CN103342740A - 一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断elisa方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法,本发明利用原核表达纯化的禽戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端268个氨基酸（aHEV-ORF2-268）为包被抗原，针对该区域的亲和层析纯化的单抗1H5为阻断抗体，通过大量实验优化阻断ELISA检测条件，使该方法具有良好重复性，特异性和敏感性。

Description

一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法

技术领域

本发明属于血清学诊断领域，涉及禽戊肝病毒ORF2重组蛋白（aHEV-ORF2-268）,识别该蛋白的单抗1H5及检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法。

背景技术

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）是鸡的大肝大脾病（Big liverand spleen disease，BLS）或肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly，HS）综合症的主要病原，主要感染30-72周龄的蛋鸡和肉种鸡，引起鸡的死淘率升高和产蛋率下降，部分鸡腹部充血，卵巢退化，偶有肝脾肿大。

2001年Haqshenas等学者首次对禽HEV的基因组进行了描述，随后欧洲、澳大利亚也都描述了禽HEV本国分离株的基因序列。通过序列分析发现，禽HEV与人、猪HEV的同源性仅为50%左右，但是与哺乳动物的HEV在遗传性和抗原性上是有一定相关性的；另外，禽HEV分为3个基因型，这种分型似乎与地域相关，但是其血清型可能只有1个。

2010年国内首个禽HEV分离株的全基因组序列被描述，发现与其欧洲的分离株同源性较高98%，与美国和澳大利亚的为82%左右，并且属于禽HEV基因3型。

目前为止，禽HEV一直没有合适有效的体外培养系统，因此对该病毒的诊断通常是通过RT-PCR检测病毒的核酸和间接ELISA检测血清中的抗体。

关于血清学的ELISA诊断技术，美国的研究学者利用禽HEV当地分离株，原核表达该分离株的衣壳蛋白的后半段建立了禽HEV抗体检测的间接ELISA方法，但是该方法仅限于实验室用，并没有商业化合推广使用，另一方面该ELISA方法所用的抗原是用基因2型禽HEV分离株的衣壳蛋白建立的，而国内禽HEV的分离株是基因3型，目前尚未有抗原是用基因3型禽HEV分离株的衣壳蛋白建立抗体检测的ELISA方法。

目前，国内外还没有检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体阻断ELISA方法的报道。

发明内容

本发明的目的提供原核表达的禽戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端268个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明的另一目的是利用禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virusfrom China,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2蛋白的单抗1H5和上述蛋白，提供一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法。

利用国内禽HEV分离株的衣壳蛋白建立抗体检测的ELISA方法。而ELISA方法中，单抗阻断ELISA或竞争ELISA因能排除包被抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性。

本专利所描述的方法即是采用间接包被抗原的单克隆抗体阻断ELISA方法。其特点在于，利用单克隆抗体具有高度均质性和高度特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，使得该方法更加特异与敏感，而且可以用于检测多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体。因此，本专利相对间接ELISA方法而言具有在方法学上的优越性。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面，一种编码禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis Evirus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430）衣壳蛋白的氨基酸序列，其特征在于，禽戊型肝炎病毒中国分离株的ORF2蛋白C端268个氨基酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。

本发明的第二方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表达的重组蛋白，名称为aHEV-ORF2-268，作为蛋白包被抗原，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。该蛋白包被抗原是通过基因工程技术制备，其原核表达、鉴定、纯化方法详见实施例1。

本发明的第三方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是aHEV-ORF2-268的特异性抗体，名称为单抗1B5。单抗1B5是将重组蛋白免疫BABL/c小鼠，通过传统的杂交瘤细胞技术制备的，具体方法详见实施例2。

本发明的第四方面，一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在96孔酶标板上加入200ng/孔的原核表达的重组蛋白aHEV-ORF2-268，包被缓冲液为0.1M PBS，4℃包被过夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次；

步骤（1）中，PBS的pH值为7.2。

2)每孔加入200μl含2.5脱脂奶粉的PBST封闭液，室温封闭1小时，PBST洗板；

3)加入稀释的待检血清，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，室温孵育1小时，PBST洗板；

步骤（3）中，待检血清的稀释比例为1:10。

4)加入稀释的单抗1H5，100μl/孔，室温孵育1小时，PBST洗板；

步骤（4）中，单抗1H5的浓度为0.8μg/ml，单抗1H5的稀释比例为1:1000。

5)加入稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，100μl/孔，室温孵育1小时，PBST洗板；

步骤（5）中，单抗1H5的稀释比例为1:1000。

6)加入TMB底物溶液，100μl/孔，室温作用15min，每孔加入终止液50μl3M H₂SO₄终止反应；

7)以450nm单波长测定OD值，计算阻断率，进行结果判断。

步骤（7）中，所述阻断率（%）=[（阴性血清OD_450nm的值﹣检测样品的OD_450nm的值）/阴性血清OD_450nm的值]×100%；

所述判断的标准如下：

当阻断率≥20.73％时判断血清抗体阳性，

当阻断率＜15.71％时判断血清抗体为阴性，

当15.71%＜阻断率＜20.73%判断为可疑，需重复检测，如果仍低于20.73%，则判为阴性。

本发明的第五方面，一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA的模型，其特征在于，所述模型为：

阻断率（%）=[（阴性血清OD_450nm的值﹣检测样品的OD_450nm的值）/阴性血清OD_450nm的值]×100%；

判断标准如下：

当阻断率≥20.73％时判断血清抗体阳性，

当阻断率＜15.71％时判断血清抗体为阴性，

当15.71%＜阻断率＜20.73%判断为可疑，需重复检测，如果仍低于20.73%，则判为阴性。

本发明的有益效果：

本发明阻断ELISA方法是待检血清样品抑制单抗1B5与重组蛋白aHEV-ORF2-268的结合，以检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体。

本方法能够排除包被抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，而且操作简单，易于大范围推广，在禽戊型肝炎病毒的血清学诊断方面具有良好的应用前景。

本发明通过大量的实验优化阻断ELISA的反应条件，使该方法用于禽戊型肝炎病毒抗体检测具有良好重复性，敏感性和特异性。

附图说明

图1：构建包含禽HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸基因的阳性重组质粒的酶切鉴定。

图2A：SDS-PAGE分析不同条件（温度，IPTG浓度，诱导时间）下重组目的蛋白的表达量。

图2B：SDS-PAGE分析不同条件（温度，IPTG浓度，诱导时间）下重组目的蛋白的表达量。

图3：Western blot分析原核表达目的蛋白的抗原性。1，3为目的蛋白，一抗分别加阳性和阴性鸡血清孵育；2，4为对照蛋白，一抗分别加阳性和阴性鸡血清孵育。

图4：SDS-PAGE分析重组蛋白的纯化。1，2为纯化的重组蛋白；3为未纯化蛋白。

图5：SDS-PAGE分析单抗腹水的纯化。1：饱和硫酸铵初提后的腹水；2-3：PBS洗脱的杂蛋白；4-7：目的单抗1H5的IgG。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件或厂商提供的条件进行。

实施例1禽HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸重组蛋白的制备

1.1禽HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸基因的扩增

依据禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus from China,CaHEV,Genbank number GU954430）的全基因组序列，设计带有BamHI和XholI酶切位点的引物，引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

以CaHEV的病毒悬液为模板，RT-PCR扩增得到目的基因。

反转录体系：

5×First-strand buffer     4μl

dNTP (10mM)                1μl

0.1M DTT                   0.5ul

引物(20pm/μl)             1μl

RNA                        8μl

RNA酶抑制剂                1μl

Superscript II反转录酶     0.5μl

总体积                     20μl

反转录条件：

55℃      60min

85℃      5min

4℃保存。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

1.2重组表达质粒的构建

对pET-28（a）载体（Promega公司）进行BamHI和XholI（TaKaRa公司）双酶切后胶回收，将其与上述相同酶切的目的基因连接，转化克隆菌，提取质粒酶切鉴定（图1），测序后得到阳性重组质粒。

质粒和PCR产物的酶切体系：

质粒或PCR产物            9μl

BamHⅠ                   0.5μl

XholⅠ                   0.5μl

双蒸水                   8μl

10×K buffer             2μl

总体积                   20μl

7℃酶切反应2小时后，将产物胶回收后，用T4连接酶（TaKaRa公司），将酶切的PCR产物和pET‐28a载体16℃连接过夜。连接体系：

线性化PET-28a质粒         2μl(约100ng)

T₄ DNA连接酶               μl(350U)

连接酶缓冲液              2μl

双蒸水                    5μl

总体积                   20μl

1.3重组目的蛋白的表达与鉴定

将上述鉴定的阳性重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌Rosetta（DE3）plyS，提取单菌落接种于5ml含卡纳青霉素的LB培养基中，在37℃，225rpm震荡培养过夜。

第二天，按1：20的比例接种到新鲜的LB培养基，37℃，225rpm培养至OD₆₀₀至0.4左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养，在加入IPTG后0，2，4，6，8小时取1ml大肠杆菌菌液。

大肠杆菌菌液5000rpm离心10min，弃掉上清，留沉淀，加入100μl1×SDS上样缓冲液，加热5min后进行蛋白电泳，得到了预期32kDa的目的蛋白，同时优化温度，IPTG浓度和诱导时间等表达条件，结果最优条件为：37℃，225rpm，IPTG：0.1mmol/L诱导4h时表达量最大（图2A和图2B）。

将SDS-PAGE上的蛋白转至PVDF膜，用禽HEV抗体阳性鸡血清鉴定目的蛋白的表达，在32 kDa处，出现了棕色条带（图3），进一步证实了目的蛋白的表达并分析了目的蛋白的抗原性。

1.4重组蛋白的纯化

将收集的菌体超声裂解后，溶解包涵体，按照Ni-NTA（Invitrogen）说明书进行目的蛋白的纯化，SDS-PAGE分析蛋白的纯化效果，结果显示得到了较纯的目的蛋白（图4）。

实施例2单抗1H5的制备

2.1蛋白的乳化

将纯化的靶蛋白与完全和不完全弗氏佐剂按照1：1（V/V）混合进行乳化。

2.2免疫程序

选择6-8周的BABL/c小鼠作为免疫动物。每次免疫前尾部静脉采血。两次免疫间隔为2周。第一次用弗氏完全佐剂，蛋白剂量为75μg/只，腹腔注射，总剂量200μl/只。第二次用弗氏不完全佐剂，蛋白剂量仍为75μg/只。参考第二次相同的剂量和方式进行第三次免疫。融合前加强免疫一次。

2.3细胞融合

断劲处死免疫好的BALB/c小鼠，无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1在1ml50%PEG下融合，然后利用HAT培养基进行选择培养。

2.4阳性细胞的筛选及亚克隆

以提纯的靶蛋白为抗原（200ng/well）包板，吸取细胞培养上清以间接ELISA方法筛选阳性的细胞克隆，结果显示阳性孔，继续做亚克隆，同时扩大培养并冻存。采用有限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行2次亚克隆。

2.5单抗腹水的制备及纯化

将培养至生长期的杂交瘤细胞吹下，然后小鼠腹腔注射0.5ml的细胞悬液。接种后大约7-10天，用注射器针头插入腹腔内，收集腹水。将腹水放入25ml的小烧杯中，逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，慢慢搅拌2h后，10000rpm离心，沉淀，沉淀用0.01M pH7.2的PBS重悬。然后用Protein G亲和层析柱进一步纯化单抗（图5）。

实施例3检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法

3.1阻断ELISA方法最佳反应条件优化

3.1.11.溶液的配制

a)包被缓冲液液：0.01M PBS(500ml，pH=7.2±0.1)：NaCl4.25g，NaH₂PO₄·2H₂O0.178g，Na₂HPO₄·12H₂O1.386g，溶解定容至500ml，测量pH在7.1-7.3（若超出此范围则不能使用），常温可保存一周；

b)洗涤液（PBST）（1L）：每1L0.01M PBS（pH=7.2±0.1）加入Tween-205ml，充分混匀。

c)封闭液：将2.5g脱脂奶粉溶解于100ml PBS’T中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；

d)底物TMB：A液（1L）：称取66.5063g柠檬酸钾（potassium citrate），用800ml四蒸水溶解并用浓盐酸调节pH值至4.0,加入314μl H₂O₂，定容至1L，4℃保存。B液（30ml）：称取0.2956g四甲基联苯胺（TMB），0.0633g四丁基硼氢化铵（TBABH）溶于30ml二甲基乙酰胺（DMA），4℃避光保存。使用时将A液和B液以39：1的比例混合，现配现用。

e)终止液：3M浓H₂SO₄。

3.1.2包被抗原和阻断抗体最佳浓度确定

按棋盘方阵法进行，将禽HEV的重组蛋白aHEV-ORF2-268分别稀释至终浓度2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，4℃包被过夜，然后用含0.05%吐温-20的0.1M PBS(pH.2)[PBST]洗板，加入含2.5%脱脂奶粉的PBST（封闭液），200ul/孔，室温孵育1h，洗涤加入用PBST按1:100、1:1000、1:10000稀释的1H5单抗,进行间接ELISA，室温孵育1h后，洗涤板，加入1:8000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,洗涤后，加入TMB（100ul/孔）室温显色15分钟，然后加入3M H₂SO₄终止反应，酶标板读数（OD_450nm）。结果，包被抗原稀释至8μg/ml，1H5单抗稀释至1:100为最佳工作浓度，此时OD4_50nm的值约为1.0（表1）。

表1抗原包被浓度和单抗稀释度初次优化

3.1.3待检鸡血清的最佳稀释度确定

按照上述优化的抗原和1H5单抗的最佳工作浓度进行ELISA反应，加入封闭液洗涤后，先分别加入1:10，1:20和1:40稀释的禽HEV抗体阳性和阴性鸡血清，室温孵育1h，洗板后，加入最佳工作浓度的1H5单抗，然后按照上述方法加入显色液，终止液和读数等。根据阴性和阳性鸡血清的阻断率结果，1:10稀释鸡血清为最佳稀释比例（表2）。

表2待检鸡血清稀释比例选择

3.1.4待检鸡血清的室温孵育时间优化

按照3.1.2阻断ELISA的步骤，1:10最佳稀释比例的阴阳性鸡血清加入每孔后，分别室温孵育1h，2h和4h，然后继续进行阻断ELISA反应，最后根据阴阳性鸡血清的阻断率，确定最佳作用时间为1h（表3）。

表3待检鸡血清室温孵育时间选择

3.1.5阻断ELISA反应条件抗原，1H5单抗和酶标二抗最佳工作浓度进一步优化

按照3.1.1所述，将禽HEV的重组蛋白aHEV-ORF2-268分别稀释至终浓度2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，4℃包被过夜，然后用含0.05%吐温-20的0.1M PBS（pH.2）[PBST]洗板，加入含2.5%脱脂奶粉的PBST（封闭液），200ul/孔，室温孵育1h，加入1:10稀释的禽HEV抗体阴性和阳性鸡血清，室温孵育1h，洗涤后，加入用PBST按1:100、1:500、1:1000稀释的1H5单抗,室温孵育1h，洗涤后，室温孵育1h后，洗涤板，每孔加入100ul PBST稀释的1:2000、1:4000、1:8000的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1h后，洗板加入显色液，终止液，读数。根据阴阳性鸡血清的阻断率，得出抗原作4μg/ml稀释为最佳工作浓度，单抗1H5按1：1000稀释为阻断抗体最佳工作浓度，酶标二抗1：4000稀释为最佳工作浓度（表4）。

表4最佳反应浓度的进一步优化

3.1.6阻断ELISA最佳反应条件

根据3.1.2-3.1.5摸索的阻断ELISA最佳反应条件为：

1）在96孔酶标板上每孔加入终浓度为4μg/ml原核表达的重组蛋白aHEV-ORF2-268，100μl，4℃包被过夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次；

2）每孔中加入含2.5%脱脂奶粉的PBST（封闭液），200ul/孔，室温孵育1h，PBST洗板；

3）每孔加入100μl1:10稀释的待检鸡血清，双孔复检，同时设立标准阳性对照和标准阴性对照，室温孵育1h，PBST洗板；

4）每孔加入100μl1:1000稀释的单抗1H5（0.8μg/ml），室温孵育1h，PBST洗板；

5）每孔加入100μl1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1h，PBST洗板；

6）每孔加入100μl TMB显色液，室温孵育15min，每孔加入50μl3MH₂SO₄终止反应；

7）自动酶标仪读数OD_450nm，计算阻断率。

3.2临界值的确定

取100份SPF鸡血清和100份临床收集的禽HEV抗体阴性血清样品（间接ELISA检测阴性），利用3.1.6的阻断ELISA的反应条件进行检测，并计算阻断率，计算血清样品的平均阻断率（X）为5.687%，标准差（S）为5.015%。根据公式：临界值＝5.687%+3(或2)×5.015%，计算得出阴阳性判定标准的临界值为20.73％。

当样本阻断率≥20.73％时为阳性，当阻断率＜15.71%时为阴性。

当15.71％＜样本阻断率＜20.73％判断为可疑，需重复检测，如果仍低于20.73％，则判为阴性。

3.3阻断ELISA的重复性试验

使用5批不同时间表达的重组蛋白aHEV-ORF2-268包被阻断ELISA板，选用间接ELISA检测的禽HEV抗体阴性，弱阳性和阳性的3份鸡血清，用相同批次和不同批次个5个ELISA板进行批间和批内重复性试验，计算变异系数（表5）。结果显示3份血清在批间和批内实验中的变异系数均小于10%，证明该阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。

表5阻断ELISA的重复试验结果

3.4阻断ELISA的敏感性和特异性试验

利用实验室禽HEV攻毒鸡只后获得的100份禽HEV抗体阳性鸡血清（间接ELISA结果检测证实为阳性），采用建立的阻断ELISA方法检测后，4份为禽HEV抗体阴性，96份为阳性，证明建立的阻断ELISA方法相对的敏感性为96%。

另外，临床收集的间接ELISA检测的100份禽HEV抗体阴性鸡血清，利用该阻断ELISA方法检测后，所有鸡血清均为阴性，证明本方法的相对特异性为100%。

3.5阻断ELISA反应的交叉反应实验

按照3.1.6确定的阻断ELISA方法对已知的新城疫（NDV），禽流感(AIV)，禽马立克氏病(MDV)，J亚群禽白血病（ALV-J）和禽网状内皮增生症（REV）参考阳性血清进行检测，同时设立标准阴阳行血清对照（表6）。结果显示，除禽HEV抗体阳性鸡血清为阳性反应外，其与均为阴性反应，证明该阻断ELISA方法可特异性检测禽HEV抗体，不与其他几种禽病的阳性血清发生反应。

表6阻断ELISA的交叉反应实验结果

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (9)

1.一种编码禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430）衣壳蛋白的氨基酸序列，其特征在于，禽戊型肝炎病毒中国分离株的ORF2蛋白C端268个氨基酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。

2.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表达的重组蛋白，名称为aHEV-ORF2-268，作为蛋白包被抗原，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。

3.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是aHEV-ORF2-268的特异性抗体，名称为单抗1H5。

4.一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在96孔酶标板上加入200ng/孔的原核表达的重组蛋白aHEV-ORF2-268，包被缓冲液为0.1M PBS，4℃包被过夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次;

2）每孔加入200μl含2.5%脱脂奶粉的PBST封闭液，室温封闭1小时，PBST洗板；

3）加入稀释的待检血清，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，室温孵育1小时，PBST洗板；

4）加入稀释的单抗1H5，100μl/孔，室温孵育1小时，PBST洗板；

5）加入稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，100μl/孔，室温孵育1小时，PBST洗板；

6）加入TMB底物溶液，100μl/孔，室温作用15min，每孔加入终止液50μl3M H2SO4终止反应；

7）以450nm单波长测定OD值，计算阻断率，进行结果判断。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，PBS的pH值为7.2。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，待检血清的稀释比例为1:10。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，单抗1H5的浓度为0.8μg/ml，单抗1H5的稀释比例为1:1000。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（7）中，所述阻断率（%）=[（阴性血清OD_450nm的值﹣检测样品的OD_450nm的值）/阴性血清OD_450nm的值]×100%；

所述判断的标准如下：

当阻断率≥20.73％时判断血清抗体阳性，

当阻断率＜15.71％时判断血清抗体为阴性，

当15.71%＜阻断率＜20.73%判断为可疑，需重复检测，如果仍低于20.73%，则判为阴性。

9.一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA的模型，其特征在于，所述模型为：

阻断率（%）=[（阴性血清OD_450nm的值﹣检测样品的OD_450nm的值）/阴性血清OD_450nm的值]×100%；

判断标准如下：

当阻断率≥20.73％时判断血清抗体阳性，

当阻断率＜15.71％时判断血清抗体为阴性，

当15.71%＜阻断率＜20.73%判断为可疑，需重复检测，如果仍低于20.73%，则判为阴性。

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