CN103837681B - 戊型肝炎病毒抗体检验通用elisa法及其应用 - Google Patents

戊型肝炎病毒抗体检验通用elisa法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种病毒抗体检验方法，尤其涉及一种人、猪戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法及其应用。一种戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，所述通用ELISA法为单抗阻断ELISA法，使用猪戊型肝炎病毒的ORF3重组蛋白作为包被抗原。应用本发明建立的阻断ELISA方法对从广东省收集的100份猪血清和100份猪场工作人员血清进行HEV阳性血清的检验，得出结果与现有检验试剂盒检验结果的符合率为97%、98%。

Description

戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法及其应用
技术领域
本发明涉及一种病毒抗体检验方法，尤其涉及一种人、猪戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法及其应用。
背景技术
戊型肝炎是引起爆发性及散发性肝炎的主要原因，血清学调查表明，世界1/3人口曾经感染过戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)。无论是在发展中国家还是在发达国家，戊型肝炎都不再是一种罕见的疾病，在发达国家每年约有1.3万-2.6万人慢性肝炎患者因合并HE死亡。戊型肝炎具有比较明显的年龄特异性，对于老年人、慢性肝炎患者及孕妇危害性尤高，孕妇感染HEV的死亡率可达20%。众多研究表明，猪HEV可能是人感染HEV的主要来源之一，因此，积极开展动物源性HEV的研究将会对公共卫生及动物源性食品安全的实施具有巨大的帮助。
目前在我国大部分地区，不但在人群中可以检验到高比例存在的HEV阳性血清，同时在家畜（猪、马、牛、羊）及宠物（犬）体内同样可以发现高比例的HEV阳性血清，特别是在猪群中感染率尤为明显。通过对我国分离到的病毒遗传物质测序比对发现，无论是人源还是动物源的HEV大多数属于IV型。而且对我国东部及南部的分离株分析发现，猪HEV与人HEV具有较高的相似性。因此有学者推测，猪可能是HEV重要的储存器，并通过污染水源和食品，作为一种人兽共患病原在猪群及人群中自由传播。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人、猪以及多种动物戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法。
发明通过以下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种人、猪戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，具体为一种单抗阻断ELISA法，所述的单抗阻断ELISA法中使用猪戊型肝炎病毒的ORF3重组蛋白作为包被抗原。
包括以下步骤：
S1.包被抗原：用包被液将ORF3重组蛋白稀释加入酶标板孔中，静置；
S2.封闭：将步骤S1的酶标板用PBST洗板，加入封闭液，在35~39℃封闭；
S3.加样：将步骤S2所得的酶标板弃液清洗，将待检血清稀释并加入到清洗后的酶标板中，反应；
S4.加入酶标抗体：将HRP标记的ORF3单克隆抗体稀释加入到步骤S3所得的酶标板中，反应；
S5.显色：将底物加入到步骤S4所得酶标板中，显色反应；
S6.终止及测定：在步骤S5所得的酶标板中加入终止液，测定OD490nm值。
优选地，该单抗阻断ELISA法包括以下步骤：
S1.包被抗原：用包被液将ORF3重组蛋白稀释至0.5~10μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板孔中，4℃静置12h；同时设置抗原空白对照孔；
S2.封闭：弃去板孔中的液体，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封闭液200μL，37℃作用1~4h；
S3.加样：弃去板孔中的液体、洗板，待检血清事先以待检血清与PBST按1:1~1:200的体积比例进行稀释，然后向酶标板每孔中加入稀释后的待检血清100μL，37℃作用60min；
S4.加入酶标抗体：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入HRP标记的ORF3单克隆抗体100μL，HRP标记的ORF3单克隆抗体事先用PBST稀释至浓度为10-7~10-3mg/mL，37℃作用60min；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用10~25min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果。
优选地，S1中包被液为pH=9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液，ORF3重组蛋白被包被液稀释至1μg/100μL。
优选地，S2中封闭液为2%BSA，封闭的作用时间为2h。
优选地，S2中待检血清事先用以待检血清与PBST按1:10的体积比例进行稀释，S3中HRP标记的ORF3单克隆抗体事先用PBST稀释至浓度为10-5mg/mL。
优选地，S5中底物溶液为TMB底物溶液，显色的作用时间为20min。
优选地，还包括步骤S7：
S7.根据步骤S6测定的OD490nm值，将计算阻断率，当阻断率≤53.1时，判断为阳性；当阻断率≥58.3，判断为阴性；当53.1<阻断率<58.3时，判定为疑似，需要重新检查一次。
根据需求在提供一种上述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法在人或动物戊型肝炎病毒抗体检验试剂中的应用。
根据需求在提供一种上述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法的应用，其特征在于，用于人、猪戊型肝炎病毒抗体的检验。
本发明的优点在于：
1.HEV属于单股正链RNA病毒，是戊肝病毒属的唯一成员。该病毒具有一个7.2kb的基因组，含有三个开放阅读框（ORFs），分别为编码具有复制功能的多聚蛋白的ORF1、编码病毒衣壳蛋白的ORF2以及编码具有调节细胞蛋白激酶活性的ORF3。其中ORF3蛋白质量最小，可作为靶蛋白进行抗体的检测。氨基酸序列分析表明，HEVORF3比较保守，基因IV型人源HEVORF3和猪源HEVORF3之间的相似性在91.1%-93.9%之间。因此本研究选用ORF3蛋白作为诊断分子进行人、猪HEV阳性血清的检测。
2.ELISA作为常用的检测方法具有灵敏、快速、特异、高通量等特点。本研究选用单抗阻断ELSIA方法，该方法还具有以下特征：可减少包被抗原中杂蛋白对结果的干扰，减少非特异性结果的出现；单抗与抗原的结合具有高度均质性和较强的特异性，对阳性血清可以产生稳定的阻断效果；检测包括人在内的多种种属动物血清时，避免更换二抗。
3.本研究以猪源HEVORF3重组蛋白作为包被抗原，其单克隆抗体作为阻断抗体，建立用于检测人、猪甚至多种动物HEV阳性血清的、通用的阻断ELISA方法，检测方法的容错率高。
4.本研究建立的单抗阻断ELISA的优化条件为：HEVORF3重组纯化蛋白包被浓度为1μg/100μL，封闭液封闭条件为37℃2h，待检血清稀释倍数为1:10，阻断用ORF3单克隆抗体浓度为10-5mg/mL，底物显色条件为室温避光20min。并采用了补正措施，临界值判定标准为PI≤53.1时，可以判断为阳性；当PI≥58.3判断为阴性；当53.1<PI<58.3时，判定为疑似，需要重新检查一次。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
主要试剂
1.猪HEVORF3重组蛋白
2.辣根过氧化物酶（HRP）标记的猪HEVORF3单克隆抗体为实验室制备，初始浓度为1mg/mL
3.包被液（pH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液）：NaHCO30.586g，Na2CO30.318g，灭菌水200mL，pH9.6
4.磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl8.5g，NaH2PO4·12H2O2.894g，KCl0.26g，K2HPO40.261g，灭菌水1L，pH7.2
5.封闭液：100mLPBS中含2g牛血清白蛋白（BSA）
6.PBST：1000mLPBS中加入0.5mL的Tween-20
7.四甲基联苯胺（TMB）底物溶液（天根生化科技有限公司），其他试剂为国产分析纯
8.终止液（2mol/L浓硫酸）：浓硫酸22.2mL，蒸馏水177.8mL。
仪器设备及耗材
小型离心机、酶标仪、移液器、96孔ELISA板（Coring）
实施例1
阻断ELISA检验方法的建立：
S1.包被抗原：用包被液将ORF3蛋白稀释至1μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置12h；同时设置抗原空白对照孔；
S2.封闭：弃去孔中液体，PBST洗板5次，每次3min，加入封闭液，每孔200μL，37℃作用60min；
S3.加入待检血清：弃去孔中液体、洗板，加入待检血清，每孔100μL，37℃作用60min；同时设置待检血清空白对照孔；
S4.结合抗体：弃去孔中液体、洗板，加入HRP标记的ORF3mAb，每孔100μL，37℃作用60min；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用15min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果。
按公式计算阻断率：
Percentageinhibition(PI)=（OD待检血清空白对照-OD待检血清）/（OD待检血清空白对照-OD抗原空白对照）×100%。
实施例2
检验方法临界值的判断：
收集应用商品化HEV检验试剂盒（北京万泰生物科技有限公司）检验为阴性的100份血清样品，用建立的阻断ELISA检验其阻断率，计算平均值（x）和标准差（s），以确定结果判定的临界值。
当PI≤x+2s时，判定为阳性；
当PI≥x+3s时，判定为阴性；
当x+2s<PI<x+3s时，判定为疑似，需要重新检查一次。
结果表明x=42.7，s=5.2。因此当PI≤53.1时，可以判断为阳性；当PI≥58.3判断为阴性；当53.1<PI<58.3时，判定为疑似，需要重新检查一次。
实施例3
最佳抗原包被量的确定
S1.包被抗原：用包被液将ORF3蛋白分别稀释至0.5μg/100μL、1μg/100μL、5μg/100μL、10μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置12h；
S2.封闭：弃去孔中液体，PBST洗板5次，每次3min，加入封闭液，每孔200μL，37℃作用60min；
S3.加入待检血清：弃去孔中液体、洗板，加入待检血清，每孔100μL，37℃作用60min；
S4.加入HRP标记的mAb：弃去孔中液体、洗板，加入稀释的HRP标记的ORF3mAb，每孔100μL，37℃作用优化后的时间；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用15min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果如表1。
表1抗原包被浓度优化结果
结果表明，从抗原包被浓度1μg/100μL开始，包被浓度继续升高，PI值基本处于稳定。因此，抗原包被浓度可以使用1μg/100μL。
实施例4
最佳封闭时间的确定
S1.包被抗原：用包被液将ORF3蛋白稀释至1μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置12h；
S2.封闭：弃去孔中液体，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封闭液200μL，37℃作用，封闭时间分为采用：1h，2h，3h，4h；
S3.加入待检血清：弃去孔中液体、洗板，每孔加入100μL待检血清，37℃作用60min；
S4.加入HRP标记的mAb：弃去孔中液体、洗板，加入HRP标记的ORF3mAb，每孔100μL，37℃作用60min；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用15min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果如表2。
表2封闭时间的优化结果
试验结果表明封闭时间延长至2、3或4h时，PI值基本处于稳定，因此封闭时间可以选用2h。
实施例5
最佳待检血清稀释度及单克隆抗体浓度的确定
S1.包被抗原：用包被液将ORF3蛋白稀释至1μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置12h；
S2.封闭：弃去孔中液体，PBST洗板5次，每次3min，加入封闭液，每孔200μL，37℃作用120min；
S3.加入待检血清：弃去孔中液体、洗板，加入以PBST梯度稀释的待检血清（1:5、1:50、1:100、1:200），每孔100μL，37℃作用60min；
S4.加入HRP标记的mAb：弃去孔中液体、洗板，加入以PBST梯度稀释的HRP标记的ORF3mAb（浓度为10-3，10-4，10-5，10-6，10-7[单位：mg/mL]），每孔100μL，37℃作用60min；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用15min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果如表3。
表3待检血清和单克隆抗体稀释度的优化结果
根据矩阵法确定待检血清和单克隆抗体稀释度，结果表明当应用高浓度mAb作为结合抗体时，mAb与包被抗原发生高效率结合，同时由于浓度过高，而产生非特异性结合，PI值均在90%以上。当对待检血清从1:10开始稀释时，同时对mAb进行的稀释105及106稀释时，PI值出现递增变化。当mAb浓度过低时，对被检血清失去竞争作用。因此，在检验过程中待检血清可以采用1:10的稀释倍数，并对现有mAb进行105稀释，即使用浓度为10-5mg/mL。
实施例6
底物作用时间的确定
S1.包被抗原：用包被液将ORF3蛋白稀释至1μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置12h。
S2.封闭：弃去孔中液体，PBST洗板5次，每次3min，加入封闭液，每孔200μL，37℃孵育。
S3.加入待检血清：弃去孔中液体、洗板，加入待检血清，每孔100μL，37℃作用60min。
S4.加入HRP标记的mAb：弃去孔中液体、洗板，加入HRP标记的ORF3mAb，每孔100μL，37℃作用60min。
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光显色，时间分为采用：l0min，15min，20min，25min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果如表4。
表4底物显色时间的优化结果
结果表明底物显色时间过短、过长时，都会提高PI值。因此封闭时间可选用为20min。
实施例7
检验方法特异性检验
利用建立方法对已知的各种病毒的阳性血清进行交叉检验，以确定该方法的特异性。结果表明，利用该方法对猪瘟病毒（CSF）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪流感病毒（SIV)及2型圆环病毒（PCV-II）标准阳性血清进行检验时，PI值与阴性对照样品PI值相近，远远高于阳性对照的PI值，表明该方法具有很好的特异性，如表5。
表5特异性检验结果
实施例8
检验方法重复性检验
重复性试验结果表明，利用该实验方法对同一样本进行批内和批间的重复性检验，变异系数均在10%以内，说明该方法具有很高的重复性，如表6。
表6重复性检验结果
1 2 3 4 5
批内（%） 31.9 32.5 32.7 32.1 32.3
批间（%） 31.9 31.7 32.8 32.1 33.2
实施例9
检验方法的敏感性检验
对已知的血清进行10倍的倍比稀释，结果表明待检血清进行1:10及1:100倍稀释时，结果可以判断为阳性；进行1:1000倍稀释时，为疑似结果；进行1:10000及1:1000000倍稀释时，结果为阴性，如表7。
表7敏感性检验结果
实施例10检测方法用于临床样品的检测
应用本研究建立的阻断ELISA方法对从广东省的收集的100份猪血清和100份猪场工作人员血清进行HEV阳性血清的检测，同时应用北京万泰HEV血清ELISA检测试剂盒对其进行二次检测，并比较两种检测方法的符合率。结果表明，应用自建阻断ELISA方法检测100份猪血清和100份工作人员血清，HEV阳性血清的比例分别为49%、35%；应用商品化试剂盒的检测结果为52%、37%。两种方法检测两种动物HEV阳性血清的符合率是97%、98%，如表8，9。
应用自建阻断ELISA方法检测HEV阳性血清时，阳性率的结果均低于商品化试剂盒的检测结果。
表8猪血清的检测结果以及与商品化试剂盒检测的对比结果
表9人血清的检测结果以及与商品化试剂盒检测的对比结果

Claims (7)

1.一种戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.包被抗原：用包被液将ORF3重组蛋白稀释至0.5~10μg/100mL，以每孔100μL的量加入酶标板孔中，4℃静置12h；同时设置抗原空白对照孔；
S2.封闭：弃去板孔中的液体，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封闭液200μL，37℃作用1~4h；
S3.加样：弃去板孔中的液体、洗板，事先将待检血清与PBST按1:1~1:200的体积比例进行稀释，然后向酶标板每孔中加入稀释后的待检血清100μL，37℃作用60min；
S4.加入酶标抗体：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入HRP标记的ORF3单克隆抗体100μL，HRP标记的ORF3单克隆抗体事先用PBST稀释至浓度为10-7~10-3mg/mL，37℃作用60min；
S5.显色：弃去板孔中的液体、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室温避光作用10~25min；
S6.终止及测定：每孔加入2mol/LH2SO450μL终止反应，测定OD490nm值，记录结果；
S7.根据步骤S6测定的OD490nm值，将计算阻断率，当阻断率≤53.1时，判断为阳性；当阻断率≥58.3，判断为阴性；当53.1<阻断率<58.3时，判定为疑似，需要重新检查一次。
2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，其特征在于，S1中包被液为pH=9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液，ORF3重组蛋白被包被液稀释至1μg/100μL。
3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，其特征在于，S2中封闭液为2%BSA，封闭的作用时间为2h。
4.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，其特征在于，S3中待检血清事先将待检血清与PBST按1:10的体积比例进行稀释，S4中HRP标记的ORF3单克隆抗体事先用PBST将其浓度稀释至10-5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法，其特征在于，S5中底物溶液为TMB底物溶液，显色的作用时间为20min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法在人或动物戊型肝炎病毒抗体检验试剂中的应用。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的戊型肝炎病毒抗体检验通用ELISA法的应用，其特征在于，用于人、猪戊型肝炎病毒抗体的检验。
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A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus;XIANG-JIN MENG et al;《Medical Sciences》;19970930;第94卷;第9860-9865页 *
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