CN103356745B

CN103356745B - 一种用于肿瘤的中药混合制剂

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Publication number: CN103356745B
Application number: CN201310244715.7A
Authority: CN
Inventors: 史萍; 甄红; 张一飞; 周利; 尤崇革; 高伟民
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN103356745A

Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤的中药混合制剂，由麝香粉末和香椿树根皮粉末组成，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:20-1:50。本发明在香椿树根皮粉末中掺加了少量的麝香粉末得到组合物，麝香和香椿树根皮起到协同作用，经实验证实，麝香的加入大大提高了香椿树根皮的抗肿瘤效果，所得组合物对肿瘤的治疗作用比单用香椿树根皮或麝香提高了很多，效果显著，且本发明制剂制备工艺简单，有利于大规模生产。且取材于我国丰富动植物的中草药，在生产和治疗中不添加、不使用任何化学成分，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。在增加对肿瘤细胞特别是宫颈癌细胞杀伤力的同时，不仅不会对患者的器官有损伤，更不会降低患者的免疫力。

Description

一种用于肿瘤的中药混合制剂

技术领域

本发明涉及中药混合制剂领域，特别涉及一种用香椿和麝香进行科学配伍配制而成的中成药。

背景技术

近三十年来，癌症是危害人类健康的最严重的常见病之一，具有易转移、易复发等特性，患者死亡率高，是危及人类生命的第一大疾病。宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第二位常见的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。据世界范围内统计，每年约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发现的病例为13.15万，约占全世界1/4，并呈年轻化及上升趋势。

目前，对宫颈癌的治疗方法大多是手术切除治疗，但这种治疗方法不仅不能彻底治疗，还严重影响患者的生活质量。而现有的抗癌药物中，一些具有较好抑癌作用的药物具有较强的毒副作用，对正常细胞的杀伤力极大，使患者的免疫力大大降低。

麝香是一种名贵中药，为麝科动物雄性麝脐下腺囊的分泌物。祖国医药文献记载其具有芳香开窍，醒脑回苏，镇心安神，通痹和镇痉作用。所以以往麝香在药理作用研究上，主要侧重于其对中枢神经系统的影响，在抗炎、镇痛和增强免疫、抗变态反应、抗早孕方面也有较多的报道。临床上曾用于治疗血管性头痛、儿童智力不全症、冠心病、风湿痹症等。

香椿为楝科椿属植物，又名春芽树、椿树。香椿叶味辛苦、性平、归脾、胃经，具有祛暑化湿、解毒杀虫之效。香椿树皮味苦涩、性凉，具有除热、燥湿、涩肠、止血、杀虫等功效，可治久泻、久痢、肠风便血等疾病。目前未见有香椿用于治疗肿瘤的报导，更未见香椿和麝香联合用药用于癌症的报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于肿瘤的中药混合制剂。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种中药混合制剂在制备抑制肿瘤药物中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种用于肿瘤的中药混合制剂，所述中药混合制剂由麝香粉末和香椿树根皮粉末组成，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:20-1:50。

作为一个优选方案，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:50。

作为又一个优选方案，所述肿瘤是宫颈癌。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种中药混合制剂在制备抑制肿瘤药物中的应用，所述中药混合制剂由麝香粉末和香椿树根皮粉末组成，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:20-1:50。

作为又一个优选方案，所述肿瘤是宫颈癌。

本发明的优点在于，本发明所述中药混合制剂首次提出了麝香和香椿树根皮的联合用药用于抗肿瘤药物中，机理明确、作用显著，并且取材于我国丰富动植物的中草药，在生产和治疗中不添加、不使用任何化学成分，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。中药混合制剂中减少了麝香的含量，增加了香椿树根皮粉末，不仅原料药价格上比现有单一麝香便宜，而且抑癌效果要好于单一的麝香或单一香椿。中药抑癌在增加对肿瘤细胞特别是宫颈癌细胞杀伤力的同时，不仅不会对患者的器官有损伤，更不会降低患者的免疫力。

附图说明

图1为指数生长的宫颈癌细胞HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人肝癌细胞SMMU-7721、人正常肝细胞QSG-7701在不同浓度的中药混合制剂作用下的生长情况。

图2为指数生长的宫颈癌细胞HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人肝癌细胞SMMU-7721、人正常肝细胞QSG-7701在不同浓度的香椿浸提液作用下的生长情况。

图3为指数生长的宫颈癌细胞HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人肝癌细胞SMMU-7721、人正常肝细胞QSG-7701在中药配比中不同浓度的麝香浸提液作用下的生长情况。

图4为指数生长的宫颈癌细胞HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人肝癌细胞SMMU-7721、人正常肝细胞QSG-7701在高浓度的麝香浸提液作用下的生长情况。

图5为中药混合制剂作用下宫颈癌细胞HeLa的细胞凋亡情况

图6为中药混合制剂作用下宫颈癌细胞HeLa的细胞自噬情况。

图7为中药混合制剂作用下宫颈癌细胞HeLa的细胞周期影响。

图8为中药混合制剂作用下宫颈癌细胞HeLa的周期相关基因的表达情况。

图9为中药混合制剂影响细胞周期的简图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.中药混合试剂的制备

取麝香粉末和香椿树根皮粉末按照质量比1:20-1:50进行混合并煮沸，得到冻胶状有效浸提液即为中药混合制剂，上述制剂在生产和治疗中不添加、不使用任何化学成分。本发明实施例中取麝香粉末和香椿树根皮粉质量比1:50。

实施例2.中药混合制剂抑制癌细胞的实验

1、材料

宫颈癌细胞HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人肝癌细胞SMMU-7721、人正常肝细胞QSG-7701于实验室保存和培养；RPMI1640干粉、胎牛血清、胰酶（含EDTA）购自Gibco公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购于同仁化学科技（上海）有限公司；周期相关基因芯片订制于常州楚天生物科技有限公司。

2、细胞培养

细胞培养于10%血清、1%双抗（青霉素、链霉素）的RPMI1640培养基中。细胞置于5%CO₂、37℃培养箱内培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

3、细胞毒性测定

取对数生长期的细胞,按照一定细胞浓度接种至96孔板中，加入不同浓度的药物，在37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养24h、48、72h。用药组和对照组均设3个复孔，实验重复3次。

细胞培养液中加入10uLCCK-8溶液，在培养箱内孵育30min，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

采用上述方法，在指数生长期的宫颈癌细胞HeLa和人肝癌细胞系SMMU-7721中加入不同浓度的中药混合制剂，处理24h、48、72h后完成测定，重复三次不同的实验，将结果绘制成图，得图1。图1显示在药物浓度为50ug/ml处理HeLa细胞24h后，细胞的存活率仅剩32%，处理对照细胞NIH3T3后存活率仍高达70%，并显示了一定的时间和浓度的依赖关系。在药物浓度为50ug/ml处理SMMU-7721细胞72h后，细胞的存活率仅为44%，同样时间浓度处理对照细胞QSG-7701后，细胞存活率仍为60%。同时，结果指出中药混合制剂在不同程度上抑制多种肿瘤细胞的生长，即具有广谱的抑制肿瘤细胞增长作用，并显示了一定的时间和浓度的依赖关系。

将香椿树根皮浸提液加入不同种类癌细胞中，处理24h、48、72h后完成测定，重复三次实验后，将结果绘制成图，得图2。图2显示在单独的香椿树根皮浸提液处理后，对HeLa、SMMU-7721细胞的生长并未产生明显的抑制作用，可见上述中药混合制剂与单独的香椿树根皮浸提液相比，对癌细胞的生长抑制作用更显著。

将麝香浸提液加入不同种类癌细胞中，处理24h、48、72h后完成测定，重复三次实验后，将结果绘制成图，得图3、图4。图3显示按中药混合制剂配比中的麝香浸提液浓度处理后，对HeLa、SMMU-7721的生长并未产生明显的抑制作用。图4显示将麝香的浓度放大50倍对细胞进行处理，对HeLa、SMMU-7721细胞的生长仍未产生明显的抑制作用，仅在72h对QSG-7701有一定的杀伤力，但细胞存活仍在70%左右。可见上述中药混合制剂与单独的麝香浸提液相比，对癌细胞的生长抑制作用更显著。

以上结果显示出，单独的香椿树根皮浸提液和单独的麝香浸提液对癌细胞的抑制作用均不如中药混合制剂显著，显示出麝香与香椿联合用药的优越性。

4、Hoechst 33258和MDC染色分析细胞凋亡和自噬情况

将生长对数期的肿瘤细胞按照一定浓度接种于6孔板（放入盖玻片），分别加入不同浓度的中药混合制剂，药物处理24小时后，弃去原有细胞培养液，使用1×PBS缓缓淋洗盖玻片3次，6孔板每孔中使用微量移液枪准确加入1mL1×PBS和2μL Hoechst 33258(1mg/mL)，至终浓度为2μg/mL，轻轻混匀荧光染料溶液，于37℃避光孵育10min。荧光显微镜观察细胞凋亡情况，紫外激发波长350nm，发射波长461nm，细胞核呈明亮的蓝色荧光。图5结果显示，对照组和实验组在荧光显微镜下均呈现出明亮蓝色的细胞核，指出药物几乎没有引起HeLa细胞的凋亡。

药物处理24小时后，弃去原有细胞培养液，使用1×PBS缓缓淋洗盖玻片3次，6孔板每孔中使用微量移液枪准确加入1mL 1×PBS和0.05nmol/LMDC，轻轻混匀荧光染料溶液，于37℃避光孵育1h。4%多聚甲醛固定15min后，荧光显微镜观察细胞自噬情况。图6结果显示，对照组和实验组在荧光显微镜下均为出现自噬泡，指出药物几乎没有引起HeLa细胞的自噬。

5、流式细胞技术分析细胞周期的变化

将生长对数期的肿瘤细胞按照一定浓度接种于6孔板，分别加入不同浓度的中药混合制剂，药物处理24小时后收集细胞，离心后用PBS洗涤一次，收集沉淀。将细胞沉淀悬于75%的乙醇中，4℃过夜。离心后，PBS洗涤两次，细胞沉淀悬浮于500ul含0.5%RNA酶和10%Triton-X100的PBS中，用0.5%的PI染色固定。37℃孵育30分钟后，通过流式细胞仪进行检测。

中药混合制剂对肿瘤细胞的周期阻滞结果如图7所示。流式细胞仪分析发现50ug/ml中药混合制剂作用HeLa细胞24h后，S期百分率明显升高，表明细胞被阻滞在有丝分裂间期。现已知肿瘤细胞主要是由于细胞周期破坏而导致了细胞的失控生长。

6、实时荧光定量PCR检测周期相关基因变化

在此实验的基础上，通过实时荧光定量PCR对四十个影响细胞周期的基因表达水平进行检测。

根据TaKara公司RNAiso Plus TotalRNA提取试剂盒说明书。具体操作如下：

a.收集细胞：使用胰酶消化收集对照及加药处理24h后的细胞样品，室温1000rpm离心5min，弃培液，用PBS清洗细胞一次。

b.细胞裂解：1000rpm离心5min，分别使用1mL RNAiso Plus溶解对照及药物处理后的HeLa细胞，将含有细胞的裂解液转移至1.5mL离心管中，用量程为1000μL的微量移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，溶液呈透明状，室温静置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

c.12,000rpm 4℃条件下离心10分钟，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中。

d.每使用1mL TRNzol中加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

e.12,000rpm 4℃条件下离心10-15min，样品会分成3层：黄色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μL）转移到新的离心管中。

e.在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置20-30min。

f.12,000rpm 4℃条件下离心10min，取上清，可看到管侧管底形成胶状沉淀。

g.RNA沉淀的清洗：小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1mL75%乙醇（RNase-free ddH₂O配制）（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后，小心弃去乙醇（尽量除净）。

h.5,000rpm 4℃条件下离心3min，倒出液体，剩余少量液体短暂离心后用枪吸出。

i.带有RNA样品的离心管室温晾干，约10min后加30-100μLRNase-free ddH₂O溶解RNA。待RNA沉淀完全溶解后于-20℃保存。

j.RNA浓度及质量检测：

浓度检测：取Total RNA 1μL稀释20倍，进行浓度检测，注意A260/A280及A260/A230。

质量检测：将提取得到的RNA样品稀释，取500ng于1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测提取RNA的完整性以及是否存在DNA污染。

根据天根生化科技（北京）有限公司的FsatQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒提供方法反转录合成cDNA模板。

a.将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH₂O在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。

b.按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

表1gDNA去除反应体系

试剂	使用量
		5×gDNA Buffer	2uL
Total RNA	50ng-2ug
		RNase-Free ddH₂O	补足到10uL

c.按照表2的反转录反应体系配制混合液。

表2反转录反应体系

试剂	使用量
		10×Fast RT Buffer	2uL
RT Enzyme Mix	1uL
		FQ-RT Primer Mix	2uL
RNase-Free ddH₂O	补足到10uL

d.将反转录反应中的mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃孵育15min。

e.95℃孵育3min后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验。

根据天根生化科技（北京）有限公司的SuperReal荧光定量预混（增强版）试剂盒提供方法进行实时荧光定量PCR。

a.溶解2×SuperReal PreMix Plus、模板、引物和RNase-Free ddH₂O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。

b.建议置于冰上按照表3进行Real Time PCR反应液的配制。

表3Real Time PCR反应体系

组成成分	25uL体系
		2×SuperReal PreMix Plus	12.5uL
10uM引物（正向/反向）	各0.75uL
		cDNA模板	<125ng
RNase-Free ddH₂O	补足到20uL

c.上反应管，轻柔混匀，短暂离心。

d.采用两步法PCR反应程序进行反应

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
						预变性	1×	95℃	15min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
								60℃	32sec	退火/延伸	是

所得结果根据2^-ΔΔCt算法得出图8，所得实验数据均重复两次。结果显示在药物处理HeLa细胞24h后，多种基因有上调(2^-ΔΔCt>2)或下调(2^-ΔΔCt<0.5)。其中，显著下调的周期相关基因有CCNA1、CCND1、CCND2、CCNH、CDKN1B、MCM2、ORC6L、WEE1，显著上调的周期相关基因有CDC7、CDK6、CDK7、E2F3、RB1。

综上所述，含香椿树根皮、麝香的中药混合制剂对于不同癌细胞有不同程度的杀伤力，并呈现一定的浓度-时间依赖关系。对于宫颈癌HeLa细胞而言，此药物主要是通过诱导细胞引起周期阻滞而抑制细胞生长的，并通过基因芯片的初探，推测出此中药混合制剂影响细胞周期的简图如图9所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于肿瘤的中药混合制剂，其特征在于，所述中药混合制剂由麝香粉末和香椿树根皮粉末组成，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:20-1:50，所述肿瘤是宫颈癌和肝癌。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤的中药混合制剂，其特征在于，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:50。

3. 一种中药混合制剂在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述中药混合制剂由麝香粉末和香椿树根皮粉末组成，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:20-1:50，所述肿瘤是宫颈癌和肝癌。

4.根据权利要求3所述的一种中药混合制剂在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述麝香粉末和香椿树根皮粉末的质量比为1:50。