KR101369502B1 - ｄｈＦａｓ-1 도메인과 ＭＭＰ기질을 포함하는 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

ｄｈＦａｓ-1 도메인과 ＭＭＰ기질을 포함하는 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 dhFas-1 도메인과 MMP기질을 포함하는 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 염증성 질환, 특히 류마티스 관절염 부위의 활막세포의 부착 및 이동을 억제하여 류마티스 관절염의 확대를 막고 면역세포의 침윤을 억제시켜 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

ｄｈＦａｓ-1 도메인과 ＭＭＰ기질을 포함하는 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Fusion peptide comprising dhFas-1 domain and MMP substrate and pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease comprising the same}
본 발명은 dhFas-1 도메인과 MMP기질을 포함하는 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증 반응이란 조직(세포)의 손상이나 외부감염원에 감염되었을 때 발생하며 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 또한 그 결과에 따라 급성 염증과 육아종(granuloma 염증), 류마티스 관절염 등의 만성염증의 증상으로 나타난다(Goodwin J.S. et al., J. Clin . Immunol ., 9: 295-314, 1989).
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 관절을 포함한 전신에 만성 염증을 일으키는 자가 면역성 질환으로, 남성보다 여성에게 더 많이 발병하고 있고, 그 원인에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀진 것이 없으며, 다만 유전적 요인과 환경적 요인 등에 의해 유발되는 것으로 추측되고 있을 뿐이다. 따라서 류마티스 관절염의 발병원인을 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되고 있으며, 최근 들어 유전적인 인자가 류마티스 관절염의 감수성 및 예후 진단에 중요한 역할을 하며, 전반적인 면역 반응에 걸친 후생유전적(epigenetic) 제어의 불균형이 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질환을 일으킨다는 내용이 보고된 바 있다(Richardson B. et al.,Clin Immunol, 109, 72-79, 2003).
류마티스 관절염의 염증은 주로 인체내 관절의 활막(Synovial membrane)에 발생하며, 특히 6주 이상 염증이 지속되는 것을 말한다. 일단 류마티스 관절염이 시작되면, 활막 조직의 혈액으로부터 여러 가지 염증세포들로 이루어진 '판누스(Pannus)'라는 덩어리를 형성하고 이것이 연골을 파괴하고 관절의 변형을 가져오며 관절주위에 있는 뼈도 약하게 만든다. 이러한 관절 염증의 결과 관절이 붓고 아프게 되며 관절의 운동 범위가 제한을 받게 되고 관절 주위가 벌겋게 변하며 만져 보면 따뜻한 느낌도 들 수 있게 된다.
이 질환은 인체 면역 기능에 이상이 오는 것으로, 다시 말하면 정상적으로는 우리 몸속에서 세균 같은 외부의 이물질에 대하여 몸을 방어하는 역할을 해야 하는 면역계가 알 수 없는 이유로 우리 자신의 몸을 스스로 공격하기 때문에 발생하는 병이다. 이런 상태를 '자가 면역'이라고 부르며, 이런 원리로 여러 관절, 특히 손 관절에 대칭적으로 염증을 일으켜 수 년 내지 수십 년에 걸쳐 관절을 서서히 파괴시키며, 때로는 관절뿐만 아니라 폐, 심장, 눈, 혈관, 신경 등 여러 장기를 침범하기도 한다. 또한, 이 질병은 주로 30대 전후 인생의 활동기에 발병하여 신체 기능에 장애를 유발하여 삶의 질을 떨어뜨리고 작업능력을 저하시켜 막대한 경제적 손실을 초래한다.
현재까지 류마티스 관절염의 발병원인에 대해 많은 연구가 이루어졌음에도 불구하고, 류마티스 관절염의 확실한 원인은 아직도 밝혀내지 못하고 있다. 하지만 류마티스 관절염에 대한 임상적 치료방법들은 여러 가지가 개발되어 있으며, 이는 일반 보존적 요법, 약물요법, 수술적 요법 등으로 나뉜다. 일반적으로 류마티스 관절염의 치료는 이 질병이 만성 관절염에 의한 관절통증과 관절의 변형, 기능의 소실을 유발하므로 통증과 염증을 억제하고 관절의 기능소실을 최소화하여 정상 생활로 복귀하는데 치료의 목표를 두고 있다. 현재 흔히 사용되는 치료 방법은 약물 요법인데, 이는 그 증상에 따라서, 아스피린 & 비스테로이드성 소염제, 저용량 경구 스테로이드제, 항 말라리아 제재(antimalarial drug), 설파살라진(sulfasalazine), 금제재(Gold compounds), 페니실라민(penicillamine), 면역 억제제 (메소트렉세이트(MTX), 이뮤란(Immuran) 등) 등의 항류마티스 약제(DMARDs), 관절내 스테로이드제 주사 및 생물학적 제제인 종양괴사인자 차단제(etanercept, infliximab, adalimumab), 인터류킨-1 수용체 길항제(anakinra), 항-CD20항체(rituximab) 등이 사용된다. 하지만, 이러한 약물요법은 위장장애, 간장애, 신장기능장애, 감염 등의 부작용이 발생할 수 있는 단점이 있다. 따라서 부작용이 적으며 류마티스 관절염의 제반 증상인 염증, 부종, 비정상적인 신혈관 생성, 골 및 연골조직 침식 등을 개선할 보다 진보된 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
콜라겐 유발 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)은 T 임파구성 류마티스 관절염의 동물 모델로 사용되어 왔다(Autoimmunity to Type II collagen: Experimental model of arthritis, J. Exp. Med. 146;857-868 (1977)). 관절염에 걸리기 쉬운 실험용 쥐에 콜라겐 II를 주사하면 2주내에 판누스 형성, 뼈, 연골의 침식과 함께 관절염이 유발된다. 류마티스 관절염과 마찬가지로 콜라겐 유발 관절염도 콜라겐에 대한 체액성, 세포성 면역 반응을 일으킨다.
한편, 세포의 기질단백은 조직의 골격을 구성하는데 있어 중요한 역할을 담당하는 구성성분으로써 많은 연구를 통해 조직의 형태뿐만 아니라 기능을 유지, 조절하는데 있어서도 핵심적인 역할을 하는 것으로 규명되어 왔다. Transforming growth factor-β (TGF-β)에 의해 유도되는 기질인 TGF-β-inducible gene-h3(βig-h3)은 분자구조가 최근에 규명된 단백으로써 세포의 부착, 이주, 분화 및 증식 등의 기능조절에 중요한 역할을 담당한다.
TGF-β의 관련 유전자로 알려진 βig-h3은 Skonier 등에 의해 처음 동정된 유전자로, TGF-β1을 처리한 인체폐선암종 세포주인 A549 세포주에서 cDNA 자료 선별 중 동정되었으며, TGF-β1로 처리한 후 2일 만에 20배 이상의 증가를 보이는 것으로 보고되었다(Stonier, J. et al., DNA cell Biol. 11, 511, 1992). βig-h3의 DNA 서열 분석에 의해, βig-h3 단백질은 아미노 말단 분비 서열(amino-terminal secretory sequence)과 몇 가지 인테그린(integrin)에 대하여 리간드 식별(ligand recognition)이 가능한 카르복시 말단(carboxy-terminal) Arg-Gly-Asp (RGD) 배열을 가진 683개의 아미노산으로 구성되어 있음이 밝혀졌다.
이에 본 발명자들은 본 발명자들은 βig-h3의 기능에 대해서 연구하던 중 βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 단편(이하 dhFas-1라 함. 인간 dhFas-1은hsdhFas-1', 마우스 dhFas-1은mdhFas-1'라 함.)을 포함하는 융합 펩타이드의 신규한 용도에 관한 것을 연구하던 중, dhFas-1 도메인에 MMP 기질 및 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차레로 연결된 융합 펩타이드가 염증성 질환에 효과적인 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP1 기질, MMP3 기질 및 MMP 공통(consensus) 기질로 이루어진 군에서 선택된 MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP1 기질, MMP3 기질 및 MMP 공통(consensus) 기질로 이루어진 군에서 선택된 MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix etalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 dhFas-1의 치료효율을 높이기 위한 방법에 관하여 연구하던 중 dhFas-1 단편에 RGD를 포함하는 아미노산 사슬을 연결시키는 경우 그 효과가 뚜렷하게 증가되지 않았으나, 이 dhFas-1과 RGD 펩타이드를 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP, matrix metalloproteinase)에 의해 분해되는 5개 내지 10개의 아미노산(MMP기질)으로 구성된 아미노산 사슬로 연결하여 염증부위에서 선택적으로 잘라지게 하는 경우 염증 치료 효과가 월등히 증가되는 것을 규명하였다.
따라서 본 발명의 펩타이드는 a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 것을 특징으로 한다.
βig-h3은 인간의 흑색소 세포종 세포(human melanoma cells), 포유동물의 상피세포(mammary epithelial cells), 각질형성세포(keratinocytes) 및 폐섬유아세포(lung fibroblasts) 등을 포함하는 여러 종류의 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포외 기질단백질(extracellular matrix protein)이다(Skonier, J. et al., DNA Cell Biol., 13 , 571, 1994). βig-h3은 RGD 모티프와 함께 상동성을 지닌 4개의 반복된 내부 도메인(internal domain)을 포함하고 있는데, 이 도메인은 포유류, 곤충, 성게, 식물, 효모 및 세균을 포함하는 여러 종의 분비 단백질 또는 막(membrane) 단백질에서 매우 보존적인 서열로서 발견된다. 상기 보존적 서열을 포함하는 단백질들에는 페리오스틴(periostin), 파스시클린 (fasciclin ), 성게 HLC-2(sea urchin HLC-2), 조류의 알갈-CAM(Algal-CAM) 및 마이코박테리움 MPB70(mycobacterium MPB70) 등이 포함되는 것으로 밝혀졌다(Kawamoto, T. et al., Biochem. Biophys. Acta., 1395, 288, 1998). 이러한 단백질들에서 보존적으로 발견되는 상동성 도메인(fas-1 도메인이라 함)은 110 내지 140개의 아미노산으로 구성되며, 특히 상동성이 높은 약 10개의 아미노산으로 구성된 두 개의 가지(H1 및 H2)를 포함하고 있다.
dhFas-1은 βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 아미노산 사슬을 말한다. βig-h3 단백질은 리간드 인식 부위인 RGD 모티브와 4개의 내부 반복 도메인인 fas-1 도메인을 포함하고 있다. 상기 fas-1 도메인 중 4번째 도메인에는 α3β1 인테그린과 상호작용하는 모티프가 존재하며, 티로신-히스티딘 아미노산 서열을 포함하며 섬유아세포의 부착을 매개하는 YH모티프가 존재한다. 아울러, 네 번째 fas-1 도메인에는 상동성이 매우 높은 약 10개의 아미노산으로 이루어진 H1 및 H2가 그 내부에 존재한다.
본 발명의 dhFas-1은 공지된 βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 아미노산 사슬이면 어떤 것이든 가능하며, 바람직하게는 마우스 유래 dhFas-1(mdhFas-1) 또는 인간 유래 dhFas-1(hsdhFas-1)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것 일 수 있다. dhFas-1은 이전의 방법(대한민국 공개특허공보 10-2004-0086708)에 의하여 제작될 수 있다.
본 발명의 RGD 모티프를 포함하는 펩타이드는 인테그린을 차단하는 효과를 가지는 RGD(아르기닌-글라이신-아스파르트산)서열을 포함하는 것이면 어떤 것이든 가능하며 바람직하게는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 아미노산 사슬일 수 있다.
MMP기질이란 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP, matrix metalloproteinase) 에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다.
류마티스 관절염에서 활막세포는 MMP와 카텝신(cathepsin)이라는 효소 분비를 통하여 연골기질을 파괴시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 MMP는 약 19종류의 다양한 효소로 구성되며 크게 콜라게나제(collagenase), 젤라티나제(gelatinase), 스트로멜라이신(stromelysin), 막성 MMP(membrane type MMP; MT-MMP)의 4가지로 구분되며 콜라게나제-1(MMP-1), 콜라게나제-2(MMP-8), 콜라게나제-3(MMP-13)이 원형 콜라겐을 파괴시키는 주요 콜라게나제로 알려져 있다.
염증성 질환에 관여하는 MMP의 종류는 질환에 따라 다양한 종류가 있다. 급성 염증성 질환 내독소 쇼크에서는 MMP-9이 관여되며, 만성 염증성 질환 다발성 경화증에서는 MMP-2와 MMP-9, 뇌졸중과 심근 경색증을 포함하는 죽상동맥 경화증에서는 MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 승모판막 재협착증에서는 MMP-2와 MMP-9, 치주염와 임플란트 주위염에서는 MMP-8과 MMP-9, 만성폐쇄폐병에서는 MMP-12, 천식에서는 MMP-2, MMP-8, MMP-9, 폐섬유증에서는 MMP-7과 MMP-12, 간염에서는 MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, 췌장염과 수막염에서는 MMP-2, MMP-8, MMP-9 등이 관여한다. (Jialiang Hu. et al ., Nat . Rev . Drug . Discov . 6:480-498, 2007) 따라서 질병의 종류에 따라 효과를 나타내는 MMP 기질은 서로 다를 수 있다.
본 발명의 MMP 기질이란 MMP에 의해 분해되는 짧은 펩타이드를 말하며, 구체적으로 MMP1 기질, MMP2 기질, MMP3 기질, MMP7 기질, MMP8 기질, MMP9 기질, MMP12 기질, MMP13 기질, MMP 공통 기질 등을 말한다. 상기 MMP1 기질은 MMP-1에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다. MMP2 기질은 MMP-2에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP3 기질은 MMP-3에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP7 기질은 MMP-7에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP8 기질은 MMP-8에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP9 기질은 MMP-9에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP12 기질은 MMP-12에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP13 기질은 MMP-13에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다. MMP 공통(consensus) 기질은 MMP-1, MMP-2 및 MMP-3에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다 .
본 발명의 MMP 기질은 상기 dhFas-1과 인테그린을 차단하는 효과를 가지는 RGD를 포함하는 아미노산 사슬 사이에 존재하여 염증이 진행이 시작되는 곳에서 분해되어 상기 dhFas-1과 RGD를 포함하는 아미노산 사슬의 부착효율을 증가시키는 것이면 어떠한 구성의 아미노산 사슬도 가능하나 바람직하게는 LGVR, QGIA, LGLW 또는 LGIA로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 사슬일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GPLGVRG, GPQGIAG, GPLGLWARG, 또는 GPLGIAG의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 사슬일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5 내지 8의 아미노산 서열로 표시되는 아미노산 사슬일 수 있다.
본 발명의 dhFas-1; MMP 기질; 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드(이하 'dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드'라 함. 또한 mdhFas-1, MMP2 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 MFK23로; mdhFas-1, MMP1 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 MFK24로; mdhFas-1, MMP3 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 MFK27로; mdhFas-1, MMP 공통(consensus) 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 MFK25로; hsdhFas-1, MMP1 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 hsFJ24로; hsdhFas-1, MMP3 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 hsFJ27로; hsdhFas-1, MMP 공통(consensus) 기질, 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드는 hsFJ25로 명명한다)는 바람직하게는 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 RGDSP 또는 QERGDSLA 서열을 포함하는 아미노산 사슬이거나 MMP기질이 GPQGIAG, GPLGLWARG 또는 GPLGIAG의 서열을 포함하는 아미노산 사슬인 것일 수 있다.
본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드는 바람직하게는 상기 ig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2부위를 제거한 아미노산 사슬(dhFas-1)과 상기 MMP기질 사이에 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커를 포함하는 펩타이드 또는 상기 MMP기질과 상기 RGD를 포함하는 아미노산 사슬 사이에 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드일 수 있다.
상기 βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2부위를 제거한 아미노산 사슬(dhFas-1)과 상기 MMP기질 사이에 포함되는 본 발명의 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커는 MMP 기질과 RGD를 포함하는 아미노산 사슬을 연결하는 짧은 펩타이드로 그 구성은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 VD(발린-아스파르트산) 또는 VDG(발린-아스파르트산-글라이신)일 수 있다.
또한 상기 MMP기질과 상기 RGD를 포함되는 본 발명의 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커는 MMP 기질과 RGD를 포함하는 아미노산 사슬을 연결하는 짧은 펩타이드로 그 구성은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 LE(루신-글루탐산) 또는 EF(글루탐산-페닐알라닌)일 수 있다.
본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드는 더욱 바람직하게는 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 RGDSP 또는 QERGDSLA로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬이거나, MMP기질이 GPLGVRG, GPQGIAG, GPLGLWARG 또는 GPLGIAG의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬인 것인 펩타이드 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 11 내지 17로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 일 수 있다.
본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드는 dhFas-1; MMP 기질; 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 연결된 펩타이드에 대하여 기능적 동등물일 수 있으며 바람직하게는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서 본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 12 내지 17의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 여기서 실질적으로 동질의 활성이란 류마티스 관절염의 예방 및 치료를 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예로는 지방족 아미노산군(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산군(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산군(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산군(Asp, Glu), 염기성 아미노산군(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산군의 각 아미노산군 내부의 동일한 아미노산 산의 치환일 수 있다. 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한 아미노산의 결실을 의미한다. 아미노산의 부가는 유전자 조작과정에서 필요한 제한효소 부위 또는 펩타이드 정제 등을 위한 histidine tag 등을 포함하는 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산이 부가되는 것을 말한다.
또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 그 일부 화학구조가 변형된 펩타이드 유도체도 포함된다. 예를 들어 본 발명의 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.
본 발명의 펩타이드를 얻기 위한 유전자는 어떤한 공급원의 게놈 DNA 또는 cDNA로부터도 분리가능 하며 바람직하게는 사람 또는 생쥐의 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자를 획득하기 위한 일반적인 방법은 종래 기술에 잘 나타나 있다(참조: Sambrook, Fitsch & Manatis, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Second Edition(1989)). 또한 어떠한 동물 세포든지 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산 공급원으로써 제공될 수 있다. DNA는 클론된 DNA로부터 공지의 기술에 의해 획득될 수 있으며, 바람직하게는 화학합성, cDNA 클로닝 또는 게놈 DNA의 클로닝 또는 그들의 단편의 클로닝 또는 원하는 세포로부터 정제된 단편의 클로닝에 의해 단백질을 고수준으로 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 획득될 수 있다[Sambrook et al., 1989, supra: Glover, D.M.(ed). 1985, DNA Cloning; A Practical Approach. MRL Press. Ltd., Oxford. U. K. Vol. I.II]. 게놈 DNA로부터 클로닝된 유전자는 암호화 영역에 부가되어 조절 영역과 인트론 DNA영역을 포함한다. cDNA로부터 클로닝된 유전자는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 공급원이 무엇이든지 간에, 유전자는 유전자의 전달을 위한 적합한 벡터로 분자적으로 클로닝되어야 한다.
본 발명의 펩타이드들은 당해 분야의 숙련가가 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드는, 흔히 보다 큰 폴리펩타이드의 일부로서 본 발명의 펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시켜 원핵 또는 진핵 세포에서 생성시킬 수 있다. 다른 방법으로는, 이러한 펩타이드는 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 재조합 숙주내의 이종성 단백질의 발현, 폴리펩타이드의 화학적 합성 및 시험관내 전사를 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌(참조 문헌: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Sprin Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing)에 추가로 기재되어 있다.
한편, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 dhFas-1, MMP 기질; 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드(dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 암호화 하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 RGD 구조는 RGDSP 또는 QERGDSLA를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 RGDSP 또는 QERGDSLA로 구성된 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬일 수 있다. 상기 MMP 기질은 MMP-1에 의해 분해되는 MMP 기질, MMP-2에 의해 분해되는 기질, MMP-3에 의해 분해되는 기질, MMP-7에 의해 분해되는 기질, MMP-8에 의해 분해되는 기질, MMP-9에 의해 분해되는 기질, MMP-12에 의해 분해되는 기질, MMP-13에 의해 분해되는 기질, MMP-1, MMP-2 및 MMP-3 모두에 의해 분해되는 MMP 공통 기질 등을 말한다.
상기 본 발명의 MMP 기질은 상기 dhFas-1과 인테그린을 차단하는 효과를 가지는 RGD를 포함하는 아미노산 사슬 사이에 존재하여 염증이 진행이 시작되는 곳에서 분해되어 상기 dhFas-1과 RGD를 포함하는 아미노산 사슬의 부착효율을 증가시키는 것이면 어떠한 구성의 아미노산 사슬도 가능하나 바람직하게는 LGVR, QGIA, LGLW 또는 LGIA로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 사슬일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GPLGVRG, GPQGIAG, GPLGLWARG, 또는 GPLGIAG의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 사슬일 수 있다.
가장 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18 내지 24의 서열로 표시되는 염기서열을 포함하는 것 일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
한편, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 dhFas-1; MMP 기질; 및 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드(dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
상기 프로모터란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단으로 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.
DNA 바이러스 벡터로는 약독화된 또는 결손형 DNA 바이러스, 예를 들면 이에 제한되지는 아니하나 단순 포진 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스 등을 포함한다. 바이러스 유전자가 전부 또는 거의 전부 결실된 결손형 바이러스가 바람직하다. 결손형 바이러스는 세포에 도입된 후에는 복제능이 없어 생산적인 바이러스 감염을 유도하지 못한다. 따라서, 결손형 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수도 있다는 걱정 없이 특정한 일부 영역에 있는 세포에 투여할 수 있다. 따라서, 특정 조직은 특이적으로 표적화 할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
한편 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 " 천연" 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며, 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명에서 숙주세포는 바람직하게는 E.coli일 수 있다.
벡터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인산칼슘침전법(calcium phosphate precipitation), DEAE-dextran법, 전기천공법(electroporation), 직접 미세주입법(direct microinjection), DNA-로딩 리포좀(DNAloaded liposome)법, 리포펙타민-DNA복합체(liofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법(cell sonication), 고속미세분사(high velocity microprojectile)를 이용한 유전자 폭격법(gene bombardment), 다양이온(polycation)법 및 수용체 매개 형질전이법(receptor-mediated transfection)에 의하여 형질전환 할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 대량의 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 형질전환체가 원핵세포(예컨대, E. coli)인 경우, LB(Luria-Bertani) 배지를 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 형질전환체가 동물세포인 경우에는, 예컨대, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))을 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다.
형질전환체의 다양한 배양방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 융합 펩타이드는 염증성 질환을 치료하는 효능이 우수하다. 상기 염증성 질환은 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게는 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 거대 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 다중심성 세망조직구종, 혈색소병증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 또한 급만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 건선 등 염증성 피부질환도 포함된다. 가장 바람직하게는 류마티스 관절염이다.
이와 같은 본 발명 조성물의 특징은 실시예에서 확인된다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 mdhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드(MKF23, MFK24, MFK25), mdhFas-1, hsdhFas-1 및 mdhFas-1-RGD 구조 펩타이드(MFK12)를 제작하여 활막세포 부착 및 이주 억제 효능을 측정하였다.
그 결과 MFK23, MFK24 및 MFK25의 경우 기존의 YH18 모티프, mdhFas-1 및 본 발명의 mdhFas-1 구조변형 펩타이드에 비하여 세포 부착 및 이주 억제 효과가 월등히 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 mdhFas-1과 RGDSP를 각각 또는 혼합하여 동일한 세포 부착시험을 실시하여 MFK24와 비교하여본 결과 MFK24가 가장 탁월한 세포부착 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 3, 비교예 1 및 비교예 2 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 콜라겐유도 관절염 생쥐 모델에서 본 발명의 펩타이드의 관절염 치료 효과를 확인하였다.
본 발명의 펩타이드를 일정기간 투여하면서 관절염 지수를 측정하여 대조군과 비교한 결과, 대조군인 mdhFas-1 및 MFK12의 경우 30mg/kg체중을 투여한 군에서 관절염 억제 효과가 나타나며, MMP-1에 의해 분해되는 MMP1기질을 포함하는 본 발명의 펩타이드의 경우 0.1mg/kg체중을 투여한 군에서도 우수한 관절염 억제 효과가 지속되는 것을 확인하였다.
또한 실험대상 생쥐의 발 조직을 검사한 결과 본 발명의 펩타이드를 투여한 군은 0.1mg/kg체중을 투여한 군에서도 활막세포의 증식이 억제되고 연골 및 뼈의 형태 파괴 정도가 감소하는 것을 관찰 할 수 있었으며, 염증매개물질 양을 측정한 결과 본 발명의 펩타이드를 투여한 군은 0.1mg/kg체중을 투여한 경우에도 효과적으로 염증매개물질을 억제하는 것을 확인하였다.
MFK12의 경우 10mg/kg체중을 투여한 군에서는 관절부위가 파괴되고 활막세포의 과다증식이 관찰되었으며, 혈관신생과 세포부착단백질의 발현이 대조군만큼 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 30mg/kg체중을 투여한 경우 치료효과가 다소 나타나는 것을 확인하였다. 염증매개물질 측정결과에서도 MFK12는 10mg/kg체중을 투여한 군은 대조군과 비교하여 염증매개물질 발현량에 유의적 차이가 없으며, 30mg/kg체중을 투여한 경우 발현량 감소가 나타나는 것을 확인하였다(실시예 4, 비교예 3 및 비교예 4 참조).
이로서 본 발명의 펩타이드는 기존의 펩타이드에 비하여 관절염 치료 효과가 100배 이상 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드는 dhFas-1, MFK12에 비하여 매우 적은 투여 용량으로도 류마티스 관절염에 대한 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2부위를 제거한 아미노산 사슬(dhFas-1); MMP1 기질, MMP3 기질 및 MMP 공통(consensus) 기질로 이루어진 군에서 선택된 MMP 기질; 및 그리고 RGD를 포함하는 아미노산 사슬이 차례로 연결된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 MMP 기질은 MMP에 의하여 분해되는 짧은 펩타이드를 말한다. 구체적으로, 이에 한정되지는 않지만, MMP1 기질, MMP2 기질, MMP3 기질, MMP7 기질, MMP8 기질, MMP9 기질, MMP12 기질, MMP13 기질 및 MMP 공통 기질 등을 말한다.
본 발명의 MMP1 기질, MMP3 기질 및 MMP 공통(consensus) 기질로 이루어진 군에서 선택된 MMP 기질은 바람직하게는 LGVR, QGIA, LGLW 또는 LGIA를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬 일 수 있으며 더욱 바람직하게는 GPLGVRG, GPQGIAG, GPLGLWARG 또는 GPLGIAG로 구성된 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬일 수 있다.
상기 RGD를 포함하는 아미노산 사슬은 RGDSP 또는 QERGDSLA로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 사슬인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 펩타이드가 서열번호 11 내지 17로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있으며, 이의 기능적 동등물도 포함한다. 본 발명의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 이용하는 경우 dhFas-1을 이용하는 경우에 비하여 적은 용량으로도 더 우수한 효능을 나타낼 수 있으며 그 단편의 길이가 비교적 작아 단백질간 서로 뭉치지 아니하므로 제형화 하는 과정에서 조절이 훨씬 쉽고 약물전달 측면에서도 유리하다.
또한 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 생체내에서 발현시켜 염증성 질환 예방 및 치료에 유효한 물질을 생산해 낼 수 있으므로, 본 발명은 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물이 적용될 수 있는 질환은 염증성 질환, 바람직하게는 류마티스 관절염이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드, 또는 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명 조성물의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명 조성물의 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드의 바람직한 용량은 1일당 환자 체중 1 당 약 0.01ug 내지 1,000mg, 가장 바람직하게는 0.1ug 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 dhFas-1-MMP 기질-RGD 구조 펩타이드를 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
따라서 본 발명의 dhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드는 염증성 질환, 특히 류마티스 관절염 부위의 활막세포의 부착 및 이동을 억제하여 류마티스 관절염의 확대를 막고 면역세포의 침윤을 억제시켜 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 hsdhFas-1(인간 ig-h3의 fas-1 domain의 구조 변형 펩타이드)의 sequence와 hsdhFas-1 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 2는 mdhFas-1(생쥐 ig-h3의 fas-1 domain의 구조 변형 펩타이드)의 sequence와 mdhFas-1 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 3은 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 hsdhFas-1에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 면역블롯 결과이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도).
도 4는 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 mdhFas-1에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 면역블롯 결과이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도).
도 5는 mdhFas-1에 아미노산서열 RGDSP가 결합한 펩타이드(MFK12)의 sequence와 MFK12 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 6은 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 MFK12에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도).
도 7은 MFK23의 sequence와 MFK23 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 8은 MFK24의 sequence와 MFK24 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 9는 MFK25의 sequence와 MFK25 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 10은 MMP-2 기질을 가지고 있는 MFK23 펩타이드의 MMP-1,-2,-3과 Cathepsin K, L, D의 효소 소화 시험한 결과이다(MFK23(ug) : 투여한 MFK23 펩타이드의 양(ug); MMP1(ng), MMP2(ng), MMP3(ng) : 소화효소 시험에 사용된 MMP(메트릭스 메탈로프로티나제, matrix metalloproteinase) 1, MMP2 또는 MMP3의 양; Cathepsin D(ng), Cathepsin L(ng), Cathepsin K(ng) : 소화효소 시험에 사용된 카텝신D, L 또는 카텝신 K의 양; Ab-histidine : 항-히스티딘 항체가 결합한 펩타이드의 양; Ab-bigh3 : 항-Bigh3항체가 결합한 펩타이드의 양; normalized ratio(histidine/big-h3) : histidine의 양을 big-h3의 양으로 나눈 비율).
도 11은 MMP-1 기질을 가지고 있는 MFK24 펩타이드의 MMP-1,-2,-3과 Cathepsin K, L, D의 효소 소화 시험한 결과이다(MFK24(ug) : 투여한 MFK24 펩타이드의 양(ug); MMP1(ng), MMP2(ng), MMP3(ng) : 소화효소 시험에 사용된 MMP(메트릭스 메탈로프로티나제, matrix metalloproteinase) 1, MMP2 또는 MMP3의 양; Cathepsin D(ng), Cathepsin L(ng), Cathepsin K(ng) : 소화효소 시험에 사용된 카텝신D, L 또는 카텝신 K의 양; Ab-histidine : 항-히스티딘 항체가 결합한 펩타이드의 양; Ab-bigh3 : 항-Bigh3항체가 결합한 펩타이드의 양; normalized ratio(histidine/big-h3) : histidine의 양을 big-h3의 양으로 나눈 비율).
도 12는 MMP-consensus 기질을 가지고 있는 MFK25 펩타이드의 MMP-1,-2,-3과 Cathepsin K, L, D의 효소 소화 시험한 결과이다(MFK25(ug) : 투여한 MFK25 펩타이드의 양(ug); MMP1(ng), MMP2(ng), MMP3(ng) : 소화효소 시험에 사용된 MMP(메트릭스 메탈로프로티나제, matrix metalloproteinase) 1, MMP2 또는 MMP3의 양; Cathepsin D(ng), Cathepsin L(ng), Cathepsin K(ng) : 소화효소 시험에 사용된 카텝신D, L 또는 카텝신 K의 양; Ab-histidine : 항-히스티딘 항체가 결합한 펩타이드의 양; Ab-bigh3 : 항-Bigh3항체가 결합한 펩타이드의 양; normalized ratio(histidine/big-h3) : histidine의 양을 big-h3의 양으로 나눈 비율).
도 13은 인간 활막세포에서 분비되는 MMP-1에 의해 잘려지는 MFK24 펩타이드 효소 소화를 시험한 결과이다(ig-h3 : 항 ig-h3로 측정된 펩타이드의 양; Histidine : 항 histidine으로 측정된 펩타이드의 양; MMP-1 : MMP-1의 양; no treatment : MFK24를 처리하지 않은 경우; MFK24 3 hours : MFK24를 처리 3시간 후 측정한 것; MFK24 6 hours : MFK24를 처리 6시간 후 측정한 것; purified MFK24 : 정제된 MFK24를 대상으로 항 ig-h3, 항 histidine을 처리하여 측정한 것).
도 14는 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 MFK23에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도).
도 15는 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 MFK24에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다. 도 15C는 MFK24와 dhFas-1펩타이드, RGDSP펩타이드 및 dhFas-1펩타이드와 RGDSP펩타이드의 혼합 조성물의 NIH3T3 세포주 부착 억제 정도를 비교 실험한 결과 그래프 이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도, MFK24 : 첨가된 MFK24의 농도, dhfas-1 : 첨가된 dhfas-1의 농도, RGDSP : 첨가된 아미노산 서열 RGDSP로 구성된 펩타이드의 농도).
도 16은 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착(A) 및 이동(B)이 MFK25에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다(Adhesion(%) : 세포부착율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 부착율), Migration(%) : 세포이동율(대조군을 100%로 했을 때 상대적 이동율), Concentration(uM) : 첨가된 펩타이드의 농도).
도 17은 생쥐 CIA 모델에서 MFK23에 의한 관절염 억제 효과를 임상관절염지수로 측정한 결과(A)와 대상 생쥐의 체중을 측정한 결과(B)이다(Clinical Arthritis Index : 임상적 관절염 지수; Days : 관절염 유도를 위한 콜라겐 주사 투여 후 경과 일 수; Control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; MFK23 1mg/kg, MFK23 10mg/kg, MFK23 30mg/kg : 매일 1mg/kg체중, 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 MFK23을 투여한 군; weight(g) : 체중(g); before : 펩타이드 투여 전(22일째); after : 펩타이드 투여 후(48일째)).
도 18은 MFK23을 처리한 CIA 생쥐 모델의 활막조직에 HE염색을 수행하여 관찰한 결과이다(control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 1mg/kg, 10mg/kg, 30mg/kg : 매일 1mg/kg체중, 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 MFK23을 투여한 군; H&E : 헤마톡실린, 에오신 염색 결과 사진; CD31 : endothelial cell marker인 항CD31항체를 이용한 면역조직화학검사 결과 사진; ICAM-1 : 항 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)항체를 이용한 면역조직화학검사 결과 사진).
도 19는 생쥐 CIA 모델에서 MFK24에 의한 관절염 억제 효과를 임상관절염지수로 측정한 결과(A)와 대상 생쥐의 체중을 측정한 결과(B)이다(Clinical Arthritis Index : 임상적 관절염 지수; Days : 관절염 유도를 위한 콜라겐 주사 투여 후 경과 일 수; Control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; MFK24 0.1mg/kg, MFK24 1mg/kg, MFK24 10mg/kg, MFK24 30mg/kg : 매일 0.1mg/kg체중, 1mg/kg체중, 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 MFK24를 투여한 군; weight(g) : 체중(g); before : 펩타이드 투여 전(22일째); after : 펩타이드 투여 후(48일째)).
도 20은 MFK24를 처리한 CIA 생쥐 모델의 활막조직에 HE염색을 수행하여 관찰한 결과이다(control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 0.1mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg : 매일 0.1mg/kg체중, 1mg/kg체중 및 10mg/kg체중의 양으로 MFK24를 투여한 군; H&E : 헤마톡실린, 에오신 염색 결과 사진).
도 21은 MFK24를 처리한 CIA 생쥐 모델 관절 조직에서 염증 매개 물질의 전사체 수를 측정한 값이다(control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 1mg/kg, 10mg/kg, 30mg/kg : 매일 1mg/kg체중, 10mg/kg체중 및 30mg/kg체중의 양으로 MFK24를 투여한 군; TNF-α: 종양괴사인자알파; RANKL: Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand; IL-1β: 인터류킨1베타; CCL-2: 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2; MMP-1: 메트릭스 메탈로프로티나아제-1; MMP-3: 메트릭스 메탈로프로티나아제-3; IL-6: 인터류킨6; VCAM-1: 도관세포 접착 분자-1).
도 22는 MFK24를 처리한 CIA 생쥐 모델에서 ICAM-1과 RANKL의 발현이 처리한 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 면역블롯 결과이다(normal: 관절염 유도를 하지 아니한 군; control: 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 1mg/kg, 10mg/kg, 30mg/kg: 매일 1mg/kg체중, 10mg/kg체중 및 30mg/kg체중의 양으로 MFK24를 투여한 군; RANKL: Receptor Activator for Nuclear Factor B Ligand; ICAM-1: 세포간 접착분자-1; GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
도 23은 생쥐 CIA 모델에서 mdhFas-1에 의한 관절염 억제 효과를 임상관절염지수로 측정한 결과(A)와 대상 생쥐의 체중을 측정한 결과(B)이다(Clinical Arthritis Index : 임상적 관절염 지수; Days : 관절염 유도를 위한 콜라겐 주사 투여 후 경과 일 수; Control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; mdhfas-1 10mg/kg, mdhfas-1 30mg/kg : 매일 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 mdhfas-1을 투여한 군; weight(g) : 체중(g); before : 펩타이드 투여 전(22일째); after : 펩타이드 투여 후(48일째)).
도 24는 생쥐 CIA 모델에서 MFK12에 의한 관절염 억제 효과를 임상관절염지수로 측정한 결과(A)와 대상 생쥐의 체중을 측정한 결과(B)이다(Clinical Arthritis Index: 임상적 관절염 지수; Days: 관절염 유도를 위한 콜라겐 주사 투여 후 경과 일 수; Control: 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; MFK12 10mg/kg, MFK12 30mg/kg: 매일 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 MFK12를 투여한 군; weight(g): 체중(g); before: 펩타이드 투여 전(22일째); after: 펩타이드 투여 후(48일째)).
도 25는 MFK12를 처리한 CIA 생쥐 모델의 활막조직에 HE염색을 수행하여 관찰한 결과이다(Control: 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 10mg/kg, 30mg/kg: 매일 10mg/kg체중, 30mg/kg체중의 양으로 MFK12를 투여한 군; H&E: 헤마톡실린, 에오신 염색 결과 사진; CD31: endothelial cell marker인 항CD31항체를 이용한 면역조직화학검사 결과 사진; ICAM-1: 항 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)항체를 이용한 면역조직화학검사 결과 사진).
도 26은 MFK12를 처리한 CIA 생쥐 모델 관절 조직에서 염증 매개 물질의 전사체 수를 측정한 값이다(control : 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 10mg/kg, 30mg/kg : 매일 10mg/kg체중 및 30mg/kg체중의 양으로 MFK12를 투여한 군; TNF-α: 종양괴사인자알파; RANKL: Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand; IL-1β: 인터류킨1베타; CCL-2: 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2; MMP-1: 메트릭스 메탈로프로티나아제-1; MMP-3: 메트릭스 메탈로프로티나아제-3; IL-6: 인터류킨6; VCAM-1: 도관세포 접착 분자-1).
도 27은 MFK12를 처리한 CIA 생쥐 모델에서 ICAM-1과 RANKL의 발현이 처리한 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 면역블롯 결과이다(normal: 관절염 유도를 하지 아니한 군; control: 펩타이드 대신 PBS를 투여한 대조군; 10mg/kg, 30mg/kg: 매일 10mg/kg체중 및 30mg/kg체중의 양으로 MFK12를 투여한 군; RANKL: Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand; ICAM-1: 세포간 접착분자-1; GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
도 28은 mdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 3 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드인 MFK27의 sequence와 MFK27 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 29는 hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP1 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드인 hsFJ24의 sequence와 hsFJ24 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 30은 hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP consensus 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드인 hsFJ25의 sequence와 hsFJ25 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 31은 hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 3 기질 펩타이드를 결합시킨 펩타이드인 hsFJ27의 sequence와 hsFJ27 재조합 펩타이드가 발현된 것을 보여주는 면역블롯 결과이다.
도 32는 βig-h3이 매개된 NIH3T3 세포주의 부착이 MFK27에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다.
도 33는 βig-h3이 매개된 인간 활막 세포주의 부착이 HsFJ24에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다.
도 34는 βig-h3이 매개된 인간 활막 세포주의 부착이 HsFJ25에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다.
도 35는 βig-h3이 매개된 인간 활막 세포주의 부착이 HsFJ27에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 보여주는 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<비교예 1>
dhFas-1 펩타이드를 이용한 세포의 부착 및 이주에 미치는 영향 조사
인간 βig-h3의 fas-1 domain의 구조 변형 펩타이드를 재조합 펩타이드로 합성하였다(이하hsdhFas-1 펩타이드라 함)([도 1] 참조).
96웰 플레이트에 인간 βig-h3을 5ug/ml의 농도로 넣어 4℃에서 14시간동안 코팅하였다. DMEM+0.5%BSA(Bovine Serum Albumin) 배지에 인간 섬유아세포(NIH3T3)를 넣고 hsdhFas-1 펩타이드를 농도별로 투여하여 섞은 후 37℃에서 30분간 배양한 후 코팅된 웰에 분주하였다. 이를 2시간 동안 배양한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 세포내 β-N-아세틸글루코사미니데이즈(β-N-acetylglucosaminidase)에 의하여 활성화되는 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, Sigma, 미국)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 글리신 EDTA 용액(0.5M EDTA, 50mM glycine, pH 10.4)을 첨가하고, 부착된 세포수에 따라 발색되는 정도를 흡광도로 측정하였다.
hsdhFas-1 펩타이드의 활막세포의 부착과 이동 차단 효과를 검증한 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이, 인간활막세포에서는 농도-의존적으로 βig-h3-매개 부착을 차단하는 것을 확인하였다.
또한 마우스 βig-h3의 fas-1 domain의 구조 변형 펩타이드를 재조합 펩타이드로 합성하여(이하 'mdhFas-1펩타이드'라 함, [도 2] 참조), 마우스 세포주인 NIH3T3 세포주를 이용하여 동일한 방법으로 mdhFas-1 펩타이드의 활막세포 부착과 이동 차단 효과를 시험하였다.
그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, mdhFas-1도 hsdhFas-1과 같이 농도-의존적으로 ig-h3-매개 부착 및 이주를 차단하는 것을 확인하였다.
<비교예 2>
MFK12 펩타이드를 이용한 세포의 부착 및 이주에 미치는 영향 조사
마우스 CIA 모델에서 mdhFas-1 치료시 농도 의존적으로 관절염 활성을 억제한다는 결과를 바탕으로 저용량 투여시 높은 치료 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드를 디자인 하기위해, mdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 RGDSP 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 제작하였다(이하 'MFK12 펩타이드'라 함)([도 5] 참조).
mdhFas-1-RGD 구조 펩타이드를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLyss 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 mdhFas-1-RGD 구조 펩타이드를 발현시켰다.
생쥐 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : mdhFas-1)를 암호화는 유전자를 생쥐 βig-h3(NM_009369)을 주형으로 하고, 프라이머 (forward 5'-TATCATATGCAAGCCATGCC-3', reverse 5'-TCACCGAATTCCATGATGTC-3')를 이용해서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 EcoR I 을 이용하여 클로닝한 후 RGDSP 펩타이드 역시 프라이머 (forward 5'-AATTCGGAGGACGAGGAGATTCACCCGATGATGATGATGATC-3', reverse 5'-TCGAGATCATCATCATCATCGGGTGAATCTCCTCGTCCTCCG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 dhFas-1-sequence가 삽입된 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 EcoR I 과 Xho I에 삽입하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다.
벡터 제작용 프라이머
프라이머 이름 서열번호 염기서열(5'-3')
mdhFas-1-forward 27 TATCATATGCAAGCCATGCC
mdhFas-1-reverse 28 TCACCGAATTCCATGATGTC
RGDSP-forward 29 AATTCGGAGGACGAGGAGATTCACCCGATGATGATGATGATC
RGDSP-reverse 30 TCGAGATCATCATCATCATCGGGTGAATCTCCTCGTCCTCCG
마우스 섬유아세포인 NIH3T3 세포에 MFK12 펩타이드를 이용하여 <비교예 1>에서와 동일한 방법으로 세포 부착 및 이주 실험을 수행하였다.
그 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, MFK12의 경우 <비교예 1>의 경우에 비하여 낮은 농도에서도 세포 이주 및 부착을 억제하는 것을 확인하였다.
<실시예 1>
dhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드의 제작 및 분리
<1-1> mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드의 제작 및 분리 I
mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLyss 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 발현시켰다. mdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP2 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'MFK23 펩타이드'라 하고([도 7] 참조), MMP1 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'MFK24 펩타이드'라 하고([도 8] 참조), mdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 공통(consensus) 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'MFK25 펩타이드'라 하였다([도 9] 참조).
생쥐 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(mdhFas-1)를 암호화는 유전자를 생쥐 βig-h3(NM_009369)을 주형으로 하고, 프라이머 (forward 5'-tatcatatgcaagccatgcc-3', reverse 5'-tcaccgaattccatgatgtc-3')를 이용해서 PCR로 증폭하였다.
증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 EcoR I 을 이용하여 클로닝한 후 MMP 기질 sequence용 프라이머(MMP1 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG -3', reverse 5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3', MMP2 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACTGGGAGTCCGAGGAG-3', reverse 5'-TCGACTCCTCGGACTCCCAGTGGTCCG-3', 공통(consensus) 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG -3', reverse 5'-TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 dhFas-1이 들어간 pET29b 발현 벡터의 제한 효소 EcoR I 과 Sal I에 삽입 시켰다.
QERGDSLA 펩타이드 역시 프라이머 (forward 5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3', reverse 5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 dhFas-1-MMP 기질 sequence가 삽입된 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Sal I 과 Xho I에 삽입하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다.
벡터 제작용 프라이머
프라이머 이름 서열번호 염기서열(5'-3')
mdhFas-1-forward 27 tatcatatgcaagccatgcc
mdhFas-1-reverse 28 tcaccgaattccatgatgtc
MMP1 기질-forward 31 AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG
MMP1 기질-reverse 32 TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG
MMP2 기질-forward 33 AATTCGGACCACTGGGAGTCCGAGGAG
MMP2 기질-reverse 34 TCGACTCCTCGGACTCCCAGTGGTCCG
MMP consensus 기질-forward 35 AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG
MMP consensus 기질-reverse 36 TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG
QERGDSLA-forward 37 TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC
QERGDSLA-reverse 38 TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG
<1-2> mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드의 제작 및 분리 II
mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLyss 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 발현시켰다. mdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 3 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'MFK27 펩타이드'라 하였다([도 28] 참조).
mdhFas-1-MMP3 기질-RGD 구조 펩타이드의 대장균에서의 발현을 향상시키기 위해 생쥐 ig-h3의 signal peptide sequence를 생쥐 ig-h3(NM_009369)를 주형으로 프라이머 (forward 5'-AGTACATATGATGGCGCTCCT-3', reverse 5'-AGTACATATGATGGCGCTCCT-3')를 이용하여 PCR로 증폭하고, 증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 Bgl II 를 이용하여 클로닝하였다.
네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : mdhFas-1)를 암호화는 유전자를 생쥐 βig-h3(NM_009369)을 주형으로 프라이머 (forward 5'-ACAGATCTCAAGCCATGCCT-3', reverse 5'-ACGAATTCCATGATGTCGGT-3')를 이용하여 PCR로 증폭하고, 증폭된 산물을 상기 signal peptide sequence가 들어간 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Bgl II 과 EcoR I 를 이용하여 클로닝하였다.
MMP3 기질용 프라이머 (forward 5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3', reverse 5'-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 상기 signal peptide sequence 및 dhFas-1이 들어간 pET29b 발현 벡터의 제한 효소 EcoR I 과 Sal I에 삽입 시켰다.
QERGDSLA 펩타이드 역시 프라이머 (forward 5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3', reverse 5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 상기 signal peptide sequence, dhFas-1 및 MMP3 기질 sequence가 삽입된 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Sal I 과 Xho I에 삽입하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다.
벡터 제작용 프라이머
프라이머 이름 서열번호 염기서열(5'-3')
mouse signal peptide-forward 39 AGTACATATGATGGCGCTCCT
mouse signal peptide-reverse 40 AGTAGATCTCTGCAAGGGTCCC
mdhFas-1-forward 41 ACAGATCTCAAGCCATGCCT
mdhFas-1-reverse 42 ACGAATTCCATGATGTCGGT
MMP3 기질-forward 43 AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG
MMP3 기질-reverse 44 TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG
QERGDSLA-forward 37 TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC
QERGDSLA-reverse 38 TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG
<1-3> hsdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드의 제작 및 분리 I
hsdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLyss 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 hsdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 발현시켰다. hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP1 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'hsFJ24 펩타이드라 하고([도 29] 참조), hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 공통(consensus) 기질 펩타이드 및 QERGDSLA 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'hsFJ25 펩타이드라 하였다([도 30] 참조).
인간 βig-h3의 네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : hsdhFas-1)를 암호화는 유전자를 인간 βig-h3(M77349)을 주형으로 하고, 프라이머 (forward 5'-TATATCATATGCGAGCCCTG-3', reverse 5'-TATATCATATGCGAGCCCTG-3')를 이용해서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 EcoR I 를 이용하여 클로닝한 후 MMP 기질 sequence용 프라이머(MMP1 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG -3', reverse 5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3', MMP3 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3', reverse 5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3', consensus 기질용 프라이머 forward 5'-AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG -3', reverse 5'-TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 dhFas-1이 들어간 pET29b 발현 벡터의 제한 효소 EcoR I 과 Sal I에 삽입 시켰다.
QERGDSLA 펩타이드 역시 프라이머 (forward 5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3', reverse 5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 dhFas-1-MMP 기질 sequence가 삽입된 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Sal I 과 Xho I에 삽입하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다.
β벡터 제작용 프라이머
프라이머 이름 서열번호 염기서열(5'-3')
hsdhFas-1-forward 45 TATATCATATGCGAGCCCTG
hsdhFas-1-reverse 46 TATATCATATGCGAGCCCTG
MMP1 기질-forward 31 AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG
MMP1 기질-reverse 32 TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG
MMP consensus 기질-forward 35 AATTCGGACCACTGGGAATAGCAGGAG
MMP consensus 기질-reverse 36 TCGACTCCTGCTATTCCCAGTGGTCCG
QERGDSLA-forward 37 TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC
QERGDSLA-reverse 38 TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG
<1-4> hsdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 제작 및 분리 II
hsdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 pET29b 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLyss 또는 Rosetta(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 배양하여 hsdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 발현시켰다. hsdhFas-1을 기본 구조로 한 펩타이드에 MMP 3 기질 펩타이드를 결합시킨 펩타이드를 'hsFJ27 펩타이드라 하였다([도 31] 참조).
hsdhFas-1-MMP3 기질-RGD 구조 펩타이드의 대장균에서의 발현을 향상시키기 위해 인간 βig-h3의 signal peptide sequence를 인간 βig-h3(M77349)을 주형으로 프라이머 (forward 5'-ATGCATATGATGGCGCTCTTC-3', reverse 5'-AAATAGATCTCGCCAGGGTCGC-3')를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물을 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Nde I 과 Bgl II 를 이용하여 클로닝하였다.
네번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 펩타이드(명칭 : hsdhFas-1)를 암호화는 유전자를 인간 ig-h3(M77349)을 주형으로 하고, 프라이머 (forward 5-AAGATCTTTCCGAGCCCTG-3, reverse 5-ACCGAATTCCATGATGTCAGG-3)를 이용해서 PCR로 증폭하고, 증폭된 산물을 상기 signal peptide sequence가 들어간 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Bgl II 과 EcoR I 를 이용하여 클로닝하였다.
MMP3 기질용 프라이머 (forward 5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3', reverse 5'-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 상기 signal peptide sequence 및 dhFas-1이 들어간 pET 29b 발현 벡터의 제한 효소 EcoR I 과 Sal I에 삽입 시켰다.
QERGDSLA 펩타이드 역시 프라이머 (forward 5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3', reverse 5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')를 주형으로 상보결합 시킨 후 상기 signal peptide sequence 및 dhFas-1 및 MMP-3 기질 sequence가 삽입된 pET 29b 발현 벡터에 제한 효소 Sal I 과 Xho I에 삽입하고, 이를 E. coli BL21DE에 형질 전환시켰다.
벡터 제작용 프라이머
프라이머 이름 서열번호 염기서열(5'-3')
human signal peptide-forward 47 ATGCATATGATGGCGCTCTTC
human signal peptide-reverse 48 AGTAGATCTCTGCAAGGGTCCC
hsdhFas-1-forward 49 AAGATCTTTCCGAGCCCTG
hsdhFas-1-reverse 50 ACCGAATTCCATGATGTCAGG
MMP3 기질-forward 43 AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG
MMP3 기질-reverse 44 TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG
QERGDSLA-forward 37 TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC
QERGDSLA-reverse 38 TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG
dhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드
이 름 구 조 특 징
MFK23 mdhFas-1 - GPLGVRG - QERGDSLA MMP2 기질 sequence 삽입
MFK24 mdhFas-1 - GPQGIAG - QERGDSLA MMP1 기질 sequence 삽입
MFK25 mdhFas-1 - GPLGIAG - QERGDSLA consensus 기질 sequence 삽입
MFK27 mdhFas-1 - GPLGLWARG - QERGDSLA MMP3 기질 sequence 삽입
hsFJ24 hsdhFas-1 - GPQGIAG - QERGDSLA MMP1 기질 sequence 삽입
hsFJ25 hsdhFas-1 - GPLGIAG - QERGDSLA consensus 기질 sequence 삽입
hsFJ27 hsdhFas-1 - GPLGLWARG - QERGDSLA MMP3 기질 sequence 삽입
<1-5> dhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 분리, 확인
상기 실시예 <1-1> 내지 <1-4>에서 형질전환된 균주를 배양하여 dhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 과발현시킨 후 분리, 확인하였다.
과발현시킨 배양액을 4℃, 2000g에서 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포만 모았다. 100ml 배양액당 4ml 용해 버퍼(lysis buffer; 50mM Tris-Cl(pH8.0), 500mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM DTT, 1% Triton X-114)를 세포 펠렛에 넣고 풀어 준 후, 초음파로 세포를 분쇄시켰다. 분쇄된 세포를 4, 13000rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 50ml 튜브로 옮겼다. Ni-NTA 아가로스 비드(Ni-NTA Agarose bead, QIAGEN)를 잘 섞어 3ml을 tube에 옮긴 후, 부착 버퍼(binding buffer; 50mM Tris-Cl(pH8.0), 500mM NaCl, 5mM Imidazole(pH 7.8))로 두 번 세척하였다. 세척된 50% 현탁액 상태의 Ni-NTA 아가로스 비드에 상층액을 넣고 4℃에서 교반기(agitator)로 2시간 동안 결합시킨 후 컬럼에 옮긴 후 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 비드를 10배 부피의 세척 버퍼(washing buffer; 50mM Tris-Cl(pH8.0), 500mM NaCl, 20mM Imidazole(pH 7.8), 0.1% Triton X-114)를 넣고 씻어주어 비특이적으로 결합한 단백질을 제거시켰다. 용출 버퍼(elution buffer; 50mM Tris-Cl(pH8.0), 500mM NaCl, 300mM Imidazole(pH 7.8))로 본 발명의 펩타이드를 추출하였다. 생산된 재조합 단백질에서 LPS(Lipopolysaccharide)는 생쥐당 1 EU이하로 유지하기 위해 Triton X-114를 이용하여 LPS를 제거하였으며 분리된 펩타이드에서 LPS 제거용 칼럼(Cambrex, Germany)을 이용하여 한 번 더 제거하였다.
그 결과 [도 7] 내지 [도 9], [도 28] 내지 [도 31]에서 보는 바와 같이 MFK23, MFK24, MFK25, MFK27, HsFJ24, HsFJ25 및 HsFJ27가 과발현되고 정제과정을 통하여 분리되었음을 확인하였다.
< 실시예 2>
mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 효소 소화 시험
MFK23, MFK24 및 MFK25가 특정 MMP들에 의하여 잘려지는지 확인하기 위하여 효소분석과 배양분석을 실시하였다.
<2-1> mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 효소 소화 시험
합성된 mdhFas-1-MMP기질 구조 변형 단백질 3ug를 MMP1(5ng, 10ng 및 50ng), MMP2(100ng, 200ng 및 800ng), MMP3(10ng, 50ng 및 100ng), cathepsin D(5ng, 10ng 및 50ng), cathepsin L(100ng, 200ng 및 800ng), cathepsin K(10ng, 50ng 및 100ng)와 함께 enzyme buffer(150mM NaCl, 5mM CaCl2, 20mM Tris-HCl pH7.5) 섞어 37℃ 에 4시간동안 반응 시켰다. 15% polyacrylamide gel에서 전기영동한 다음 Nitrocellulose Membrane (Schleicher & Schuell)으로 옮겨 3% BSA가 함유된 TBST 용액(20 mmole/L Tris-HCl, 137 mmole//l NaCl, 0.1% Tween-20)으로 상온에서 1시간 blocking을 한 다음 TBST 용액으로 10분씩 3회 씻어낸 후, 1시간 동안 primary antibody(anti-Histidine 또는 anti-Bigh3)와 반응시켰다. TBST 용액으로 10분씩 3회 씻어낸 후 horseradish peroxidase(HRP)가 붙은 secondary antibody와 1시간 동안 반응시키고 TBST 용액으로 10분씩 3회 씻어낸 후 ECL (Amersham Biosciences, UK)로 발색하여 mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드 양의 변화를 확인하였다.
그 결과 [도 10]에서 보는 바와 같이 MFK23은 MMP-2 효소 처리 후 농도 의존적으로 잘려지는 것을 확인하였고, MMP-1이나 MMP-3 같은 다른 종류의 MMP 처리시에는 잘려지지 않는 것을 확인하였다. 또한 cysteine protease인 카텝신 K, L 및 D 처리시에도 잘려지지 않는 것을 확인하였다.
MFK24의 경우 [도 11]에서 보는 바와 같이 MMP-1 효소 처리 후 농도 의존적으로 잘려지는 것을 확인하였고, MMP-2나 MMP-3 같은 다른 종류의 MMP 효소 또는 카텝신 K, L 및 D 처리시에는 잘려지지 않는 것을 확인하였다.
MFK25의 경우 [도 12]에서 보는 바와 같이 MMP-1, MMP-2 및 MMP-3 처리시 모두 농도 의존적으로 잘려지는 것을 확인하였다. 특히 MMP-1과 MMP-3에 의하여 잘 잘려지는 것을 확인하였다. 그러나 시스테인 단백질 분해효소인 카텝신 K, L 및 D 처리시에는 잘려지지 않는 것을 확인하였다.
<2-2> mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 효소 소화 배양분석
MFK24가 세포에 부착하면서 실제 MMP-1에 의하여 절단되는지 확인하기 위해 인간 RA-FLS(류머티스 관절염이 있는 관절에서 유래한 활막세포)에 IL-1β를 처리하여 MMP-1의 발현을 증폭시킨 후 MFK24를 배지에 첨가하여 배양하였다.
DMEM+10% FBS (fetal bovine serum) +2% penicillin, streptomycin 배지에 인간 활막세포주를 이틀 동안 키운 후 0.1ng/ml IL-1β를 첨가하여 24시간 자극 시킨다. mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드를 1uM로 처리하여 3시간, 6시간 자극 후 mdhfas-1을 인식하는 항 βig-h3항체와 C말단의 histidine-tag을 인식하는 항 histidine 항체를 이용하여 펩타이드의 양을 확인하였다.
그 결과 [도 13]에서 보는 바와 같이 항 히스티딘 항체를 이용한 경우가 항 βig-h3 항체를 이용한 경우보다 MFK24의 양이 적게 확인되었다. 따라서 MFK24가 활막세포에서 분비된 MMP-1에 의하여 절단되는 것을 확인하였다.
< 실시예 3>
mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 세포주 기능 조절 시험
<3-1> 세포 부착 시험
96웰 플레이트에 βig-h3을 5ug/ml의 농도로 넣어 4에서 14시간 동안 코팅하였다. DMEM+0.5%BSA(Bovine Serum Albumin) 배지에 마우스 섬유아세포(NIH3T3)를 넣고 MFK23, MFK24, MFK25 또는 MFK27를 농도별로 투여하여 섞은 후 37에서 30분간 배양한 후 코팅된 웰에 분주하였다. 이를 2시간 동안 배양한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 세포내 β-N-아세틸글루코사미니데이즈(β-N-acetylglucosaminidase)에 의하여 활성화되는 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, Sigma, 미국)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 글리신 EDTA 용액(0.5M EDTA, 50mM glycine, pH 10.4)을 첨가하고, 부착된 세포수에 따라 발색되는 정도를 흡광도로 측정하였다.
그 결과 [도 14 A], [도 15 A], [도 16 A] 및 [도 32]에서 보는 바와 같이, MFK23, MFK24, MFK25와 MFK27는 낮은 농도에서도 세포 부착을 억제하는 것을 확인하였다. 특히, MFK24의 경우에는 YH18 모티프 또는 mdhFas-1을 단독으로 처리하거나 이를 동시에 처리하는 경우에 비하여 아주 낮은 농도에서도 세포 부착을 억제하는 것을 확인하였다.
mdhFas-1과 RGDSP(아미노산 서열 RGDSP로 구성된 펩타이드)를 각각 혹은 혼합하여 동일한 세포부착시험을 실시하여 MFK24와 그 결과를 비교하였다.
그 결과 [도 15 C]에서 보는 바와 같이 MFK24는 0.5uM 농도에서 80% 이상의 높은 부착 억제 효과를 보인데 비하여 mdhFas-1은 동일 농도에서 50%, RGDSP는 0%의 부착 억제 효과를 나타내었고 이를 동시에 처리한 경우에도 50%정도의 부착 억제 효과를 나타내어 MFK24가 mdhFas-1과 RGDSP에 비하여 효과적으로 세포부착을 억제함을 확인하였다.
이로서 mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드는 mdhFas-1, RGDSP, YH18 모티프에 비하여 류마티스 관절염에 대한 효과가 월등히 우수함을 확인하였다.
<3-2> 세포 이주 시험
세포가 이동 할 수 있는 크기인 8um의 구멍을 가진 트랜스웰(transwell)의 필터 하면에 βig-h3을 4℃에서 12시간 내지 14시간 배양하여 코팅하였다. DMEM+0.5%BSA 배지에 NIH3T3을 넣고 MFK23, MFK24 또는 MFK25를 농도별로 투여하여 섞은 후 37℃에서 30분간 배양한 후 코팅된 웰의 상위 챔버(upper chamber)에 접종하고 7시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 필터 하면으로 이동한 세포를 고정한 후 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 이동한 세포를 염색하였다. 멸균된 면봉으로 이동하지 않고 상위 챔버에 남은 세포를 닦아내고 하면으로 이동한 세포수를 현미경으로 계수하였다.
그 결과 [도 14 B], [도 15 B] 및 [도 16 B]에서 보는 바와 같이, MFK23, MFK24와 MFK25는 낮은 농도에서도 세포 이주를 억제하는 것을 확인하였다.
< 실시예 4>
hsdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 세포주 기능 조절 시험
<4-1> 세포 부착 시험
96웰 플레이트에 βig-h3을 5ug/ml의 농도로 넣어 4에서 14시간 동안 코팅하였다. DMEM+0.5%BSA(Bovine Serum Albumin) 배지에 인간 활막 세포(FLS)를 넣고 HsFJ24, HsFJ25 또는 HsFJ27를 농도별로 투여하여 섞은 후 37℃에서 30분간 배양한 후 코팅된 웰에 분주하였다. 이를 2시간 동안 배양한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 세포내 β-N-아세틸글루코사미니데이즈(β-N-acetylglucosaminidase)에 의하여 활성화되는 기질(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, Sigma, 미국)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 글리신 EDTA 용액(0.5M EDTA, 50mM glycine, pH 10.4)을 첨가하고, 부착된 세포수에 따라 발색되는 정도를 흡광도로 측정하였다.
그 결과 [도 33], [도 34] 및 [도 35]에서 보는 바와 같이, HsFJ24, HsFJ25 또는 HsFJ27의 경우 농도 의존적으로 세포 부착을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
< 실시예 5>
mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 관절염 치료 효과 확인
<5-1> 콜라겐 유도 관절염( Collagen - induced arthritis , CIA ) 생쥐 모델의 제작
사람의 류마티스 관절염과 매우 유사한 특징을 가지고 있는 CIA 생쥐 모델은 공지된 문헌(Protocol for the successful induction of collagen-induced arthritis(CIA) and collagen antibody-induced arthritis(CAIA) in mice. Chondrex, Redmond, WA)에 기재된 바에 따라 다음과 같이 제작되었다: 우형(bovine) 제2형 콜라겐 100ug을 완전 프로인드 보조제(Freund's complete adjuvant)와 섞어 생쥐의 꼬리에 피하 접종한 후 3주후에 우형 제2형 콜라겐 100ug을 불완전 프로인드 보조제(Freund's incomplete adjuvant)와 섞어 생쥐의 꼬리에 재접종하여 제작하고 실험에 사용하였다.
<5-2> mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드를 이용한 CIA 생쥐의 관절염 치료 효과 시험
CIA 생쥐를 이용하여 MFK23, MFK24의 관절염 치료 효과를 시험하였다.
CIA 모델에서 관절염의 치료효과를 규명하기 위하여 우형 제2형 콜라겐을 두 번째 주사한 후 관절염이 발생하는 시점(23일째)부터 4주일간 매일 MFK23 또는MFK24를 0.1mg/kg, 1mg/kg체중, 10mg/kg체중 또는 30mg/kg체중의 양으로 복강내에 각각 주사하였다. 대조군으로는 동일량의 PBS를 복강 투여 하였다. 23일째부터 50일째까지 매일 임상적 관절염 지수(Clinical arthritis index)를 사용하여 관절염의 중증도를 판정하였다. 판정기준은 다음과 같다.
0; 증상 없음, 1; 한 개 관절의 부종 및 가벼운 edema, 2; 2개 이상의 관절의 중증도 부종, 3; 대부분 관절의 심한 부종, 4; 다리 전체의 심한 부종.
그 결과 [도 17]에서 보는 바와 같이 MFK23의 경우 관절염 억제효과가 우수한 것으로 확인되었다. 또한 MFK24의 경우 [도 19]에서 보는 바와 같이 0.1mg/kg체중을 투여한 경우에도 70% 가량 관절염을 억제하는 것을 확인하였다. MFK24는 낮은 농도에서도 우수한 효과를 나타내어 관절염 억제 효과가 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
<5-3> CIA 생쥐모델에서 mdhFas -1- MMP 기질- RGD 구조 펩타이드의 독성 검증
mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드가 독성을 보이는지 여부를 알아보기 위하여 상기 CIA 모델에서의 투여 전(22일째)과 투여 후(48일째) 생쥐의 체중을 측정하고, 48일째에 혈청과 혈액검사를 실시하였다.
그 결과 [표 7]에서 보는 바와 같이, MFK24의 경우 대조군과 비교시, 적혈구, 백혈구 및 혈소판 수치가 유의 효과가 없었으며, 간기능 수치인 AST, ALT에서 이상이 없고 빌리루빈 및 크레아틴 역시 차이가 없는 것을 확인하였다.
또한 체중변화는 MFK24는 대조군과 비슷한 체중을 유지하였다([도 19B]참조). 치료기간동안 죽은 생쥐는 없었고, 혈청 및 혈액 검사와 체중 비교를 종합해 보면 MFK24는 치료시 독성 및 위험성이 적은 것을 확인되었다. MFK23도 대조군과 비슷한 체중을 유지하고, 치료기간동안 죽은 생쥐가 없었다. 따라서 본 발명의 MFK24와 MFK23은 치료시 독성이 없다는 것을 확인하였다.
CIA 모델에서 4주간 MFK24 펩타이드를 처리한 후의 혈액검사 결과
Animal ID RBC
(X106/ul)		 WBC
(X103/ul)		 PLT
(X103/ul)		 AST
(U/L)		 ALT
(U/L)		 BUN
(mg/dL)		 Crea
(mg/dL)
control 11.4± 0.8 6.7± 3.0 1062.6± 261 272.8± 36 62.9± 11.9 22.7± 0.0 0.45± 0.00
0.1mg/kg 12.3± 0.7 5.0± 1.2 1280.2± 284 224.3± 13 37.8± 7.1 19.0± 3.3 0.54± 0.10
1mg/kg 10.9± 1.7 3.7± 0.5 1155.3± 184 270.5± 17 40.6± 7.2 21.2± 3.4 0.54± 0.14
10mg/kg 11.4± 1.5 5.0± 1.8 1050.1±359 222.0± 25 43.6± 14.2 20.4± 4.4 0.54± 0.11
30mg/kg 12.4± 0.1 6.1± 1.1 674.7± 111 286.6± 48 28.9± 8.2 12.4± 4.8 0.33± 0.02
<실시예 6>
mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드의 관절염 억제 기작의 확인
CIA 모델에서 관절염의 치료효과의 작용기전을 확인하기 위하여 우형 제2형 콜라겐을 두 번째 주사한 후 관절염이 발생하는 시점(23일째)부터 4주후인 50일째에 치료군들의 발 조직을 분리하여 조직학적 분석과 염증매개물질의 발현변화를 알아보았다.
<6-1> mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드 투여 생쥐의 발 조직의 조직학적 검사
MFK23과 MFK24 투여군에 대하여 HE염색을 실시하였다.
조직 표본은 다음과 같이 제작되었다. 발 조직의 피부를 제거하고 10% 포르말린 용액에 넣어 2일 동안 고정한 후 10% EDTA 용액에 넣어 탈회과정을 거쳤다. 탈회된 조직은 탈수과정과 투명화 과정을 거친 후 파라핀 포매하여 마이크로톰을 이용하여 3um두께의 절편으로 만들었다. 조직절편은 100% 자일렌(xylene)과 에탄올을 이용하여 탈파라핀화 및 재탈수화 시킨 후 100% 메탄올에 0.3% 과산화수소를 넣은 용액을 이용하여 비특이적인 조직내 퍼옥시다아제(peroxidase)를 차단하였다.
면역조직화학 검사를 위하여 5% BSA로 비특이적인 단백질의 결합을 차단한 후 각각의 일차항체(endothelial cell marker로서 CD31에 대한 항체와 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)에 대한 항체)와 4에서 12시간 내지 14시간동안 배양한 후 세척버퍼(washing buffer; 0.1% BSA, 0.2% gelatin, 0.05% saponin)로 세척하였다. 바이오틴(biotin)이 붙은 이차항체와 상온에서 30분간 배양한 후 세척하였으며 벡타스타틴 ABC 키트(Vectastatin ABC kit; Vector Laboratories, 미국)로 반응시킨 후 유키트 마운팅 미디어(Eukitt mounting media; Fluka, 독일)로 마운트 하여 관찰하였다.
MFK23과 MFK24의 경우 [도 18], [도 20]에서 보는 바와 같이 MFK23 및 MFK24를 처리한 군에서 활막세포의 증식이 억제되고 연골 및 뼈의 형태 파괴 정도가 감소하는 것을 확인하였다.
<6-2> mdhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드 투여 생쥐의 발 조직에서의 염증 매개물의 변화 확인
발조직의 염증분포는 부위에 따라 다소 다른 소견을 보일 수 있고 정량적인 연구가 어렵기 때문에 생쥐 CIA 모델에서 MFK24 처리 후 뒷발에서의 관절염 발생에 따른 염증매개물의 변화를 Taqman 탐침(probe)을 이용한 반정량적 역전사 PCR법으로 다음과 같이 측정하였다.
생쥐 CIA 모델에서 발조직을 얻은 후 피부를 제거하고 남은 조직은 모두 조직 호모지나이저(homogenizer)를 이용하여 갈아서 추출시약(Easy-spimTM, Intron)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이를 정량한 후 7의 RNA로 AMV 역전사효소(Roche, 0.5ul), 올리고 dT(Roche, 1ul), 10mM dNTP(Takara, 2ul) RNase 저해제(Roche, 0.1ul)를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다. 생쥐 TNF-, RANKL, IL-1, CCL-2, MMP-1, MMP-3, IL-6, VCAM-1 및 18S RNA의 반정량적인 PCR을 위한 프라이머(Bioneer, 대전)와 Taqman 탐침(Roche, Germany)을 사용하여 LC480(Roche, Germany)에서 전사체수를 구한 후 18S RNA 전사체에 비교하여 정량화 하였다. 상기 반정량적인 PCR을 위한 프라이머 쌍은 [표 8]과 같다.
PCR용 프라이머 쌍
프라이머이름 서열번호 염기서열(5'-3')
TNF-α-forward 51 ctgtagcccacgtcgtagc
TNF-α-reverse 52 ttgagatccatgccgttg
RANKL-forward 53 tgaagacacactacctgactcctg
RANKL-reverse 54 ccacaatgtgttgcagttcc
IL-1β-forward 55 tgtaatgaaagacggcacacc
IL-1β-reverse 56 tcttctttgggtattgcttgg
CCL-2-forward 57 catccacgtgttggctca
CCL-2-reverse 58 gatcatcttgctggtgaatgagt
MMP-1-forward 59 tgtgtttcacaacggagacc
MMP-1-reverse 60 gcccaagttgtagtagttttcca
MMP-3-forward 61 tgttctttgatgcagtcagc
MMP-3-reverse 62 gatttgcgccaaaagtgc
IL-6-forward 63 gagaaaagagttgtgcaatggc
IL-6-reverse 64 ccagtttggtagcatccatca
VCAM-1-forward 65 tggtgaaatggaatctgaacc
VCAM-1-reverse 66 cccagatggtggtttcctt
18S-forward 67 aaatcagttatggttcctttggtc
18S-reverse 68 gctctagaattaccacagttatccaa
MFK24의 경우 [도 21]에서 보는 바와 같이 염증매개물질의 전사체 수가 관절염 대조군에 비하여 유의적으로 감소하고 투여용량에 따라 ICAM-1과 RANKL의 염증부위 발현도 감소하는 것을 확인하였다. 특히 0.1mg/kg체중의 저용량 투여에서도 우수한 효능을 유지하는 것을 확인하였다([도 22] 참조).
<비교예 3>
mdhFas-1 펩타이드의 관절염 치료 효과 확인
<비교예 1>에서 제작한 mdhFas-1 펩타이드를 이용하여 <실시예 4>에서와 동일한 방법으로 CIA 생쥐 모델에서 관절염 치료 효과를 측정하였다.
그 결과 mdhFas-1 펩타이드를 이용한 경우 [도 23]에서 보는 바와 같이, 관절염은 농도 의존적으로 억제되었고 대조군 마우스와 비교시 체중변화에서도 다른 이상 소견이 보이지 않았다. 관절염 억제 정도는 10mg/kg을 처리한 경우 32% 정도, 30mg/kg을 처리한 경우 69% 정도 관절염을 억제하는 것을 확인하였다.
<비교예 4>
MFK12 펩타이드의 관절염 치료 효과 확인
<비교예 2>에서 제작한 MFK12 펩타이드를 이용하여 <실시예 4> 및 <실시예 5>에서와 동일한 방법으로 CIA 생쥐 모델에서 관절염 치료 효과를 측정하였다.
그 결과 MFK12 펩타이드를 이용한 경우 [도 24]에서 보는 바와 같이, 관절염은 농도 의존적으로 억제되었고 대조군 마우스와 비교시 체중변화에서도 다른 이상 소견이 보이지 않았다. 관절염 억제 정도는 10mg/kg을 처리한 경우 27% 정도, 30mg/kg을 처리한 경우 60%가량 관절염을 억제하는 것을 확인하였다.
또한 [도 25]에서 보는 바와 같이, 두 번째 면역화 조치이후 4주 후인 50일째에 10mg/kg을 처리한 군은 관절부위가 파괴되고 활막조직세포들이 과다증식이 되어있고 혈관신생과 세포부착단백질의 발현이 대조군만큼 증가되어 있는 것을 확인하였다. 반면 30mg/kg을 처리한 군에서 활막조직세포의 증식이 대조군에 비해 억제되고 혈관신생 및 부착단백질의 발현이 감소되어 정상에 가까운 발조직의 형태를 보여 MFK12는 30mg/kg을 처리하였을 때 치료효과가 있음을 확인하였다.
염증매개 물질 변화 측정 결과는 [도 26] 및 [도 27]에서 보는 바와 같이, TNF-α, IL-6, IL-1β, ICAM-1과 RANKL의 발현은 10mg/kg 처리한 것은 관절염 대조군과 비교하여 유사한 양으로 발현하고 있으나 30mg/kg 처리한 것은 관절염 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. ICAM-1과 RANKL의 발현은 10mg/kg 처리한 것은 관절염 대조군과 비교하여 유사한 양으로 발현하고 있으나 30mg/kg 처리한 것은 관절염 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 dhFas-1-MMP기질-RGD 구조 펩타이드는 염증성 질환, 특히 류마티스 관절염 부위의 활막세포의 부착 및 이동을 억제하여 류마티스 관절염의 확대를 막고 면역세포의 침윤을 억제시켜 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용되어 산업상 이용가능성이 크다.
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Claims (18)

  1. a) βig-h3의 네 번째 fas-1 도메인에서 H1 및 H2 부위를 제거한 dhFas-1 도메인; b) MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase) 기질; 및 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MMP기질은 MMP1 기질, MMP2 기질, MMP3 기질, MMP7 기질, , MMP8 기질, MMP9 기질, MMP12 기질, MMP13 기질 및 MMP 공통(consensus) 기질로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 a) dhFas-1 도메인과 상기 b) MMP기질 사이에 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커 펩타이드를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 b) MMP기질과 상기 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드 사이에 1 내지 5개의 아미노산으로 구성된 링커 펩타이드를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 a) dhFas-1 도메인은 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 b) MMP 기질은 서열번호 5 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 c) RGD 모티프를 포함하는 펩타이드은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 11 내지 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  9. 제4항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 LE 또는 EF인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  10. 제3항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 VD 또는 VDG인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항의 융합 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18 내지 24의 서열로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  16. 제13항의 벡터를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 거대 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 다중심성 세망조직구종, 혈색소병증, 가족성 지중해열, 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 거대 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 다중심성 세망조직구종, 혈색소병증, 가족성 지중해열, 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
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