CN103328620B - 一种从生物质中提取脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从微生物生物质回收脂质的方法。该方法包括提供湿微生物生物质进行提取并且不破坏所述生物质的细胞壁，所述微生物生物质含有脂质，然后，在至少170℃的高温和高压下用液体提取剂对所述湿微生物生物质进行提取。所述温度和压力的组合使得在所述细胞中所述脂质与所述提取剂接触。然后，从所述提取剂回收所提取的脂质或用所述提取剂回收所提取的脂质。

Description

一种从生物质中提取脂质的方法
发明领域
本发明涉及一种从微生物生物质中提取脂质的方法。更具体地，该方法涉及提高源自湿微生物生物质的脂质的提取收率和/或提取纯度。
发明背景
微生物例如藻类、古细菌、细菌和真菌(包括丝状真菌、霉菌和酵母菌)可含有高达其干物质总量80％的甘油三酯。然而，来自微生物生物质、适合作为燃料生产的前体的油在市场上是稀缺的。这主要是由于缺乏有效而经济的方法提供来自微生物生物质的高质量的油。
从微生物生物质中提取油或脂质的可获得的方法通常需要微生物生物质被干燥和/或微生物细胞被破坏。生物质的干燥消耗大量的能量并且，例如，通过接触式干燥、喷雾干燥或甚至冷冻干燥在离心后进行。生物质中通常的水含量或干物质含量取决于所使用的微生物生物质材料。通常，干物质含量从15％到40％(按重量计)可以通过传统的细胞收集技术例如离心法或过滤法实现。基本上，一般旨在游离水的含量尽可能的低来使提取收率最大化。
另外一种从生物质中获取油的方法是应用非选择性提取剂，该方法通常产生含有高含量杂质的油。杂质，例如金属、磷和氨基酸会造成问题，例如，在燃料生产中形成催化剂毒物和/或腐蚀性物质。因此，经常需要用后处理来除去这些所提取油产品中的不良成分。
特别地，微生物生物质中高含量的磷脂，也就是在总脂质量中的膜脂量，会造成问题。这些磷脂通常以金属盐的形式提供高含量金属进入油。一般地，这些磷脂在进一步的加工(例如在催化过程下精炼)之前已从粗生物油级分中除去。
通常，可获得的一些方法的缺陷在于缺乏选择性来生产良好质量的油或收率不良，这些通过额外的加工步骤或选择不经济的工艺条件来弥补。
US2007218175公开了一种在15℃-180℃的温度下对含脂肪酸烷基酯的含油植物进行提取的方法。该发明人称，通常在较高温度下可获得较高收率，但另一方面，较高的温度会导致油产品含有较高量的磷。使用较高温度提取因此不被认为是有利的，并且从湿微生物生物质中提取还未公开。
US4857329公开了一种提取方法，其中使用超临界态溶剂或使用超临界态溶剂和助溶剂(选自丁烷、戊烷、己烷、庚烷和环己烷)的混合物，对真菌进行提取。为了提供该超临界态，所施用的压力应在200-600kg/cm2范围内。对真菌细胞进行脱水，使其水分含量为50％-70％，加热使温度达到150-200℃，并至少用该超临界态溶剂在低于90℃的温度下提取。这里没有对所获油产品所含杂质进行分析。
WO2008034109公开了一种从微生物生物质，例如微藻类、细菌和真菌中回收烷基酯形式的脂肪酸的方法。该生物质在高达450℃的温度和高压下处理，例如达到40MPa(大约400巴)。该高温处理旨在并导致细胞的破裂和形成油相。醇类，例如甲醇或乙醇，被加入该油相，然后烷基酯(FAME或FAEE)形成。助溶剂(例如烷烃)和催化剂(例如有机酸)可以被使用。酯化反应基本上要求无水环境和大量的醇类存在。
本发明的目的是提供一种从湿生物质中有效去除脂质、尤其是甘油三酯的方法。
本发明进一步的目的是提供一种从湿生物质中有效产生脂质的方法，该脂质产品的杂质(例如磷和/或有害金属)含量很低。
此外，本发明的另一个目的是提供一种产生脂质的方法，该脂质适合在各种烃组分、生物燃料和可再生柴油生产的催化精炼过程中使用。
发明概述
发明人已发现，当湿微生物生物质在高温高压下被提取时可以高收率获得脂质油。而且，相比于在常规提取温度和提取条件下提取，所回收油的质量也好得多。所回收的油被发现具有低的金属和磷含量。使用常规提取，例如在100℃作为典型最高温度的己烷提取和己烷蒸发，提取出的油中金属含量明显更高。
如权利要求1所描述的，本发明提供一种提高源自湿微生物生物质的油的纯度和/或收率的方法。
例如，当对微生物生物质进行提取时，磷脂连同中性脂肪通常趋于聚集于油相中。本发明所获提取产物主要包含甘油三酯形式的脂肪和油。
本发明的一项主要优势是在对湿生物质进行提取操作前无需耗能干燥。也无需为了提高油收率而机械破坏微生物细胞。
另外，油中杂质含量尤其是磷含量显著降低，这提高了在随后的油精炼过程中催化剂的生命周期并降低了对额外预处理的需要。而且，油的总收率可被提高。
在本发明所述方法中，精炼步骤之前为除去磷脂的预处理/后处理的需求因此被避免。
附图简要说明
图1显示了对于根据实施例1用庚烷所提取的微绿球藻微藻，作为脂质总量百分比的油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
图2显示了对于根据实施例2用庚烷所提取的微绿球藻微藻，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
图3显示了对于根据实施例3用庚烷所提取的红球菌细菌，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系，。
图4显示了对于根据实施例4用庚烷所提取的小球藻微藻，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
图5显示了对于根据实施例5用庚烷所提取的被孢霉菌真菌，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
图6显示了对于根据比较实施例1用庚烷提取的干燥杜氏藻微藻，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
图7显示了对于根据比较实施例2用庚烷提取的红球菌细菌，油收率以及杂质含量与提取温度的函数关系。
发明详述
术语“脂质”指的是脂肪物质，其分子通常包含，作为一部分，溶于非极性有机溶剂但难溶于水的脂族烃链。在活细胞中脂质是一种必需大分子组。脂质包括，例如脂肪、油、蜡、蜡酯、甾醇、萜类化合物、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基链烷酸酯、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、磷脂，、糖脂、鞘脂和酰基甘油，例如甘油单脂(单酰甘油)、甘油二酯(二酰基甘油)或甘油三酯(三酰甘油，TAG)
本发明中从产品中回收的理想脂质包括脂肪、油、蜡、和脂肪酸及其衍生物。
术语“微生物生物质”指源自或包含微生物的生物质，所述微生物包括细菌，蓝细菌，真菌例如酵母菌、丝状真菌和霉菌，古细菌，原生生物；微生植物例如藻类，微藻类，浮游生物和真涡虫。多数微生物是单一细胞的，即单细胞，然而，一些多细胞生物也是微生的。这些微生物易于积聚脂质或已被遗传改造以积聚脂质或提高脂质的积聚。
本发明的一个优选实施方案中含有脂质的微生物生物质选自细菌，蓝细菌，真菌例如酵母菌、丝状真菌和霉菌，古细菌，原生生物；微生植物例如藻类，微藻类，浮游生物和真涡虫，更优选微藻类，细菌，真菌，丝状真菌，霉菌和酵母。
在一个优选实施方式中，微生物生物质包括微藻属，所述微藻属包括杜氏藻(Dunaliella)，小球藻属，葡萄藻属(Botryococcus)，咸胞藻属(Brachiomonas)，绿球藻属，隐甲藻(Crypthecodinium)，眼虫属，红球藻属，衣藻(Chlamydomas)，等鞭金藻(Isochrysis)，颗石藻(Pleurochrysis)，巴福藻(Pavlova)，原壁菌属(Prototheca)，褐指藻(Phaeodactylum)，伪小球藻(Pseudochlorella)，单细胞绿藻(Parachlorella)，微细绿藻(Bracteococcus)，栅藻属(Scenedesmus)，骨条藻(Skeletonema)，角毛藻(Chaetoceros)，菱形藻(Nitzschia)，微绿球藻，舟形藻(Navicula)，微小绿藻(Nannochloris)，裂壶藻(Scihizochytrium)，肋线藻属(Sceletonema)，破囊壶菌(Thraustochytrium)，吾肯氏壶藻(Ulkenia)，四爿藻(Tetraselmis)和集胞藻属(Synechocystis)。当使用这组微藻类时，发现该方法特别有效，这组微藻类选自微绿球、杜氏藻例如杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)；褐指藻类，例如三角褐指藻；和小球藻类，例如能够并入高含量的脂质的淀粉核小球藻。
在另一优选实施方案中，微生物生物质包括真菌，特别是丝状真菌，属于以下属：曲霉属，被孢霉属，黑毛菌属(Mortierella)，麦角菌属，枝孢属(Cladosporidium)，小克银汉霉属，裸孢壳属(Emericella)，镰刀菌属，球囊霉属(Glomus)，毛霉菌属，拟青霉属，青霉属，腐霉菌属，根霉菌属，木霉属，接霉属，腐质霉属，分枝孢子菌属，畸枝霉属，黑粉菌属，特别是含大量的脂质和必需脂肪酸的那些物种。优选地，微生物生物质包括深黄被孢霉、毛霉菌属、曲霉属或根霉菌属。
在另一优选实施方案中，微生物生物质包括油脂酵母，其属于以下属：棍孢属，德巴利酵母属(Deparyomyces)，管囊酵母属，克鲁维酵母菌属，Galactomyces，汉逊酵母属，酵母菌属，Waltomyces，拟内孢霉属，隐球菌属例如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)，红冬孢酵母属例如Rohodosporidium toruloides，红酵母属，例如粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，子囊菌酵母属(Yarrowia)例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，毕赤酵母属例如树干毕赤酵母，假丝酵母属例如弯假丝酵母，脂质酵母属例如斯达氏脂质酵母，和毛孢子菌属例如皮肤毛孢子菌或芽毛孢子菌，它们都易于积聚脂质或已被遗传改造来产生脂质。最优选地，酵母包括油脂酵母属，红冬孢酵母属，或隐球菌属。
在另一优选实施方案中，微生物生物质包括细菌，其属于下列属：不动杆菌属，放线杆菌属(Actinobacter)，食碱菌属(Alcanivorax)，产气微生物(Aerogenes)，鱼腥藻属，节杆菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，迪茨菌属(Dietzia)，大头茶属，埃希氏杆菌属，Flexibacterium，微球菌属，分枝杆菌属，诺卡氏菌属，念珠藻属，颤藻属，假单胞菌属，红球菌属，红微菌属，红假单胞菌属，斯瓦尼菌属，志贺氏菌属，链霉菌属和弧菌属。最优选地，细菌包括浑浊红球菌，不动杆菌属，诺卡氏菌属或链霉菌属。
本发明提供了一种从微生物生物质回收脂质的方法。该方法至少包括以下步骤：
(i)提供含脂质的微生物生物质，以不破坏生物质的细胞壁进行提取。在使该生物质进行提取之前，无需为了帮助提取剂渗透进入与脂质接触的外部机械性破坏步骤。
(ii)用液体提取剂在至少高温170℃和高压下对所述湿微生物生物质进行提取，所述高压优选超过2bar，但一般由在封闭提取系统中的所选温度决定，其中温度和压力的结合使得在所述细胞中的所述脂质与所述提取剂接触。
(iii)接下来，所提取的脂质从所述提取剂中或用所述提取剂回收。
所要处理的生物质可从培养或生长系统例如反应器中直接获得。适宜的生物质也包括冷冻生物质。要处理的生物质用一般公知的方法处理，例如离心，过滤，滗析，浮选或可能由絮凝协助的沉降，来除去多余的水或含水生长溶液。微藻类，细菌，古细菌，丝状真菌，霉菌或酵母生物质优选在加工之前过滤或离心。另一方面，来自固态培养或固定培养等的生物质，如果需要，可通过将其在水介质中浆化而使用。
术语“湿”指微生物生物质来自水性培养溶液，并且通过普通低能耗除水过程例如过滤等从微生物生物质除去多余的水，并且微生物生物质并未被特别干燥。可替代地，固体干微生物生物质可被浆化成水性形式。
在一个优选实施方案中，湿微生物生物质的含水量要适当的高以使通过常规抽吸方法传质可行。
被干燥的或“干”微生物生物质通常水含量约为10％或更少，其中该水为结合水，即在细胞结构之内的水。典型的保存要求是水含量小于约13％。当生物质未被特别干燥时，其中除了结合水还有不限制在细胞结构中的游离水。该游离水含量取决于微生物生物质的类型和所用的除水方法。在本发明中，湿微生物生物质含游离水并且水含量优选按重量计至少60％，更优选至少65％，最优选至少70％，例如至少75％或在藻类的情况下多于80％。特别地，当藻类生物质被离心处理时，水含量约为65％-80％。
本发明的方法也适宜于已干燥的生物质的处理。所测已干燥的生物质中干物质含量优选按重量计95％-98％。然而，因为所收获的生物质通常是湿的(即从水性培养物中收获)，若该生物质在提取之前首先受到不必要的耗能干燥，就会失去一项主要优势。
此外，除了为容纳不期望的残留物例如金属、磷化合物和糖类等的提取剂，水还有利于第二相的形成。在某种程度上，这些残留物可附着在生物质残留物的表面，但它们主要会留在水相中。
在从将在本发明所述方法进行处理的生物质中除去多余的水后，该生物质干物质含量按重量计低于70％，优选低于45％，更优选低于40％。取决于要被处理的含水微生物生物质，其干物质的含量按重量计可低至4％。然而，优选干物质含量按重量计至少5％，更优选至少10％，最优选至少11％，例如19％-38％。
根据本发明，湿微生物生物质被提供到提取单元，该提取单元任选地使用惰性气体清洗，优选氮气，来避免或最小化与外界气体可能的反应，并且任选地，在启动加热和提取处理之前，设置为从密闭反应器中测量的1-5bar的超压。随后，该生物质经受高温高压处理。
提取温度被升高到从至少170℃到优选300℃或以下的温度，其中热解通常发生于较高的温度，优选175℃-270℃，更优选185℃-260℃，最优选190℃-250℃，例如200℃-245℃。优选温度范围取决于，从某种程度来说，所使用微生物生物质的种类。最佳温度的选择不仅取决于可能获取的最大收率或纯度，还取决于油和残留物的进一步目标用途。例如，若进一步用途是在生物燃料催化精炼处理中，则对催化剂中毒即金属和磷的含量设定标准。无需在达到足够低的值后进一步优化处理过程。再者，所回收脂质的质量，例如TAG含量，随所使用的处理参数变化。残留物的质量取决于所使用的提取温度。当使用更高的温度时，残留物可涉及直接燃烧来产生能量。残留物作为饲料或草料的利用可通过采用较低的提取温度来实现。
提取压力的升高是由于升高的温度，因为通常采用密闭压力容器或反应器。提取压力取决于所选温度，所选溶剂即其沸点和蒸汽压和反应器死体积。本领域技术人员能基于理论计算使用这些参数确定压力值。在批操作模式中，通常大约65％是有效体积而大约35％是死体积。优选地，可选择溶剂，只要其至少95％、优选98％、更优选99％为液相。优选压力范围为5bar-100bar，更优选10bar-80bar，最优选20bar-70bar，例如25bar-60bar。目标温度为油提取过程中的最大水含量并且任选地为醇含量设置限制。这些成分通常具有高的蒸汽压并且因此在适合的情况下，优选地，部分水或醇在加热阶段通过蒸馏除去。这实现了用所选提取剂达到目标温度。或者可替代地，醇的量与主要提取剂例如己烷或庚烷相比需要被限制或这是低的。
提高提取温度及压力的目的是实现提取剂与脂质的更好接触。不被任何特定理论限制，所预期的是，由于高温使得原料之间的弱相互作用被减弱，这使得溶剂和脂质成分相互作用。，微生物生物质细胞的水含量可以是当受高温高压时细胞结构中脂质对提取剂变得可接触而释放其中的脂质的原因。如通过提高的提取脂质收率和提高的提取脂质纯度所描述，提取过程被发现得到促进。
在本发明中使用的适宜提取剂为非极性有机溶剂，其基本上，或优选完全与水不混溶。与水相的混溶导致收率的减少和在相分离时可能出现的困难。使用任何溶解脂质的溶剂都是可能的，但优选的溶剂是长链脂肪族化合物或C3-C16环烷烃，更优选C5-C12烷烃。最优选烷烃包括己烷，庚烷或辛烷或其混合物。
根据一个实施方案，可以使用适宜于油的精炼的烷烃混合物，例如不同的汽油蒸馏馏分。优选地，这些馏分包含庚烷和/或辛烷。适宜溶剂的例子是精炼石油蒸馏馏分，如低芳香物质或无芳香物质的烃溶剂混合物，例如NESSOL LIAV110(bp.85-110℃，可从NestleOil获得)，LIAV230(bp.175-225℃)及其类似物。
提取使用液体提取剂进行。这意味着提取容器的压力需使得所用提取剂保持液体形式。因为提取使用液体形式的提取剂进行，温度和压力不能使得提取剂处于超临界状态。
提取用常规的方法进行。目标收率是通过整个过程的经济性确定的有效收率。
根据一个实施方案，在批操作中，微生物生物质和提取溶剂一起被置于密闭压力反应器中。任选地，该容器用惰性气体清洗并且此后密闭并加热至期望温度。脂质的回收收率随提取溶剂的量的增加而提高。优选地，生物质中干物质的量与总提取剂量的比为1∶1到1∶20，更优选1∶2到1∶15，最优选1∶2.5到1∶6。提取在剧烈或有效混合下进行，确保溶剂和生物质均匀而有效的接触。延迟时间通常从几十分钟到几个小时，取决于温度、生物质类型、溶剂和批次大小。
在一个实施方案中，当使用经干燥的生物质时，生物质中干物质的量与溶剂总量之比为约1∶5。
通过本领域技术人员对设备和过程细节的改变，提取可以在工业规模下以对流或共流的连续模式进行。
在提取之后，期望的回收的脂质、脂肪和油保留在有机提取剂相中。它们可通过常规方法例如蒸馏或蒸发从有机溶剂中分离，或者它们可以按其原样用于进一步处理。
在一个实施方案中，与提取剂混合的所回收脂质按其原样被用于油催化生物燃料精炼过程。
在另一实施方案中，提取剂被分离并再循环回提取过程再利用。
典型的，收率作为总脂质含量的百分比为至少约70％，优选大于约80％，或最优选大于85％或甚至大于90％，取决于选择的处理参数、生物质和期望的目标纯度值。对于藻类微绿球藻，获得大于90％的收率，而对于小球藻或杜氏藻，收率要稍低，约为80％-85％。对于细菌例如红球菌属，收率通常高，约为80％，优选高于90％，取决于所选温度。
在本发明的另一实施方案中，除主要非极性有机提取剂外，至少加入一种可渗透入所述生物质所含微生物物种的细胞壁的辅助液体提取剂。在提取步骤中，形成两个相，即一个包含辅助提取剂的水相和一个包含主要提取剂的有机相。除了用于容纳不期望的残留物例如金属、磷化合物、糖类及其类似物的提取溶剂之外，水优选还形成第二相。在某种程度上这些残留物可附着在生物质残渣的表面，但它们主要会保留在水相中。优选地，辅助提取剂包括可溶于水的有机溶剂。更优选地，该有机溶剂为可溶于水的醇，酸例如乙酸或甲酸，或酮例如丙酮。最优选地，有机溶剂是选自甲醇、乙醇、异丙醇和丙醇的醇。在提取进行后，这两种提取剂成分基本上彼此不混溶。提取剂在提取前可互溶。提取剂在提取之前和/或之后可形成两相系统，但至少在提取之后形成两相系统。在提取过程中存在的水和低含量的醇抑制了不期望的酯交换，优选所形成酯的量按重量计低于3％。
在一个关于两相提取的优选实施方案中，优选的辅助提取剂和主要提取剂对分别是甲醇和/或乙醇与庚烷和/或辛烷。一个进一步关于适宜的主要提取剂的例子是低芳香物质或无芳香物质的HC溶剂混合物例如NESSOL LIAV110及其类似物。所用提取剂例如庚烷和乙醇与所处理细胞生物质的比率应在合理的限值内，即使增加提取剂的量将增加收率也是如此。生物质干物质的量与总提取剂量之比为1∶1-1∶20，更优选1∶2-1∶15，最优选1∶2.5-1∶6。辅助提取剂与主要提取剂之比为1∶10-2∶1。较高量的辅助提取剂对某些基于细菌的生物质和抑制不可逆水乳液的形成是特别有用的。
本发明方法的一项主要优势是高量的磷基本上不再存在于油相中。高温提取明显增强了脂质对油相的选择性而磷和金属保留在水相中。
在本发明的方法中，所提取的和可能分离的脂质产品的磷含量与在低温下所提取的脂质中的含量相比显著降低。对于例如异养生物(包括某些藻类和丝状真菌)，在170℃以下提取产生的脂质磷含量多于550ppm或甚至是2000ppm，对于自养藻类和例如红球菌属，含量甚至达到2000-5000ppm。在本发明的方法中，磷含量减少到小于20ppm，优选到小于15ppm，或甚至到小于10ppm。
使用本发明的方法，所提取脂质或脂质在提取剂中的混合物中金属含量被降低至约为在低温下所提取脂质中含量的约二十分之一或甚至一百分之一。本发明所获脂质产品仅含有明显降降低量的金属或金属盐。典型的有害杂质包括Al、Cr、Cu、Fe、Mg、Ni、Pb、Zn和Mn，这些对例如催化油精炼是有害的。根据本发明，取决于所使用温度和溶剂的结合，对于自养培养的盐水藻，优选总金属含量从数千ppm下降到合理的范围例如数百ppm，或对于异养生长物种，其含量小于20ppm，优选小于10ppm，更优选小于5ppm。
在本发明的高温高压提取条件下，保留在微生物生物质中的乳化剂和去污剂类化合物，或是分解或是保留在水相中，因此不会干扰随后的油精炼过程。
在本发明的进一步的方面，由以上所述方法产生的回收脂质被用于生物柴油、可再生柴油、喷气燃料、汽油或基础油成分的生产。
在一个优选实施方案中，根据本发明的方法，从湿微生物生物质中回收的脂质被用作生物柴油、可再生柴油、喷气燃料、汽油或基础油成分及其类似物生产的原料。术语“生物柴油”指由脂肪酸烷基酯组成的柴油，通常通过酯交换生产。在酯交换中，酰基甘油被转换成长链脂肪酸烷基酯，例如甲基酯、乙基酯或丙基酯。术语“可再生柴油”指通过经氢化处理的脂质产生的燃料，例如氢脱氧(hydrogen deoxygenation)、氢化或加氢处理。在氢化处理中，酰基甘油被转换成相应的烷烃，即石蜡。石蜡可通过异构化或其它可选处理被进一步修饰。可再生柴油过程任选地用来生产喷气燃料和/或汽油。此外，可进行脂质的裂化来生产生物燃料。另外，在某些应用中，脂质优选被直接用作生物燃料无需进一步处理。
本发明通过实施例作进一步的说明，但并不限于所述实施例。
实施例
该实验所用压力反应器来自Parr仪器公司，型号4843。庚烷为纯度99％正庚烷(来自J.T.Baker)。
用于分析的气相色谱(GC)为来自Agilent Technologies的6890N，离子耦合等离子体(ICP)分析仪为来自Perkin Elmer的Optima7300DV。
实施例1
所用藻类生物质由于自养培养在含盐海水中，包含大量的金属和磷，并且其细胞中磷脂含量高。离心过的生物质干重按重量计为33％而且干物质按重量计包含21％的脂质。
原始未处理的生物质中干物质的含量通过在105℃的烤箱中干燥该生物质而确定，并且原始未处理的生物质中的脂质量在脂质皂化和甲基化之后通过GC分析确定。
150g从微绿球藻微藻的培养获得的离心过的湿生物质细胞和150g庚烷被称重放入1000ml的搅拌压力反应器中。该密闭容器被加热至预设提取温度，160℃，180℃，200℃和225℃，并保持60分钟然后冷却到大约30℃。在提取过程中，该细胞-溶剂混合物在该压力反应器内以500rpm的速度连续搅拌。打开反应器并通过离心(10min，4430rpm)从生物质和水相中分离庚烷-油相，并置于分离漏斗中沉降。该庚烷-油相在旋转蒸发器中蒸发。将油称重。在脂质皂化和甲基化之后用GC分析总脂肪酸含量。金属和磷含量通过ICP分析确定。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(包括Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V和Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图1。
表1显示在不同温度下所提取油中各种金属杂质的量、磷杂质的量和油收率。
油收率随提取温度的升高而提高。当提取温度由160℃升到200℃时，可看到磷含量的一个大的降幅(2810ppm和225ppm)。在225℃提取的油中，磷含量达到最低，7.3ppm。金属含量与磷含量一起降低，在225℃提取的油中，总金属含量达到最低135ppm。
表1
该实施例表明，使用本发明的方法，以95％的收率获得包含小于10ppm的磷的藻油。油产品的质量得到了显著的提高，即当对湿生物质的提取温度提高到200℃时，磷和金属的含量降低，或者当温度升至225℃时甚至降低更多。
实施例2
与实施例1相似，所用藻生物质含大量金属和磷，由于在含盐海水中自养培养而且其细胞中磷脂含量高。在该实施例中，离心后生物质的干重为19％并且干物质含13％的脂质。
300g从微绿球藻微藻的培养获得的离心过的湿微生物生物质细胞和300g庚烷称重置入一个1000ml的搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
油收率(即所提取总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)，以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图2。
表2显示在不同温度下所提取的油中各种金属、磷的量和油收率。
表2
与实施例1相比，为了得到按重量计超过80％的提取脂质，脂质含量较低且水含量较高的生物质需要较高的提取温度。在235℃，油收率很高，达到95％，并且磷含量低至5.6ppm。总金属水平为439ppm。
该实施例表明，当湿生物质的提取温度升高到200℃以上时，油的质量得到了提高，即磷和金属的含量降低，当温度在235℃以上时，油质量甚至更好。
实施例3
300g从红球菌(一种革兰氏阳性细菌)培养获得的离心过的湿细胞和300g庚烷称重置入1000ml的搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
在本实验中，该细菌生物质干物质含量为31％并且干物质中脂质含量为37％并包含一定量的盐。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图3。
表3显示在不同温度下所提取的油中金属含量和磷含量和油收率。
该实施例表明，来自细菌生物质的油收率随提取温度的升高而提高。磷和金属的含量随提取温度的升高而降低。在200℃下所提取总脂质量为92.6％并且磷含量为12.7ppm，总金属含量为32ppm。
表3
买施例4
300g从小球藻微藻的异养培养中获得的经过滤的湿细胞和300g庚烷称重置入1000ml的搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
在该实验中，该藻生物质干物质含量为12％并且干物质中脂质含量为43％并包含一定量的盐。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图4。
表4显示在不同温度下所提取的油中各种金属、磷的量和油收率。
表4
在200℃下所提取的藻油收率为81％，而且该油仅含30ppm的磷和11ppm的总金属。在225℃下，油收率为81％并且磷含量降低至3.5ppm而且金属含量为13ppm。
该实施例表明，当提取温度升至200℃时，来自小球藻微藻的油收率和油质量提高。
实施例5
60g从被孢霉丝状真菌的异养培养获得的经过滤的湿细胞和260g庚烷称重置入1000ml的搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
在该实验中，该真菌生物质干物质含量为38％并且干物质中脂质含量为58％并包含一定量的盐。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图5。
表5显示在不同温度下所提取的油中各种金属的量、磷的量和油收率。
表5
该实施例表明，来自丝状真菌生物质的油收率随提取温度的升高而升高。当提取温度升至200℃时，磷和金属的含量显著降低。在200℃时，所提取的油中含2ppm的磷和小于1ppm的全部所测金属。
实施例6
200g从油脂酵母属酵母培养中获得的湿细胞和200g庚烷称重置入1000ml的搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
该真菌生物质干物质含量为11％并且干物质中脂质含量为40％并包含一定量的盐。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及在150℃和200℃提取的油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Zn、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量示于表6。
表6
在100℃的实验显示油收率很低，按重量计仅为4.2％。在150℃提取时，油收率仍很低，按重量计约为38％。在200℃时，收率升高至按重量计约为86％，表明从具有该低干物质含量的溶液中提取脂质需要较高的温度。在150和200℃的两种提取中，杂质量都很低。
该实施例表明来自酵母生物质的油收率在高温下有显著的升高。来自酵母生物质的高纯度油可已经在150℃提取时获得，但油收率与200℃提取相比仍然低得多。
比较实施例1
将60g从杜氏藻培养获得的经喷雾干燥的细胞和300g庚烷称重放入1000ml搅拌压力反应器中。该容器随后被加热至预设提取温度：100℃、160℃、200℃和225℃，并保持60分钟然后使其冷却到大约30℃。在提取过程中，该细胞-溶剂混合物在该压力反应器内以500rpm的速度连续搅拌。打开反应器并通过离心(10min，4430rpm)从生物质中分离该溶剂。将该含油溶剂在旋转蒸发器中蒸发。将油称重。总脂肪酸在脂质皂化和甲基化之后用GC分析。金属和磷含量通过ICP分析确定。
该干燥过的藻生物质含大量的盐，因其在高盐海水中自养培养，磷含量也很高，原因在于总脂质中高水平的磷脂。该喷雾干燥过的干藻生物质，干重约为98％，含10％的脂质。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于在提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Al、Cr、Zn、Ni、Ba、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图6。
表7显示在不同温度下提取的油中各种金属、磷的量和油收率。
在200℃下提取的油中油收率与在100℃和160℃下相比要高(88％相比于64％和60％)，然而，杂质(金属和磷)水平在较高温度下降低。磷含量的值从100℃下的1470ppm降低至200℃下的15ppm和225℃下的6.8ppm。金属含量降低至200℃下的121ppm，相比之下100℃下的金属含量是2182ppm和160℃下的金属含量是1154ppm。
表7
该实施例表明，当使用湿藻生物质时，与使用经特定预处理(即在提取前干燥)的生物质相比，获得相当的结果。
比较实施例2
将60g从培养的红球菌细菌所获的干的冻干细胞和300g庚烷称重放入1000ml搅拌压力反应器中。用与实施例1相同的方法进行提取。
该冻干生物质的脂质含量为43％并含源于液体培养基的一定量的盐与源于膜脂的磷。
油收率(即所提取的总脂肪酸相比于提取前生物质中总脂质量)以及油中总金属(Mg、Na、Ca、Cu、Al、Cr、Ni、Mn、V、Pb)含量和磷含量与提取温度的函数关系示于图7。
表8显示在不同温度提取的油中各种金属、磷的量和油收率。
表8
该实施例表明油收率随温度的升高而提高，而磷和金属的含量则降低。
实施例7
进一步的实验(实施例7-9)使用中式工厂规模设备完成。
实施例7中所使用的压力反应器由DeDietrich制造，容积为540升而且最大运转压力为16bar(a)并且最高温度为250℃。实施例8和9中所使用的压力反应器由一家芬兰公司Japrotek制造，容积为500升而且最大运转压力为80bar(a)并且最高温度为250℃。
将152kg从被孢霉真菌的培养中所获的经过滤的湿细胞在500升搅拌压力反应器中与235kg的NESSOL LIAV230(沸点区为175-230℃的烷烃，来自Neste Oil)进行提取。提取在190℃下进行3小时，最大压力为12.5bar(a)。通过过滤分离生物质，并用水清洗溶剂相。蒸发该庚烷-油相并如实施例1分析油。
该真菌生物质的干物质含量为38％而且干物质的脂质含量为58％并含源于培养基肉汤的一定量的盐以及源于膜脂的磷。
所提取的油中油收率和杂质(磷和金属)水平在表9中显示。
表9
油收率高达80％而且根据本发明所提取油的杂质量很低。磷水平为5.6ppm并且全部所测金属远远低于1ppm，只有钠为3.1ppm。
实施例8
152kg从红球菌细菌的培养中所获的经过滤的湿细胞在500升搅拌压力反应器中与125kg庚烷和32kg乙醇进行提取。提取在200℃下进行3小时，最大压力为48bar(a)。通过过滤分离生物质，并用水清洗溶剂相。蒸发该庚烷-油相并如实施例1分析油。
该细菌生物质的干物质含量为25％而且干物质的脂质含量为30％并含源于培养基肉汤的一定量的盐以及源于膜脂的磷。
所提取的油中油收率和杂质(磷和金属)水平在表10中显示。
表10
油收率高达75％而且根据本发明所提取油的杂质量很低。磷水平为6.7ppm并且全部所测金属低于30ppm。
实施例9
150kg从被孢霉真菌的培养所获的经过滤的湿细胞在500升的搅拌压力反应器中与145kg的NESSOL LIAV110(沸点区为85-110℃的烷烃，来自Neste Oil)和64kg无水乙醇进行提取。提取在190℃下进行0.5小时，最大压力为32bar(a)。通过过滤分离生物质，并用水清洗溶剂相。蒸发NESSOL LIAV110油相并如实施例1分析所获得的油产品。
该真菌生物质的干物质含量为38％而且干物质的脂质含量为58％。生物质也含有盐和磷。
所提取的油中油收率以及磷和金属杂质的量在表11中显示。
表11

Claims (21)

1.一种从微生物生物质中回收脂质的方法，其包括以下步骤:
（I）提供湿微生物生物质进行提取并且不破坏所述生物质的细胞壁，所述湿微生物生物质含有脂质,和
（II）在170℃-300℃的高温和高压下，用包括非极性有机溶剂的液体提取剂对所述湿微生物生物质进行提取，其中所述的温度和压力的组合使得在所述生物质中的所述脂质与所述提取剂接触，和
（III）然后，从所述的提取剂中回收所提取的脂质或者用所述的提取剂回收所提取的脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中湿微生物生物质的干物质含量低于45%重量，但至少为5%重量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中湿微生物生物质的干物质含量优选低于40%重量，但至少为10%重量。
4.根据权利要求2所述的方法，其中湿微生物生物质的干物质含量至少为11%重量。
5.根据权利要求2所述的方法，其中湿微生物生物质的干物质含量为19%-38%重量。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的湿微生物生物质选自于细菌，蓝细菌，真菌，古细菌，原生生物，微生植物，浮游生物和真涡虫。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的真菌选自酵母、丝状真菌和霉菌。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述的微生植物选自藻类和微藻类。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度为175℃-270℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述温度为185℃-260℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述温度为190℃-250℃。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的提取剂包括脂族或环状C3-C16烷。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的提取剂包括己烷、庚烷、辛烷或其混合物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述的提取剂还进一步包括极性可与水混溶的溶剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的提取剂还进一步包括酒精或有机酸。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的微生物生物质中干物质与提取剂总量的比为1:1-1:20。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的微生物生物质中干物质与提取剂总量的比为1:2-1:15。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的微生物生物质中干物质与提取剂总量的比为1:2.5-1:6。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在提取前、提取过程中和提取后向生物质添加额外的水。
20.根据权利要求1-19任一项所述方法所获得的脂质在用于生产生物燃料的催化精炼过程中的应用。
21.根据权利要求1-19任一项所述方法所获得的脂质在可再生柴油生产中的应用。
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