KR20090050667A - βｉｇ-ｈ3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 βig-h3 단편의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 류마티스 관절염 부위의 염증을 억제하여 류마티스 관절염의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있으며, 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에도 사용될 수 있다.

βig-h3, 단편, 류마티스, 예방, 치료

Description

βｉｇ-ｈ3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating rheumatoid arthritis comprising βig-h3 fragment as an active ingredient}

본 발명은 βig-h3 단편의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

류마티스 관절염은 인체내 관절의 활막(Synovial membrane)에 발생하는 만성 염증, 즉 6주이상 염증이 지속되는 것을 말한다. 일단 류마티스 관절염이 시작되면, 활막 조직의 혈액으로부터 여러 가지 염증세포들로 이루어진 '판누스(Pannus)'라는 덩어리를 형성하고 이것이 연골을 파괴하고 관절의 변형을 가져오며 관절주위에 있는 뼈도 약하게 만든다. 이러한 관절 염증의 결과 관절이 붓고 아프게 되며 관절의 운동 범위가 제한을 받게 되고 관절 주위가 벌겋게 변하며 만져 보면 따뜻한 느낌도 들 수 있게 된다.

이 질환은 인체 면역 기능에 이상이 오는 것으로, 쉽게 설명하면 정상적으로는 우리 몸 속에서 세균 같은 외부의 이물질에 대하여 몸을 방어하는 역할을 해야 하는 면역계가 알 수 없는 이유로 우리 자신의 몸을 스스로 공격하기 때문에 발생하는 병이다. 이런 상태를 '자가 면역'이라고 부르며, 이런 원리로 관절부위에 만성 염증 소견이 나타나고, 때로는 근육, 폐, 피부, 혈관, 신경계, 눈 등에도 이상이 오게 된다. 남녀노소를 막론하고 류마티스 관절염에 걸릴 수 있지만 주로 30대와 40대에서 잘 생기며 여자의 경우가 남자보다 많이 발생한다. 이 외 류마티스 관절염의 특징은 발열, 피부의 발진과 결절, 체중감소, 피곤감, 폐, 심장, 눈의 염증성 변화 등 관절 이외의 신체 장기에도 병이 생길 수 있다.

현재까지 류마티스 관절염의 발병원인에 대해 많은 연구가 이루어 졌음에도 불구하고, 류마티스 관절염의 확실한 원인은 아직도 밝혀내지 못하고 있다. 하지만 류마티스 관절염에 대한 임상적 치료방법들은 여러 가지가 개발되어 있으며, 이는 일반 보존적 요법, 약물요법, 수술적 요법 등으로 나뉘어 진다. 일반적으로 류마티스 관절염의 치료는 이 질병이 만성 관절염에 의한 관절통증과 관절의 변형, 기능의 소실을 유발하므로 통증과 염증을 억제하고 관절의 기능소실을 최소화하여 정상 생활로 복귀하는데 치료의 목표를 두고 있다. 현재 흔히 사용되는 치료 방법은 약물 요법인데, 이는 그 증상에 따라서, 아스피린 & 비스테로이드성 소염제, 저용량 경구 스테로이드제, 항 말라리아 제재(antimalarial drug), 설파살라진(sulfasalazine), 금제재(Gold compounds), 페니실라민(penicillamine), 면역 억 제제 (메소트렉세이트(MTX), 이뮤란(Immuran) 등) 등의 항류마티스 약제(DMARDs), 관절내 스테로이드제 주사 및 생물학적 제제인 종양괴사인자 차단제(etanercept, infliximab, adalimumab), 인터루킨-1 수용체 길항제(anakinra), 항-CD20항체(rituximab) 등이 사용된다. 하지만, 이러한 약물요법은 위장장애, 간장애, 신장기능장애, 감염 등의 부작용이 발생할 수 있는 단점이 있으며, 따라서, 류마티스 관절염의 예방 및 치료를 위한 새로운 물질의 개발은 항상 요구되고 있다.

한편, 세포의 기질단백은 조직의 골격을 구성하는데 있어 중요한 역할을 담당하는 구성성분으로써 많은 연구를 통해 조직의 형태뿐만 아니라 기능을 유지, 조절하는데 있어서도 핵심적인 역할을 하는 것으로 규명되어 왔다. Transforming growth factor-β (TGF-β)에 의해 유도되는 기질인 TGF-β-inducible gene-h3(βig-h3)는 분자구조가 최근에 규명된 단백으로써 세포의 부착, 이주, 분화 및 증식 등의 기능조절에 중요한 역할을 담당한다.

βig-h3가 사람의 류마티스 관절염 조직에 많이 발현되어 있고 류마티스 관절염 환자에서 분리한 활막세포의 부착과 이주를 조절하는 데 있어 중요한 역할을 담당하는 것은 본 발명자에 의해 처음으로 규명되었다(Nam EJ et al., Up-Regulated Transforming Growth Factor βInducible Gene h3 in Rheumatoid Arthritis Mediates Adhesion and Migration of Synoviocytes Through αvβ3 Integrin. Arthritis Rheum Vol. 54, No. 9, September 2006, pp 27342744). 하지 만 βig-h3의 구성성분인 fas-1 도메인이나 그 일부 단편들이 활막세포의 기능조절에 관여하는지는 아직 규명되어 있지 않았으며 나아가 관절염의 진행과 유지에 있어 βig-h3이 억제 혹은 상승효과가 있는지도 밝혀져 있지 않는 상태이다.

이에 본 발명자들은 βig-h3의 기능에 대해서 연구하던 중 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 단편이 류마티스 관절염 조직에서 분리한 활막세포의 부착과 이주를 차단할 뿐 아니라 류마티스 관절염의 동물모델인 생쥐 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis; CIA) 모델에서 뛰어난 류마티스 관절염 치료 효과가 있음을 알아내어 상기 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 조성물은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 βig-h3 단편은 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드이다. 본 발명의 βig-h3 단편은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명에서의 βig-h3은 공지된 βig-h3라면 이에 해당될 수 있으나, 바람직하게는 인간의 βig-h3인 Genbank Accession No. NP_000349, Q15582, AAH04972, AAH00097, AAH26352, AAC08449, AAA6116에 기재된 βig-h3일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 βig-h3는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

인간 βig-h3 단백질은 683개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 리간드 인식 부위인 RGD 모티브(Arg-Gly-Asp)와 4개의 내부 반복 도메인(internal repeated domain)인 fas-1 도메인을 포함하고 있다(도 1 참조) 상기 fas-1 도메인은 110개 내지 140개의 아미노산으로 구성되어 있다. 보다 구체적으로 상기 βig-h3 단백질의 4개의 fas-1 도메인은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 중 133번부터 236번까지의 아미노산을 포함하는 첫 번째 fas-1 영역인 D-Ⅰ, 242번부터 372번까지의 아미노산을 포함하는 두 번째 fas-1 영역인 D-Ⅱ, 373번부터 501번까지의 아미노산을 포함하는 세 번째 fas-1 영역인 D-Ⅲ 및 502번부터 632번까지의 아미노산을 포함하는 네 번째 fas-1 영역인 D-Ⅳ로 이루어져 있다.

상기 fas-1 도메인 중 4번째 도메인(D-Ⅳ)에는 α3β1 인테그린과 상호 작용하는 모티프인 EPDIM이 존재하며(Kim JE et al., J. Biol . Chem., 275, 30907-30915, 2000), 티로신-히스티딘 아미노산 서열을 포함하며 섬유아세포의 부착을 매개하는 모티프인 YH가 존재한다(Kim, JE et al., J. Biol . Chem., 277, 46159-46165, 2002). 아울러, 상기 네 번째 fas-1 도메인에는 상동성이 매우 높은 약 10개의 아미노산으로 이루어진 H1 및 H2가 그 내부에 존재한다.

한편, 상기 폴리펩티드 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산 의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 βig-h3 단편과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 염증 억제를 통한 염증성 질환의 예방 및 치료, 특히 류마티스 관절염의 예방 및 치료를 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 βig-h3 단편의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 βig-h3 단편의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른　단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 βig-h3의 4번째 fas-1 도메인 단편 및 fas-1 도메인 중 4번째 도메인(D-Ⅳ)에서 H1, H2 부위를 제거한 단편(ΔhFas-1)을 준비하 여, 이의 활막세포의 부착 및 이주에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, fas-1 도메인 단편은 활막세포의 부착 및 이주를 억제하지 못하였으나, ΔhFas-1 단편은 활막세포의 부착 및 이주를 농도 의존적으로 차단함을 알 수 있었다. 따라서, ΔhFas-1 단편이 류마티스 관절염의 치료에 효과를 보일 수 있음을 알 수 있었다.

이에 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 ΔhFas-1 단편의 류마티스 관절염 치료 효과 및 그 기전을 살펴보았다. 그 결과, ΔhFas-1를 투여한 경우 관절염의 증상이 억제 또는 완화되고, 그 투여량을 30mg/kg로 늘린 경우 관절염의 중증도가 증가되지 않았으며 그 효과는 치료종료일 이후까지 유지됨을 알 수 있었다. 아울러, 류마티스 관절염 부위의 T세포와 B세포의 침윤이 대조군에 비해 뚜렷히 감소하였으며, 가벼운 정도의 염증소견만 관찰되었으며 관절파괴 소견은 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다. 또한, 각 염증매개물질의 전사체 수는 ΔhFas-1 치료군에서 치료용량의존적으로 감소하였으며 특히 30mg/kg의 ΔhFas-1 치료군에서는 뚜렷한 감소를 보임을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 βig-h3 단편, 즉, fas-1 도메인 중 4번째 도메인(D-Ⅳ)에서 H1, H2 부위를 제거한 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 βig-h3 단편은 상기한 바와 같이 fas-1 도메인 중 4번째 도 메인(D-Ⅳ)에서 H1, H2 부위를 제거한 단편이며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 이의 기능적 동등물도 포함한다. 본 발명의 βig-h3 단편을 이용하는 경우 단편의 크기가 비교적 작기 때문에 단백질간 서로 뭉쳐 덩어리 형성이 잘 되지 않아 제형화 하는 과정에서 조절이 훨씬 쉽고 약물전달의 측면에서도 유리하다. 아울러, 약물의 안정성 측면에서는 바이오폴리머(biopolymer) 등에 봉입하는 것이 더 용이하기 때문에 목표지점까지 전달과정에서 좀 더 안정적인 농도 유지가 가능하고 보관상에 있어서도 안정성이 더 높기 때문에 전체길이의 βig-h3 보다 유리한 점이 있다.

본 발명에 따른 화합물이 적용될 수 있는 질환은 류마티스 관절염이다. 하지만, 본 발명의 βig-h3 단편이 염증을 억제하는 효과를 보이므로 다양한 염증성 질환에도 적용할 수 있을 것이며, 염증성 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종 증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 βig-h3 단편을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등 을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 βig-h3 단편의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 βig-h3 단편의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 βig-h3 단편의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 βig-h3 단편을 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

아울러, 본 발명의 βig-h3 단편은 투여시 류마티스 관절염의 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 보였으므로, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 벡터를 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 βig-h3 단편, 즉 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드를 암호화하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 βig-h3 단편의 발현을 위하여 상기 폴리뉴클레오티드에는 프로모터가 작동가능하게 연결된다. 상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol . Biol . 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

따라서, 본 발명은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 류마티스 관절염 부위의 염증을 억제하여 류마티스 관절염의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있 으며, 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에도 사용될 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

β ig - h3 단백질 및 그의 단편의 분리

<1-1> 인간 β ig - h3 단백질 분리

인간 βig-h3 유전자(NM_000358, 서열번호 3)를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 βig-h3 단백질을 발현시켰다.

이를 4℃, 8000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포만 -80℃에서 하루동안 보관하였다. 100ml 배양액당 4ml 재용해 버퍼(resuspension buffer; 20mM KH₂PO₄, 500mM NaCl, 2mM β-mercaptoetanol)를 세포 펠렛에 넣고 풀어 준 후, 초음파로 세포를 분쇄시켰다. 분쇄된 세포를 4℃, 13000rpm에서 15분 동 안 원심 분리하여 상층액을 50ml 튜브로 옮겼다. Ni-NTA 아가로스 비드(Ni-NTA Agarose bead, QIAGEN)를 잘 섞어 1ml을 tube에 옮긴 후, 재용해 버퍼로 두 번 세척하였다. 세척된 50% 현탁액 상태의 Ni-NTA 아가로스 비드에 상층액을 넣고 4℃에서 교반기(agitator)로 1시간 동안 결합시킨 후 4℃, 1500rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 상층액은 따로 보관하였다. Ni-NTA 아가로스 비드를 10배 부피의 비드 세척 버퍼(bead washing buffer; 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole)를 넣고 잘 섞으면서 씻어주어 4℃, 1500rpm에서 3분동안 원심분리하여 비특이적으로 결합한 단백질을 제거시켰다. 이 과정을 10번 반복하였다. 용출 버퍼(elution buffer; 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 300mM imidazole)로 His-tag βig-h3 단백질을 추출하였다.

생산된 재조합 단백질에서 LPS(Lipopolysaccharide)는 생쥐당 1 EU이하로 유지하기 위해 용해 버퍼(resuspension buffer; 20mM KH₂PO₄, 500mM NaCl, 2mM β-mercaptoetanol)와 세척 버퍼(bead washing buffer; 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole)에 Triton X-114를 이용하여 LPS를 제거하였으며 분리된 단백에서 LPS 제거용 칼럼(Cambrex, Germany)을 이용하여 한 번 더 제거하였다.

<1-2> 생쥐 β ig - h3 단백질의 분리

생쥐 βig-h3 유전자(NM_009369, 서열번호 5, 아미노산서열은 서열번호 6 참 조)를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 βig-h3 단백질을 발현시켰다. 이를 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 Ni-NTA 레진 컬럼에 부착시켜 분리하였다. LPS의 제거도 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 수행하였다.

<1-3> β ig - h3 의 fas -1 도메인을 포함하는 단편의 제작 및 분리

인간 βig-h3의 fas-1 도메인 가운데 네 번째 fas-1 도메인(이하 인간 fas-1 도메인 단편이라고 함)을 암호화하는 유전자를 인간 βig-h3(NM_000358)를 주형으로 하고, 서열번호 7(forward 5’-atggagatatcgctgaccccccca-3’)의 프라이머 및 서열번호 8(reverse 5’-tcctgctcgaggttggctggaggc-3’)의 프라이머를 이용해서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 염기서열을 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 인간 fas-1 도메인 단편을 발현시켰다. 이를 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 Ni-NTA 레진 컬럼에 부착시켜 분리하였다. LPS의 제거도 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 수행하였다.

<1-4> 생쥐 β ig - h3 의 fas -1 도메인을 포함하는 단편의 제작 및 분리

생쥐 βig-h3의 fas-1 도메인 가운데 두 번째 및 네 번째 fas-1 도메인(이하 생쥐 fas-1 도메인 단편이라고 함)에 대해서도 생쥐 βig-h3(NM_009369)를 주형으로 하고, 서열번호 9(forward 5’-tatgatatcccaagccatgcc-3’)의 프라이머 및 서열번호 10(reverse 5’-tcaatctcgagcatgatgtc-3’)의 프라이머를 이용하여 PCR로 증 폭한 것을 제외하고, 상기에서와 같이 하여 분리하였다.

<1-5> 인간 Δ hFas -1 펩타이드 단편의 제작 및 분리

βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : ΔhFas-1)를 암호화하는 유전자를 인간 βig-h3(NM_000358)를 주형으로 하고, 서열번호 11(forward 5’-tatcatatgcaagccatgcc-3’)의 프라이머 및 서열번호 12(reverse 5’- tcaccgaattccatgatgtc-3’)의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭한 산물을 pET29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 EcoR I 를 이용하여 클로닝하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 배양하여 인간 ΔhFas-1도메인 단편을 발현시켰다. 이를 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 Ni-NTA 레진 컬럼에 부착시켜 분리하였다. LPS의 제거도 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 수행하였다.

<1-6> 생쥐 Δ hFas -1 펩타이드 단편의 제작 및 분리

생쥐 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : ΔhFas-1)를 암호화는 유전자를 생쥐 βig-h3(NM_009369)를 주형으로 하고, 서열번호 13(forward 5’-tatcatatgcaagccatgcc-3’)의 프라이머 및 서열번호 14(reverse 5’-tcaccgaattccatgatgtc-3’)의 프라이머를 이용해서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 EcoR I 를 이용하여 클로닝하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 배양 하여 생쥐 ΔhFas-1도메인 단편을 발현시켰다. 이를 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 Ni-NTA 레진 컬럼에 부착시켜 분리하였다. LPS의 제거도 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 수행하였다.

< 실시예 2>

세포 부착 및 이주에 미치는 영향 확인

<2-1> 인간 활막세포주의 분리 및 배양

류마티스관절염 환자의 관절치환 수술시 수득한 활막조직을 배양배지(DMEM+10% FBS+(fetal bovine serum+)2% penicillin, streptomycin)에 넣고 1mg/ml의 콜라게나아제 I(collagenase I, Sigma)로 37℃에서 3시간 동안 처리하였다. 그 후 멸균된 거즈로 남은 조직을 걸러준 뒤 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 활막세포는 3차에서 8차까지 계대배양한 세포주를 실험에 사용하였다.

<2-2> 인간 활막세포주의 부착에 미치는 영향 확인

96 웰 플레이트에 인간 βig-h3를 코팅한 후(5μg/ml, 4℃에서 14시간 코팅), DMEM+0.5% BSA(Bovine Serum Albumin) 배지에 인간 활막세포주를 인간 fas-1 도메인 단편 또는 인간 ΔhFas-1와 함께 튜브에서 각각 농도별(1μM, 5μM, 10μM 및 20μM, 대조군의 경우 0μM)로 섞어 37℃ 에 30분 배양한 후 코팅된 웰에 분주하였 다.

이를 2시간 동안 배양한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 세포내 β-N-아세틸글루코사미니다아제(β-N-acetylglucosaminidase)에 의해 활성화되는 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, Sigma, Germany)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 글리신 EDTA(glycine-EDTA) 용액(0.5M EDTA, 50mM glycine, pH 10.4)을 첨가하고, 부착된 세포수에 따라 발색되는 정도를 흡광도로 측정하였다.

그 결과, 도 2A 및 도 2B에서 보듯이, 인간 fas-1 도메인 단편은 활막세포의 부착을 억제하지 못함을 알 수 있었으며, 인간 βig-h3 코팅된 배양 플레이트에 서로 다른 농도의 인간 ΔhFas-1과 먼저 배양된 활막세포의 부착능력을 조사한 결과 인간 ΔhFas-1은 활막세포의 부착을 농도 의존적으로 차단함을 알 수 있었다.

<2-3> 세포이주에 미치는 영향 확인

활막세포주의 βig-h3 매개 이주에 대한 효과를 조사하기 위해 다음과 같이 수행하였다.

세포가 이동할 수 있는 크기인 8μm 의 구멍을 가진 트랜스웰(transwell)의 필터 하면에 인간 βig-h3를 4℃에 12 내지 14시간 배양하여 코팅하였다. DMEM+0.5% BSA 배지에 인간활막세포주를 인간 fas-1 도메인 단편과 함께 튜브에 각각 농도별(1μM, 10μM 및 20μM, 대조군의 경우 0μM)로 섞어 37℃ 에 30분 배양하였다.

인간 βig-h3를 코팅한 후 필터의 상위 챔버(upper chamber)에 먼저 배양한세포를 접종한 후 7시간동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 필터 하면으로 이동한 세포를 고정한 후 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 이동한 세포를 염색하였다. 멸균된 면봉으로 이동하지 않고 상위 챔버에 남은 세포를 닦아내고 하면으로 이동한 세포수를 현미경으로 계수하였다.

그 결과, 도 2C에서 보듯이, 인간 fas-1 도메인 단편은 활막세포의 이주에 별다른 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

<2-4> 생쥐 섬유아세포에 대한 생쥐 fas -1 도메인 단편 및 생쥐 Δ hFas -1 작용 확인

인간 활막세포주 대신 생쥐 섬유아세포(fibroblast) 세포주(NIH3T3, 한국세포주은행, KCLB21658)를 사용한 것, 인간 fas-1 도메인 단편 대신 생쥐 fas-1 도메인 단편을 사용한 것 및 인간 ΔhFas-1 대신 생쥐 ΔhFas-1을 사용한 것을 제외하고 각각 상기 실시예 <2-2> 및 <2-3>과 같이 하여 생쥐 섬유아세포 세포주의 β ig-h3 매개 부착 및 이주에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 생쥐 fas-1 도메인 단편은 섬유아세포 세포주의 부착(도 3A) 및 이주(도 3B)는 억제하지 못하였고, 이러한 결과는 인간 fas-1 도메인 단편을 이용한 결과와 일치하였다. 반면에, 생쥐 ΔhFas-1은 βig-h3 매개 세포 부착(도 3C) 및 이주(도 3D)를 농도 의존적으로 억제하였다.

< 실시예 3>

Δ hFas -1 단편의 관절염 치료 효과 확인

<3-1> 콜라겐 유도 관절염( Collagen - induced arthritis , CIA ) 생쥐모델의 제작

사람의 류마티스 관절염과 매우 유사한 특징을 갖고 있는 CIA 생쥐모델은 공지된 문헌(Protocol for the successful induction of collagen-induced arthritis (CIA) and collagen antibody-induced arthritis (CAIA) in mice. Chondrex, Redmond, WA)에 기재된 바에 따라 다음과 같이 제작되었다: 우형(bovine) 제2형 콜라겐(100μg)을 완전 프로인드 보조제(Freund's complete adjvant)와 섞어 생쥐의 꼬리에 피하 접종한 후 3주후에 우형 제2형 콜라겐 (100μg)을 불완전 프로인드 보조제(Freund's incomplete adjvant)와 섞어 생쥐의 꼬리에 재접종하여 제작하고 실 험에 사용하였다.

<3-2> 생쥐 Δ hFas -1의 관절염 치료효과 확인

CIA 모델에서 관절염의 치료효과를 규명하기 위해 우형 제2형 콜라겐을 두 번째 주사한 후 관절염이 발생하는 시점(23일째)부터 4주일간 매일 생쥐 ΔhFas-1을 각각 10mg/kg체중 또는 30mg/kg체중의 양으로 생쥐의 복강내에 주사하였다. 치료용으로 생산한 생쥐 ΔhFas-1은 생쥐 개체당 1 EU 이하의 LPS가 되도록 유지한 것을 사용하였다. 대조군에는 동일량의 PBS를 복강 투여하였다. 치료효과를 판정하기 위해 관절염의 중증도를 임상적 관절염 지수(Clinical arthritis index)를 사용하여 판정하였으며 판정기준은 다음과 같다. (0; 증상 없음, 1; 한 개 관절의 부종 및 가벼운 edema, 2; 2개 이상의 관절의 중증도 부종, 3; 대부분관절의 심한 부종, 4; 다리 전체의 심한 부종)

그 결과, 도 4에서 보듯이, ΔhFas-1 10mg/kg 투여군에서는 대조군과 달리 생쥐 CIA 의 관절염 중증도 점수가 억제되었으나, 36일 이후부터는 지속적인 투여에도 불구하고 관절염의 중증도가 증가되어 52일째에는 대조군의 약 70% 정도의 중증도를 나타내었다. 이에 비해 ΔhFas-1 30mg/kg 투여군에서는 투여후 관절염의 중증도가 증가되지 않았으며 그 효과는 치료종료일까지 유지되었다. 뿐만 아니라 ΔhFas-1 30mg/kg 투여군의 경우 투여중지 후에도 상당 기간동안 관절염의 치료효과가 유지되었다(결과미도시).

<3-3> 생쥐 CIA 모델에서 Δ hFas -1의 독성검증

생쥐 ΔhFas-1가 생쥐에 대해서 독성을 보이는지 알아보기 위하여 상기 CIA 모델에서의 투여 전(22일째)과 투여 후(52 일째)에 각 5마리씩 체중을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 대조군에서와 같이, ΔhFas-1 10mg/kg 투여군 및 ΔhFas-1 30mg/kg 투여군에서도 실험 전 후에 유의한 체중 변화가 없어 ΔhFas-1이 별다른 독성을 가지지 않음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

관절염 염증 억제 기작의 확인

<4-1> 발 조직의 확인

생쥐 CIA 모델에서 ΔhFas-1 치료 후 뒷발에서의 관절염 발생에 따른 염증세포 침윤의 변화를 조사하였다. 이는 활막조직내의 염증정도와 침윤된 염증세포의 변화 및 혈관신생을 확인하기 위해 생쥐 모델의 발조직에서 조직절편을 만든 후 T세포, B세포, 혈관내피세포 및 ICAM-1의 분포로 다음과 같이 조사하였다.

생쥐 CIA 모델에서 발조직을 얻은 후 피부를 제거하고 10% 포르말린 용액에 넣어 이틀 동안 고정한 후 10% EDTA 용액에 넣어 탈회과정을 거쳤다. 탈회된 조직 은 탈수과정과 투명화 과정을 거친 후 파라핀 포매하여 마이크로톰(microtome)을 이용하여 3μm두께의 절편으로 만들었다. 조직절편은 100% 자일렌(xylene)과 에탄올을 이용하여 탈파라핀화 및 재탈수화(rehydration) 시킨 후 100% 메탄올에 0.3% 과산화수소수를 넣은 용액을 이용하여 비특이적인 조직내 퍼옥시다아제(peroxidase)를 차단하였다. 5% BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 비특이적인 단백결합을 차단한 후 각각의 일차항체(T cell marker로서 CD3에 대한 항체, B cell marker로서 B220에 대한 항체, endothelial cell marker로서 CD31에 대한 항체 및 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)에 대한 항체)와 4℃, 12시간에서 14시간 동안 배양한 후 세척버퍼(washing buffer; 0.1% BSA, 0.2% gelatin, 0.05% saponin)로 세척하였다. 바이오틴(biotin)이 붙은 이차항체와 상온에서 30분간 배양한 후 세척하였으며 벡타스타틴 ABC 키트(Vectastatin ABC kit; Vector Laboratories, 미국)로 반응시킨 후 DAB(Dako, Denmark)로 발색시켰다. 조직을 헤마토실린(hematoxyline)으로 발색시킨 후 유키트 마운팅 미디어(Eukitt mounting media; Fluka, Germany) 로 마운트하여 검경하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 대조군의 발조직 절편에서는 심한 염증세포 침윤과 함께 발관절의 뚜렷한 파괴소견이 관찰되었다. 그리고, ΔhFas-1 10mg/kg 치료군에서는 T세포와 B세포의 침윤은 대조군에 비해 눈에 띄는 감소는 관찰되지 않았다. 이에 비해서, 30mg/kg 치료군에서는 T세포와 B세포의 침윤은 대조군에 비해 뚜렷한 감소가 관찰되었고, CD31을 이용한 혈관분포의 연구에서도 30mg/kg의 ΔhFas- 1 치료 후 뚜렷한 신생혈관의 감소가 보여 30mg/kg의 ΔhFas-1 치료군에서는 가벼운 정도의 염증소견만 관찰되었으며 관절파괴 소견은 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다.

<4-2> 발 조직에서의 염증매개물의 변화 확인

발조직의 염증분포는 부위에 따라 다소 다른 소견을 보일 수 있고 정량적인 연구가 어렵기 때문에 생쥐 CIA 모델에서 ΔhFas-1 치료 후 뒷발에서의 관절염 발생에 따른 염증매개물의 변화를 Taqman 탐침(probe)를 이용한 반정량적 역전사 PCR 법으로 다음과 같이 측정하였다.

생쥐 CIA 모델에서 발조직을 얻은 후 피부를 제거하고 남은 조직은 모두 조직 호모지나이저(homogenizer)를 이용하여 갈아서 추출 시약(Easy-spin^TM, Intron)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이를 정량한 후 7㎍의 RNA로 AMV 역전사효소 (roche, 0.5μl), 올리고 dT(roche, 1μl), 10mM dNTP (Takara, 2ul), RNAse 저해제(roche, 0.1μl)를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다. 생쥐 IL-1β, IL-6, TNF-α, MMP-1, MMP-3, VCAM-1, RANKL, MCP-1, 18S RNA의 반정량적인 PCR을 위한 프라이머(Bioneer, Daejun)와 Taqman 탐침(Roche, Germany)을 사용하여 LC480(Roche, Germany)에서 전사체수를 구한 후 18S RNA전사체에 비교하여 정량화하였다. 상기에서 PCR 용 각각의 프라이머는 다음과 같다: 생쥐 IL-1β (서열번호 15: forward 5'-tgtaatgaaagacggcacacc-3', 서열번호 16: reverse 5'-tcttctttgggtattgcttgg-3'), IL-6 (서열번호 17: forward 5'-gagaaaagagttgtgcaatggc-3', 서열번호 18: reverse 5'-ccagtttggtagcatccatca-3'), TNF-α (서열번호 19: forward 5'-ctgtagcccacgtcgtagc-3', 서열번호 20: reverse 5'-ttgagatccatgccgttg-3'), MMP-1 (서열번호 21: forward 5’-tgtgtttcacaacggagacc 3’, 서열번호 22: reverse 5’-gcccaagttgtagtagttttcca 3’), MMP-3 (서열번호 23: forward 5’-tgttctttgatgcagtcagc-3’, 서열번호 24: reverse 5’-gatttgcgccaaaagtgc-3’), VCAM-1 (서열번호 25: forward 5’-tggtgaaatggaatctgaacc-3’, 서열번호 26: reverse 5’-cccagatggtggtttcctt-3’), RANKL (서열번호 27: forward 5’-tgaagacacactacctgactcctg-3’, 서열번호 28: reverse 5’-ccacaatgtgttgcagttcc-3’), MCP-1(서열번호 29: forward 5’-catccacgtgttggctca-3’, 서열번호 30: reverse 5’-gatcatcttgctggtgaatgagt-3’), 18S RNA (서열번호 31: forward 5’-aaatcagttatggttcctttggtc-3’, 서열번호 32: reverse 5’-gctctagaattaccacagttatccaa-3’).

그 결과, 도 7에서 보듯이, 각 염증매개물질의 전사체 수는 ΔhFas-1 치료군에서 치료용량의존적으로 감소하였으며 특히 30mg/kg의 ΔhFas-1 치료군에서는 뚜렷한 감소를 보임을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 βig-h3 단편을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 류마티스 관절염 부위의 염증을 억제하여 류마티스 관절염의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있으며, 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에도 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 βig-h3의 구조에 대한 모식도를 나타낸 것이다.

도 2는 인간 활막세포주에서 인간 4^th fas-1 도메인의 부착(A) 및 이주(C) 억제 여부 및 인간 ΔhFas-1의 부착(B) 억제여부를 확인한 것이다.

도 3은 생쥐 세포주(NIH3T3)에서 생쥐 4^th fas-1 도메인의 부착(A) 및 이주(B) 억제 여부 및 생쥐 ΔhFas-1의 부착(C) 및 이주(D) 억제여부를 확인한 것이다.

도 4는 생쥐 ΔhFas-1의 관절염 치료 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 생쥐 ΔhFas-1 투여 전 후 생쥐의 체중의 변화를 나타낸 것이다.

도 6은 생쥐 CIA 모델에서 ΔhFas-1 투여에 따른 뒷발 조직의 염증매개물의 분포를 확인한 것이다.(CD3: T cell marker; B220: B cell marker; CD31: endothelial cell marker; ICAM-1: intercellular adhesion molecule-1)

도 7은 생쥐 CIA 모델에서 ΔhFas-1 투여에 따른 염증매개물 전사체를 반정량적으로 측정한 결과이다.(흰색 막대: 정상군, 1 마리; 검은색 막대: 대조군(CIA), 5마리; 어두운 회색 막대: ΔhFas-1 10mg/kg, 4 마리; 옅은 회색 막대: ΔhFas-1 30mg/kg, 7 마리)

<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating rheumatoid arthritis comprising (beta)ig-h3 fragment as an active ingredient <130> NP07-0145 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys 1 5 10 15 Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val 20 25 30 Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp 35 40 45 Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu 50 55 60 Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala 65 70 <210> 2 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgagccctgc caccaagaga acggagcaga ctcttgggag atgccaagga acttgccaac 60 atcctgaaat accacattgg tgatgaaatc ctggttagcg gaggcatcgg ggccctggtg 120 cggctaaagt ctctccaagg tgacaagctg gaagtcagct tgaaaaacaa tgtggtgagt 180 gtcaacaagg agcctgttgc cgagcctgac atcatggcc 219 <210> 3 <211> 2100 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg 60 tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc 120 ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg 180 gccccaacgt gtgtgctgtg cagaaggtta ttggcactaa taggaagtac ttcaccaact 240 gcaagcagtg gtaccaaagg aaaatctgtg gcaaatcaac agtcatcagc tacgagtgct 300 gtcctggata tgaaaaggtc cctggggaga agggctgtcc agcagcccta ccactctcaa 360 acctttacga gaccctggga gtcgttggat ccaccaccac tcagctgtac acggaccgca 420 cggagaagct gaggcctgag atggaggggc ccggcagctt caccatcttc gcccctagca 480 acgaggcctg ggcctccttg ccagctgaag tgctggactc cctggtcagc aatgtcaaca 540 ttgagctgct caatgccctc cgctaccata tggtgggcag gcgagtcctg actgatgagc 600 tgaaacacgg catgaccctc acctctatgt accagaattc caacatccag atccaccact 660 atcctaatgg gattgtaact gtgaactgtg cccggctcct gaaagccgac caccatgcaa 720 ccaacggggt ggtgcacctc atcgataagg tcatctccac catcaccaac aacatccagc 780 agatcattga gatcgaggac acctttgaga cccttcgggc tgctgtggct gcatcagggc 840 tcaacacgat gcttgaaggt aacggccagt acacgctttt ggccccgacc aatgaggcct 900 tcgagaagat ccctagtgag actttgaacc gtatcctggg cgacccagaa gccctgagag 960 acctgctgaa caaccacatc ttgaagtcag ctatgtgtgc tgaagccatc gttgcggggc 1020 tgtctgtaga gaccctggag ggcacgacac tggaggtggg ctgcagcggg gacatgctca 1080 ctatcaacgg gaaggcgatc atctccaata aagacatcct agccaccaac ggggtgatcc 1140 actacattga tgagctactc atcccagact cagccaagac actatttgaa ttggctgcag 1200 agtctgatgt gtccacagcc attgaccttt tcagacaagc cggcctcggc aatcatctct 1260 ctggaagtga gcggttgacc ctcctggctc ccctgaattc tgtattcaaa gatggaaccc 1320 ctccaattga tgcccataca aggaatttgc ttcggaacca cataattaaa gaccagctgg 1380 cctctaagta tctgtaccat ggacagaccc tggaaactct gggcggcaaa aaactgagag 1440 tttttgttta tcgtaatagc ctctgcattg agaacagctg catcgcggcc cacgacaaga 1500 gggggaggta cgggaccctg ttcacgatgg accgggtgct gaccccccca atggggactg 1560 tcatggatgt cctgaaggga gacaatcgct ttagcatgct ggtagctgcc atccagtctg 1620 caggactgac ggagaccctc aaccgggaag gagtctacac agtctttgct cccacaaatg 1680 aagccttccg agccctgcca ccaagagaac ggagcagact cttgggagat gccaaggaac 1740 ttgccaacat cctgaaatac cacattggtg atgaaatcct ggttagcgga ggcatcgggg 1800 ccctggtgcg gctaaagtct ctccaaggtg acaagctgga agtcagcttg aaaaacaatg 1860 tggtgagtgt caacaaggag cctgttgccg agcctgacat catggccaca aatggcgtgg 1920 tccatgtcat caccaatgtt ctgcagcctc cagccaacag acctcaggaa agaggggatg 1980 aacttgcaga ctctgcgctt gagatcttca aacaagcatc agcgttttcc agggcttccc 2040 agaggtctgt gcgactagcc cctgtctatc aaaagttatt agagaggatg aagcattagc 2100 2100 <210> 4 <211> 683 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 260 265 270 Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr 515 520 525 Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly 545 550 555 560 Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 5 <211> 2100 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 ggcacgagcc tgctttcatc gtgggtccgc gcgtgctcca gctccatggc gctcctcatg 60 cgactgctga ccctcgctct ggcactgtct gtgggccccg ctgggaccct tgcaggtccc 120 gccaagtcac cctaccagct ggtgctgcag catagccggc tccggggtcg ccagcacggc 180 cccaatgtat gtgctgtgca gaaggtcatt ggcaccaaca agaaatactt caccaactgc 240 aagcagtggt accagaggaa gatctgcggc aagtcgacag tcatcagtta tgagtgctgt 300 cctggatatg aaaaggtccc aggagagaaa ggttgcccag cagctcttcc gctctcaaat 360 ctgtatgaga ccatgggagt tgtgggatcg accaccacac agctgtatac agaccgcaca 420 gaaaagctga ggcctgagat ggagggaccc ggaagcttca ccatctttgc tcctagcaat 480 gaggcctggt cttccttgcc tgcggaagtg ctggactccc tggtgagcaa cgtcaacatc 540 gaactgctca atgctctccg ctaccacatg gtggacaggc gggtcctgac cgatgagctc 600 aagcacggca tgaccctcac ctccatgtac cagaattcca acatccagat ccatcactat 660 cccaatggga ttgtaactgt taactgtgcc cggctgctga aggctgacca ccatgcgacc 720 aacggcgtgg tgcatctcat tgacaaggtc atttccacca tcaccaacaa catccagcag 780 atcattgaaa tcgaggacac ctttgagaca cttcgggccg ccgtggctgc atcaggactc 840 aataccgtgc tggagggcga cggccagttc acactcttgg ccccaaccaa cgaggccttt 900 gagaagatcc ctgccgagac cttgaaccgc atcctgggtg acccagaggc actgagagac 960 ctgctaaaca accacatcct gaagtcagcc atgtgtgctg aggccattgt agctggaatg 1020 tccatggaga ccctgggggg caccacactg gaggtgggct gcagtgggga caagctcacc 1080 atcaacggga aggctgtcat ctccaacaaa gacatcctgg ccaccaacgg tgtcattcat 1140 ttcattgatg agctgcttat cccagattca gccaagacac tgcttgagct ggctggggaa 1200 tctgacgtct ccactgccat tgacatcctc aaacaagctg gcctcgatac tcatctctct 1260 gggaaagaac agttgacctt cctggccccc ctgaattctg tgttcaaaga tggtgtccct 1320 cgcatcgacg cccagatgaa gactttgctt ctgaaccaca tggtcaaaga acagttggcc 1380 tccaagtatc tgtactctgg acagacactg gacacgctgg gtggcaaaaa gctgcgagtc 1440 tttgtttatc gaaatagcct ctgcattgaa aacagctgca ttgctgccca tgataagagg 1500 ggacggtttg ggaccctgtt caccatggac cggatgttga cacccccaat ggggacagtt 1560 atggatgtcc tgaagggaga caatcgtttt agcatgctgg tggccgccat ccagtctgca 1620 ggactcatgg agatcctcaa ccgggaaggg gtctacactg tttttgctcc caccaatgaa 1680 gcgttccaag ccatgcctcc agaagaactg aacaaactct tggcaaatgc caaggaactt 1740 accaacatcc tgaagtacca cattggtgat gaaatcctgg ttagcggagg catcggggcc 1800 ctggtgcggc tgaagtctct ccaaggggac aaactggaag tcagctcgaa aaacaatgta 1860 gtgagtgtca ataaggagcc tgttgccgaa accgacatca tggccacaaa cggtgtggtc 1920 tatgccatca acactgttct gcagccgcca gccaaccgac cacaagaacg aggagatgag 1980 ctggcagact ctgcccttga aatcttcaaa caggcgtcag cgtattccag ggctgcccag 2040 aggtctgtgc gacttgcccc tgtctatcag cggttactgg agaggatgaa gcattagcag 2100 2100 <210> 6 <211> 683 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ala Leu Leu Met Arg Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Leu Ser Val 1 5 10 15 Gly Pro Ala Gly Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Lys Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Met Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ser Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Asp Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Val Leu Glu Gly Asp 260 265 270 Gly Gln Phe Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ala Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Met Ser Met Glu Thr Leu Gly Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Lys Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Val Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Phe Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Leu Glu Leu Ala Gly 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Ile Leu Lys Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Asp Thr His Leu Ser Gly Lys Glu Gln Leu Thr Phe Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Val Pro Arg Ile Asp Ala Gln Met Lys 420 425 430 Thr Leu Leu Leu Asn His Met Val Lys Glu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr Ser Gly Gln Thr Leu Asp Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Phe Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Met Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Met 515 520 525 Glu Ile Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Gln Ala Met Pro Pro Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Ala 545 550 555 560 Asn Ala Lys Glu Leu Thr Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Ser Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Thr Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val Tyr Ala Ile Asn Thr Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Ala Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_F <400> 7 atggagatat cgctgacccc ccca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_R <400> 8 tcctgctcga ggttggctgg aggc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_F <400> 9 tatgatatcc caagccatgc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_R <400> 10 tcaatctcga gcatgatgtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_F <400> 11 tatcatatgc aagccatgcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_R <400> 12 tcaccgaatt ccatgatgtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4_F <400> 13 tatcatatgc aagccatgcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4_R <400> 14 tcaccgaatt ccatgatgtc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-1 <400> 15 tgtaatgaaa gacggcacac c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-2 <400> 16 tcttctttgg gtattgcttg g 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-1 <400> 17 gagaaaagag ttgtgcaatg gc 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-2 <400> 18 ccagtttggt agcatccatc a 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-1 <400> 19 ctgtagccca cgtcgtagc 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-2 <400> 20 ttgagatcca tgccgttg 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1-1 <400> 21 tgtgtttcac aacggagacc 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1-2 <400> 22 gcccaagttg tagtagtttt cca 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3-1 <400> 23 tgttctttga tgcagtcagc 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3-2 <400> 24 gatttgcgcc aaaagtgc 18 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1-1 <400> 25 tggtgaaatg gaatctgaac c 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1-2 <400> 26 cccagatggt ggtttcctt 19 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL-1 <400> 27 tgaagacaca ctacctgact cctg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL-2 <400> 28 ccacaatgtg ttgcagttcc 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1-1 <400> 29 catccacgtg ttggctca 18 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1-2 <400> 30 gatcatcttg ctggtgaatg agt 23 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18SRNA-1 <400> 31 aaatcagtta tggttccttt ggtc 24 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18SRNA-2 <400> 32 gctctagaat taccacagtt atccaa 26

Claims (4)

1. βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 벡터를 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

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