被滑膜细胞所分泌的MMP-1切割。
<实施例3>
测试mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽对细胞系的功能调节
<3-1>细胞粘附试验
将β ig-h3以5ug/ml的浓度加入96孔平板中，并在4℃下包被14小时。在DMEM+0.5%BSA(牛血清清蛋白)培养基中，加入小鼠成纤维细胞(NIH3T3)，并向其中注射各种浓度的MFK24、MFK25或MFK27，随后进行混合。将所得的混合物在37℃下培养30分钟，并将其平板接种在经包被的孔上。将其培养2小时，而后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤以除去未吸附的细胞，随后添加将被细胞内的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活化的底物(4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，Simga，U.S.)，随后在37℃下培养1小时。随后，向其中添加甘氨酸EDTA溶液(0.5M EDTA，50mM甘氨酸，pH10.4)，通过吸光度来测量视吸附的细胞的数量而定的着色程度。
结果如图14所示，发现用浓度为5uM以上的MFK23进行的处理抑制了粘附。
此外，如图14、15、16和32所示，发现MFK23、MFK24、MFK25和MFK27甚至在低浓度时也能够抑制细胞粘附。特别而言，发现用MFK24进行处理时在极低的浓度下也能够抑制细胞粘附，这与单独使用或组合使用YH18基序和mdhFas-1进行处理时不同。
单独使用或组合使用mdhFas-1和RGDSP(包含氨基酸序列RGDSP的肽)进行了相同的细胞粘附试验，并将试验结果与MFK24的结果进行比较。
结果如图15C所示，浓度为0.5uM的MFK24显示出了80%以上的高粘附抑制效果，而相同浓度的mdhFas-1和RGDSP则分别显示出50%和0%的粘附抑制效果。此外，同时使用mdhFas-1和RGDSP进行处理时，显示出了约50%的粘附抑制效果。因此发现，与mdhFas-1和RGDSP相比，MFK24能够更有效地抑制细胞粘附。
因此确定，与mdhFas-1、RGDSP和YH18基序相比，mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽对类风湿性关节炎显示出了非常高的效果。
<3-2>细胞迁移试验
在具有8um的孔径以使细胞能够迁移的transwell滤器的下部隔室中，于4℃培养βig-h312～14小时，并进行包被。在DMEM+0.5%BSA培养基中，加入NIH3T3，并加入各种浓度的MFK24或MFK25，随后进行混合。将所得的混合物在37℃下培养30分钟，接种到经包被的孔的上部腔室中，而后在37℃下培养7小时。随后，用低聚甲醛固定已迁移到了滤器的下部隔室的细胞，而后用结晶紫染色。并不将细胞转移到无菌药棉上，而是将残留在上部腔室中的细胞擦除，并用显微镜对迁移到了下部隔室的细胞进行计数。
如图14、15和16所示，发现MFK23、MFK24和MFK25抑制了细胞迁移。
<实施例4>
测试hsdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽对细胞系的功能调节
<4-1>细胞粘附试验
将β ig-h3以5ug/ml的浓度加入96孔平板中，并在4℃下包被14小时。在DMEM+0.5%BSA(牛血清清蛋白)培养基中，加入人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)，并向其中注射各种浓度的HsFJ24、HsFJ25或HsFJ27，随后进行混合。将所得的混合物在37℃下培养30分钟，并将其平板接种在经包被的孔上。将其培养2小时，而后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤以除去未吸附的细胞，随后添加将被细胞内的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活化的底物(4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，Simga，U.S.)，随后在37℃下培养1小时。随后，向其中添加甘氨酸EDTA溶液(0.5M EDTA，50mM甘氨酸，pH10.4)，通过吸光度来测量视吸附的细胞的数量而定的着色程度。
结果如图33～图35所示，发现用浓度为5uM以上的HsFJ24、HsFJ25或HsFJ27进行的处理抑制了粘附。
<实施例5>
调查mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的关节炎治疗效果
<5-1>胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型的产生
与人类风湿性关节炎具有相似特性的CIA小鼠模型根据已知文献(Protocol forthe successful induction of collagen-induced arthritis(CIA)and collagenantibody-induced arthritis(CAIA)in mice.Chondrex,Redmond,WA)的描述来制备：将100ug牛2型胶原与弗氏完全佐剂混合，并皮下接种到小鼠尾中。3周后，将100ug牛2型胶原与弗氏完全佐剂混合，再次接种到所述小鼠的尾中。随后，将该小鼠用于实验。
<5-2>测试在CIA小鼠中mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的关节炎治疗效果
通过使用CIA小鼠，测试了MFK23和MFK24的关节炎治疗效果。
为了查明对CIA模型中的关节炎的治疗效果，从第二次注射牛2型胶原后关节炎发作(第23天)起四周内，每日按0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量将MFK23或MFK24注射到腹腔中。作为对照组，将等量的PBS注射到腹腔中。从第23天到第50天，每日使用临床关节炎指数确定了关节炎的严重程度。该确定基于以下数据。
0：无症状；1：在一个关节中出现水肿，或轻微水肿；2：在2个以上关节中出现严重水肿；3：在多数关节中出现严重水肿；4：整个腿部都严重水肿。
结果如图17所示，发现MFK23对关节炎显示出优异的效果。
此外，如图19所示，发现MFK24将关节炎抑制了约70%，即使在施用剂量为0.1mg/kg时也是如此。此外还发现，MFK24即使在浓度低(常规的mdhFas-1或MFK12的1/100)时也显示出比常规的mdhFas-1或MFK12更高的关节炎抑制效果(见<比较例3>和<比较例4>)。
<5-3>对CIA小鼠中的mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的毒性测试
为了确定mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽是否显示毒性，在CIA模型中，在施用之前(第22天)和施用之后(第48天)对小鼠进行了称重。在第48天，进行了血清测试和血液测试。
结果如表7所示，发现与对照组相比，MFK24在红细胞、白细胞和血小板的量方面以及肝功能值(AST和ALT)方面均未显示出异常。此外还发现，对照组和MFK24处理组的胆红素和肌酸均无显著差异。
另外，MFK24处理组的体重保持与对照组的相近(见图19B)。
在治疗期间无小鼠死亡。此外，从血清测试和血液测试结果以及体重比较结果中发现，MKF24处理显示出了低毒性和低危险性。
[表7]
用MFK24肽处理CIA模型4周后的血液测试结果
<实施例6>
调查mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的关节炎抑制机理
为了确定CIA模型中的关节炎治疗效果的作用机理，在第二次注射牛2型胶原后第50天(从第二次注射牛2型胶原后关节炎发作(第23天)起四周后)，分离出处理组的足部组织并对其进行组织学分析。随后，在该组织中，调查了炎症介质表达的变化。
<6-1>对施用了mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的小鼠的足部组织的组织学分析
对施用了MFK23和MFK24的组进行HE染色。
通过以下工序制备组织样品。除去足部组织上的皮肤。随后，在10%福尔马林溶液中固定该组织2天，而后在10%EDTA溶液中去除矿物质。使已除去矿物质的组织经历脱水工序和清洁工序，用石蜡将其包埋，并用切片机将其制成厚度为3um的切片。用100%二甲苯和乙醇对该组织切片进行脱石蜡和再脱水，随后用溶于100%甲醇的0.3%过氧化氢的溶液将组织内的非特异性过氧化物酶封闭。
为了进行免疫组化试验，用5%BSA阻断了非特异性蛋白的结合。随后，将该组织与各种一抗(作为内皮细胞标志物的针对CD31的抗体和针对ICAM-1(胞间粘附分子-1)的抗体)在4℃下一起培养12～14小时，而后用洗涤缓冲液(0.1%BSA、0.2%明胶、0.05%皂苷)进行洗涤。将其与带有生物素标记的二抗在室温下培养30分钟，洗涤，用Vectastatin ABC试剂盒(Vector Laboratories,U.S.)进行反应，并用Eukitt封片介质(Fluka，德国)进行封片以进行观察。
如图18和20所示，在用MFK23处理的组和用MFK24处理的组中，发明人发现它们抑制了滑膜细胞的增殖并减少了软骨和骨的变形。
<6-2>对施用了mdhFas-1-MMP底物-RGD结构肽的小鼠的足部组织中的炎症介质变化的调查
所观察到的足部组织中的炎症分布可以随区域而略有不同，难以对其进行定量调查。因此，在用MFK24处理的小鼠CIA模型的后腿中，如下文所述，使用Taqman探针通过半定量逆转录PCR方法来测量与关节炎的发作对应的炎症介质变化。
从小鼠CIA模型中分离出足部组织，除去其皮肤。使用组织匀浆器将剩余的组织磨碎，并使用抽提试剂(Easy-spimTM,Intron)来抽提总RNA。对这些RNA进行定量，并且取7μgRNA，使用AMV逆转录酶(Roche，0.5ul)、寡聚dT(Roche，1ul)、10mM dNTP(Takara，2ul)和RNA酶抑制剂(Roche，0.1ul)进行逆转录酶反应。对于小鼠的TNF-α、RANKL、IL-1β、CCL-2、MMP-1、MMP-3、IL-6、VCAM-1和18S RNA，使用引物(Bioneer,Daejeon)和Taqman探针(Roche，德国)在LC480(Roche，德国)中进行半定量PCR，以确定转录本的数量。通过与18S RNA转录本进行比较，对转录本进行了定量分析。用于半定量PCR的引物对列于表8中。
[表8]
PCR用引物对
如图21所示，发现与关节炎对照组相比，在施用了MFK24的组中，炎症介质的转录本数量显著减少，此外，根据剂量，ICAM-1和RANKL在炎症区的表达也减少。特别而言，发现当以0.1mg/kg的低剂量施用MFK24时，高功效得以保持(见图22)。
<比较例3>
调查mdhFas-1肽的关节炎治疗效果
通过使用由<比较例1>制备的mdhFas-1肽，在CIA小鼠模型中，以与实施例4中相同的方式测量关节炎治疗效果。
结果，在使用mdhFas-1肽时，如图23所示，与对照组小鼠相比，关节炎受到了浓度依赖性抑制，并且未观察到体重变化上的异常结果。发现以10mg/kg的剂量进行的处理将关节炎抑制了约32%，以30mg/kg的剂量进行的处理将关节炎抑制了约69%。
<比较例4>
调查MFK12肽的关节炎治疗效果
通过使用由<比较例2>制备的MFK12肽，在CIA小鼠模型中，以与实施例4和5中相同的方式测量关节炎治疗效果。
结果，在使用MFK12肽时，如图24所示，与对照组小鼠相比，关节炎受到了浓度依赖性抑制，并且未观察到体重变化上的异常结果。发现以10mg/kg的剂量进行的处理将关节炎抑制了约27%，以30mg/kg的剂量进行的处理将关节炎抑制了约60%。
此外，如图25所示，发现在从第二次免疫化起4周后的第50天，在以10mg/kg的剂量处理的组中，关节区域遭到破坏，滑膜组织细胞过度增殖，血管化诱导和细胞粘附蛋白的表达增加到与对照组中的一样多。同时，在以30mg/kg的剂量处理的组中，与对照组相比，滑膜组织细胞的增殖受到了抑制，血管化诱导和细胞粘附蛋白的表达减少，并且足部组织的形状看上去几乎正常。因此，发现用剂量为30mg/kg的MFK12进行的处理显示出治疗效果。
如图26和图27所示，通过测量炎性介质的变化，发现以10mg/kg的剂量处理的组显示出与关节炎对照组相似的TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1和RANKL表达水平，而以30mg/kg的剂量处理的组则显示出与关节炎对照组相比下降了的水平。此外还发现，以10mg/kg的剂量处理的组显示出与关节炎对照组相似的ICAM-1和RANKL表达水平，而以30mg/kg的剂量处理的组则显示出与关节炎对照组相比下降的水平。
[工业实用性]
从以上内容可以看出，本发明的融合肽抑制因滑膜细胞的粘附和迁移而导致的类风湿性关节炎扩大，并且可以用来通过抑制免疫细胞的浸润而预防或治疗炎性疾病。

Claims (13)

1.一种融合肽，所述融合肽包含：a)dhFas-1结构域，所述dhFas-1结构域为βig-h3的缺乏H1和H2区的第四fas-1结构域；b)MMP(基质金属蛋白酶)底物；和c)包含RGD基序的肽，
其中，所述a)dhFas-1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3表示，其中，所述b)MMP底物由氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8表示，和
其中，所述c)包含RGD基序的肽由氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10表示，并且
其中所述a)、所述b)和所述c)依次相连。
2.如权利要求1所述的融合肽，其中，所述融合肽还包含位于所述a)dhFas-1结构域和所述b)MMP底物之间的连接肽，其中，所述连接肽由1～5个氨基酸组成。
3.如权利要求1所述的融合肽，其中，所述融合肽还包含位于所述b)MMP底物和所述c)包含RGD基序的肽之间的连接肽，其中，所述连接肽由1～5个氨基酸组成。
4.如权利要求1所述的融合肽，其中，所述融合肽由由SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:17中任一个表示的氨基酸序列组成。
5.如权利要求3所述的融合肽，其中，所述连接肽是LE或EF。
6.如权利要求2所述的融合肽，其中，所述连接肽是VD或VDG。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1～6所述的融合肽。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸由由SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:24中任一个表示的核酸序列组成。
9.一种载体，所述载体包含启动子和可操作地连接的权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种用权利要求9所述的载体转化的宿主细胞。
11.一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～6中任一项所述的融合肽作为活性成分，其中，所述炎性疾病选自由下述疾病组成的组：类风湿性关节炎、脊柱关节病、强直性脊柱炎、莱特尔氏综合征、银屑病性关节病、与炎性肠病相关的脊柱炎、少年关节病、反应性关节病以及与“血管炎综合征”相关的关节炎。
12.如权利要求1所述的融合肽，所述融合肽用作治疗剂。
13.权利要求1所述的融合肽在制备用于治疗炎性疾病的试剂中的应用，所述炎性疾病选自由下述疾病组成的组：类风湿性关节炎、脊柱关节病、强直性脊柱炎、莱特尔氏综合征、银屑病性关节病、与炎性肠病相关的脊柱炎、少年关节病、反应性关节病以及与“血管炎综合征”相关的关节炎。
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