DE102014005372B4

DE102014005372B4 - Verfahren zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen

Info

Publication number: DE102014005372B4
Application number: DE102014005372.5A
Authority: DE
Inventors: Carola Griehl; Christoph Griehl; Christian Kleinert
Original assignee: HOCHSCHULE ANHALT
Current assignee: HOCHSCHULE ANHALT
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2022-09-01
Anticipated expiration: 2034-04-09
Also published as: DE102014005372A1

Abstract

Verfahren zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen durch Extrahieren der Lipide aus wässrigen Algensuspensionen (4) während der Kultivierung der Algen unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoffen mit einer Dichte von < 1 g/cm3als Lösungsmittel (8), umfassend die folgenden Verfahrensschritte:a) Überführung eines Teils der wässrigen Algensuspension (4) aus einer Kultivierungssäule (2) mit der wässrigen Algensuspension (4) in eine räumlich von der Kultivierungssäule (2) getrennte Extraktionssäule (3),b) Inkontaktbringen dieses Teils der wässrigen Algensuspension (4) als Algenkulturtropfen (4b) mit dem Lösungsmittel (8), welches in der Extraktionssäule (3) vorliegt, wobei die Algenkulturtropfen (4b) das Lösungsmittel (8) unter Abgabe der extrazellulären Lipide in das Lösungsmittel (8) durchwandern, wobei die Kontaktzeit der wässrigen Algensuspension (4) mit dem Lösungsmittel (8) über Pumpen (16) gesteuert wird, und wobei die Algensuspension (4a) nach Extraktion der Lipide wieder der Kultivierungssäule (2) zugeführt wird,c) Entnahme des mit Lipid angereicherten Lösungsmittels (8) aus der Extraktionssäule (3), wobei die Abtrennung extrazellulärer Lipide aus den wässrigen Algensuspensionen (4) während der Kultivierung erfolgt, undd) Entfernen des Lösungsmittels (8), wobei das Lipid zurückbleibt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen, vorzugsweise Mikroalgen. In einem In-Situ-Extraktionssystem erfolgt dabei eine kontinuierliche Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Mikroalgen mittels Lösungsmittelextraktion während der Kultivierung.
Im Folgenden wird zunächst das der Erfindung zu Grunde liegende Problem dargestellt: Mikroalgen sind in der Lage, intrazellulär große Mengen an für den Menschen wertvollen Stoffen, wie Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten, zu bilden. Lipide sind organische Verbindungen, die mit unpolaren Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Hexan, aus biologischen Zellen isoliert werden können. Zu ihnen zählen neutrale Lipide, wie Fette und Wachse, die in Wasser Fettkügelchen und Öltröpfchen bilden und in den Zellen vor allem als Energiespeicher dienen. Fette sind Ester des Glycerins, also Triacylglyceride (TAGs). Je nach Konsistenz unterscheidet man feste Fette, zum Beispiel viele gesättigte Fettsäuren, und flüssige Öle, zum Beispiel viele ungesättigte Fettsäuren. In Algen lagern sich Triacylglyceride (TAGs) meist im Cytoplasma als Ölkörperchen ab. Wachse sind Ester aus langkettigen Carbonsäuren und Alkoholen mit der Kettenlänge C16 bis C36. Einige wenige Algen, wie der Stamm Botryococcus braunii, bilden auch Kohlenwasserstoffe, die den Kohlenwasserstoffen des Erdöls ähneln und somit als Erdölsubstitute in Frage kommen. Die zweite Gruppe bilden die stärker polaren Phospho- und Glykolipide. Diese bestehen aus einem hydrophoben Bereich, mit zwei Fettsäuren am Glycerin, und einen hydrophilen Bereich, mit polarer Kopfgruppe: Phosphat und Alkohol (Cholin, Ethanolamin) oder Galactose. Solche Stoffe nennt man auch amphiphil. Sie bilden in Wasser Lipiddoppelschichten aus und sind Bestandteil von Zellmembranen.
Botryococcus braunii ist eine weltweit verbreitete Grünalge, die häufig im Plankton eutropher stehender Gewässer vorkommt und sich ungeschlechtlich über 2-4-8-16 Autosporen (Bildung unbegeißelter Zellen innerhalb der Mutterzellwand) vermehrt. Sie bildet kugelförmige bis länglich ovale Zellen von 6 bis 10 (20) µm, die durch eine lipidhaltige Matrix in bis zu 1 mm großen Kolonien vereinigt sind. Dabei ordnen sich die Zellen in der Matrix trichterförmig an und werden über die spitzen Enden, die zur Mitte zeigen, zusammengehalten. Sie enthalten einen wandständigen, topfförmigen Chloroplasten mit einem Pyrenoid (enthält das Enzym Rubisco, welches CO₂ in organische Moleküle umbaut). Die Zellen akkumulieren meist im Herbst große Mengen Lipidtröpfchen im Cytoplasma, die mitunter in die umgebende Matrix und ins Wasser ausgeschieden werden. Unter welchen Bedingungen dies passiert, ist bisher nicht bekannt. Enthalten die Zellen viele Öltropfen, dann steigen die Kolonien bis zur Wasseroberfläche auf (siehe Druckschrift Karl-Heinz Linne von Berg et al.: Der Kosmos-Algenführer, Kosmos-Verlag 2012, Stuttgart, 2. Aufl., 170 f).
Botryococcus braunii tritt in unterschiedlichen Rassen (A, B und L) auf, die sich in ihren physiologischen Eigenschaften und ihrer chemischen Zusammensetzung unterscheiden. Die Lipidfraktion enthält neben polaren Lipiden bis zu 70 verschiedene Triacylglyceride (TAGs), insbesondere Triolein (siehe Druckschrift Karen M. Mac Dougall et al.: Triacylglycerol profiling of microalgae strains for biofuel feedstck by liquid chromatography-highresolution mass spectrometry, Anal Bioanal Chem 2011, 401, 2609-2616) und längerkettige Kohlenwasserstoffe, die dem Erdöl in ihrer chemischen Struktur mehr ähneln als Triacylglyceride. Rasse A bildet vor allem C₂₅-C₃₁-Alkadiene, Rasse B ungesättigte C₃₀-C₃₇-Triterpene, die als Botryococcene bezeichnet werden, und Rasse L Lycopadien (C₄₀H₇₈) (siehe Druckschriften P. Metzger, C. Largeau: Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids, App. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66, 486-496 und Galina S. Kalacheva et al.: Lipid and hydrocarbon compositions of a collection strain and a wild sample of green microalga Botryococcus, Aquatic Ecology, 2002, 36, 327-330).
Von der Spezies Botryococcus braunii ist, wie bereits erwähnt, bekannt, dass diese Alge in der Lage ist, Triacylglyceride (TAGs) und Kohlenwasserstoffe aus der Zelle auszuschleusen und an der Zelloberfläche anzulagern bzw. in das umliegende wässrige Medium abzugeben. Um diese Stoffe zu gewinnen, werden die Zellen heutzutage mittels Zentrifugation, Sedimentation oder Filtration aus der wässrigen Phase abgetrennt und getrocknet. Die an der Zellwand haftenden wertvollen Stoffe werden dann mittels klassischer Extraktionsverfahren unter Einsatz von Lösungsmitteln, wie n-Hexan oder Chloroform, gewonnen.
Die Schritte der Biomasseabtrennung sowie die Trocknung der Zellen sind dabei sehr energieintensiv und stellen einen hohen Unkostenfaktor zur Gewinnung der Produkte dar (siehe Druckschrift Moheimani NR, Cord-Ruwisch R, Raes E, Borowitzka MA (2013) Non-destructive oil extraction from Botryococcus braunii (Chlorophyta). Journal of Applied Phycology: 1-9). Des Weiteren werden die Mikroalgenzellen durch diese Vorgehensweise zerstört und sind damit nicht mehr zur Produktbildung fähig. Es muss dann eine neue Produktionscharge angesetzt werden, die mit einem hohen Kosten- und Zeitaufwand verbunden ist. Aus diesem Grund ist es nicht möglich, energetisch nutzbare Lipide, insbesondere Triacylglyceride und Kohlenwasserstoffe, welche einen niedrigen Marktwert besitzen, kostenneutral oder mit Profit zu gewinnen.
Bereits Frenz J., Largeau C., Casadevall E. (1989) Hydrocarbon recovery by extraction with a biocompatible solvent from free and immobilized cultures of Botryococcus braunii. Enzyme and Microbial Technology 11: 717-724 untersuchten die zerstörungsfreie Extraktion der Kohlenwasserstoffe aus Botryococcus braunii. Diese Arbeit beschäftigt sich vorwiegend mit dem Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf die Vitalität der Zellen in Abhängigkeit von der Kontaktzeit. Der Einfluss verschiedener Lösungsmittel auf die Lipidausbeute wurde ebenfalls von einigen anderen Forschungsgruppen untersucht (siehe Druckschriften Moheimani NR, Cord-Ruwisch R, Raes E, Borowitzka MA (2013) Non-destructive oil extraction from Botryococcus braunii (Chlorophyta). Journal of Applied Phycology: 1-9, und Samori C, Torri C, Samori G, Fabbri D, Galletti P, Guerrini F, Pistocchi R, Tagliavini E (2010) Extraction of hydrocarbons from microalga Botryococcus braunii with switchable solvents. Bioresource Technology 101: 3274-3279), jedoch nur in batch-Versuchen und nicht unter kontinuierlichen Bedingungen.
Hejazi und Wijffels (siehe Druckschrift Hejazi MA, Wijffels RH (2004) Milking of microalgae. Trends in Biotechnology 22: 189-194) beschäftigten sich mit der In-Situ-Extraktion von β-Carotin aus Dunaliella salina. Hier wurde ein Reaktor entwickelt, welcher eine Kultivierung mit gleichzeitiger Extraktion der Produkte ermöglicht. Bei diesem Reaktor befinden sich beide Phasen, die Phase der Kultur und die Phase des Lösungsmittels, in einem System, und das Lösungsmittel wird durch die Kultur gepumpt und sammelt sich aufgrund der geringeren Dichte über der Kultursuspension an. Aufgrund des ständigen Kontaktes der Kultur zum Lösungsmittel sowie des Abschottens der Kultur nach oben sind toxische Effekte sowie ein geringerer Stoffübergang nicht auszuschließen.
Die WO 2012/ 062 962 A1 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Lipiden aus mikrobieller Biomasse. Ein solches Verfahren umfasst die Bereitstellung feuchter mikrobieller Biomasse, die Lipide enthält, für die Extraktion, ohne die Zellwände der Biomasse zu zerstören, und die anschließende Extraktion der feuchten mikrobiellen Biomasse mit einem flüssigen Extraktionsmittel bei erhöhter Temperatur von mindestens 170 °C und erhöhtem Druck. Die Kombination aus Temperatur und Druck ist derart gestaltet, dass die Lipide in den Zellen mit dem Extraktionsmittel in Kontakt kommen. Anschließend werden die extrahierten Lipide aus oder mit dem Extraktionsmittel gewonnen.
Die WO 2012/ 087 509 A1 hat ein Verfahren zur Abtrennung von gelöstem Material aus einem Algenzellen-Zuführungsstrom zum Gegenstand. Der Algenzellen-Zuführungsstrom, der das gelöste Material enthält, kann in einen Teil eines Mischer-Abscheider-Gefäßes eingeleitet werden, und ein Lösungsmittel-Zuführungsstrom kann in einen anderen Teil des Gefäßes eingeleitet werden, um sich mit dem Algenzellen-Zuführungsstrom zu vermischen, mit dem Ziel, zumindest einen Teil des gelösten Materials von dem Algenzellen-Zuführungsstrom abzutrennen.
Aus der WO 2008/ 135 382 A2 ist ein Verfahren zur Extraktion von zellulären Verbindungen aus Mikroorganismen bekannt, welches folgende Schritte umfasst: einen Schritt der Extraktion der zellulären Verbindungen aus den Mikroorganismen, wobei der Schritt der Extraktion getrennt von einem Schritt der Kultivierung und unter Bedingungen der Biokompatibilität mit den Mikroorganismen durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einem Schritt zur Gewinnung der zellulären Verbindungen und mindestens einem Schritt zur Rückführung der Mikroorganismen in den Schritt der Kultivierung. Dabei wird jeder Schritt kontinuierlich durchgeführt.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein energiesparendes und kostengünstiges Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung für die Gewinnung von wertvollen Stoffen, wie Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten, unter Nutzung von Mikroalgen bereitzustellen, bei denen die Mikroalgenzellen effektiv eingesetzt werden.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen nach Anspruch 1 gelöst. Die Abtrennung erfolgt durch Extrahieren der Lipide aus wässrigen Algensuspensionen während der Kultivierung der Algen und unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln. Das Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte:

a) Überführung eines Teils der wässrigen Algensuspension aus einer Kultivierungssäule mit der Algenkultur in eine räumlich von der Kultivierungssäule getrennte Extraktionssäule,
b) Inkontaktbringen dieses Teils der wässrigen Algensuspension als Algenkulturtropfen mit dem Lösungsmittel, welches in der Extraktionssäule vorliegt, wobei die Algenkulturtropfen das Lösungsmittel unter Abgabe der extrazellulären Lipide in das Lösungsmittel durchwandern,
c) Entnahme des mit Lipid angereicherten Lösungsmittels aus der Extraktionssäule und
d) Entfernen des Lösungsmittels, vorzugsweise durch Abdampfen, wobei das Lipid zurückbleibt.

Mit Hilfe eines In-Situ-Extraktionssystems lassen sich die extrazellulären Lipide während der Kultivierung extrahieren. Vorzugsweise werden als Algenrohstoff Mikroalgen verwendet. Die Algen bzw. Mikroalgen werden bei diesem Verfahren nicht beschädigt und sind damit kontinuierlich in der Lage, Lipide zu bilden, so dass eine zeit- und kostenintensive Anzucht einer neuen Produktionskultur vermieden werden kann. Des Weiteren entfallen durch diese Erfindung die energie- und kostenintensiven Schritte der Abtrennung und Trocknung der Mikroalgenzellen.
Gemäß der Erfindung werden als Lösungsmittel mit Wasser nicht mischbare Kohlenwasserstoffe mit einer Dichte von < 1 g/cm³, insbesondere n-Hexan, eingesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das entfernte Lösungsmittel wiedergewonnen und erneut in die Extraktionssäule eingebracht. Vorzugsweise wird das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt und durch Kondensation wiedergewonnen.
Gemäß der Erfindung wird die Algensuspension nach Extraktion der Lipide wieder der Kultivierungssäule zugeführt. Die Abtrennung extrazellulärer Lipide aus Algensuspensionen erfolgt während der Kultivierung.
Vorteil dieses In-Situ-Extraktionssystems ist dabei die Unterteilung in den Kultivierungs- und Lösungsmittelbereich, welche räumlich getrennt sind. Das Lösungsmittel kann, ohne die Kultivierung zu beeinflussen, entfernt werden. Dadurch ist eine toxische Wirkung des Lösungsmittels auf die Zellen vermindert. Über Pumpen wird die Kontaktzeit der Kultur mit dem Lösungsmittel gesteuert.
Im Gegensatz zu dem System gemäß der Druckschrift Hejazi MA, Wijffels RH (2004) Milking of microalgae. Trends in Biotechnology 22: 189-194 ist die Extraktion räumlich von der Kultur getrennt, womit toxische Effekte des Lösungsmittels auf die Kultur minimiert werden. Da bei dieser Erfindung die Kultur durch das Lösungsmittel geleitet wird und nicht das Lösungsmittel durch die Kultur, ist die Kontaktzeit der Kultur mit dem Lösungsmittel über den Volumenstrom exakt einstellbar und steuerbar.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass dieses System die zerstörungsfreie, energie- und kostenarme Extraktion von extrazellulär angelagerten Lipiden zum Beispiel aus Botryococcus braunii-Kulturen während der Kultivierung ermöglicht. Die extrahierten Lipide können durch Veresterung zu Biodiesel und/oder durch Cracken zu anderen Kraftstoffen weiterverarbeitet werden.
Das Lösungsmittel ist zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens auswechselbar und räumlich vom Kultivierungsbereich getrennt, womit toxische Effekte auf die Zellen vermieden werden können. Des Weiteren ist der Einsatz verschiedenster Lösungsmittel, je nachdem welche Stoffe gewonnen werden sollen, durch die räumliche Trennung möglich. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Kontaktzeit der Algenkultur mit dem Lösungsmittel über Pumpen gesteuert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Durchführung des oben genannten Verfahrens zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen in einer Vorrichtung, die dafür geeignet ist. Eine entsprechende Vorrichtung umfasst als wesentliche Bestandteile eine Kultivierungssäule und eine Extraktionssäule, die räumlich voneinander getrennt sind. Dabei ist die Kultivierungssäule mit der Extraktionssäule über einen Bypass verbunden, über den mittels Pumpe, Druck oder Schwerkraft die Algenkultur aus der Kultivierungssäule in die Extraktionssäule überführt werden kann. Des Weiteren sind die Kultivierungssäule und die Extraktionssäule über eine Verbindungsleitung, über die extrahierte Algensuspension aus der Extraktionssäule in die Kultivierungssäule gelangen kann, miteinander verbunden. Die Kultivierungssäule weist darüber hinaus eine Zuluftleitung und eine Abluftleitung auf. An der Extraktionssäule befindet sich ein Lösungsmittelablauf oberhalb des Bodens der Extraktionssäule und ist von diesem derart beabstandet, dass sich unterhalb des Lösungsmittelablaufs und oberhalb des Bodens eine Phasengrenzschicht zwischen dem Lösungsmittel und der extrahierten wässrigen Algensuspension ausbilden kann.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:

1: eine schematische Darstellung einer Vorrichtung und eines Verfahrens zur kontinuierlichen Abtrennung extrazellulärer Substanzen während der Kultivierung mittels In-Situ-Extraktion,
2: eine detailliertere schematische Darstellung einer Vorrichtung aus einer Kultivierungssäule, einer Extraktionssäule und einer Pumpe und eines Verfahrens zur kontinuierlichen Abtrennung extrazellulärer Substanzen mittels In-Situ-Extraktion,
3: eine Schnittdarstellung einer Schraubverbindung zwischen der Kultivierungssäule als Hauptsäule und der Extraktionssäule als Nebensäule,
4: eine zweidimensionale Darstellung der Kultivierungssäule zur Kultivierung von Mikroalgen,
5: eine zweidimensionale Darstellung einer Extraktionssäule als Extraktionsreaktor,
6: eine zweidimensionale Darstellung des Kopfes einer Kultivierungssäule und
7: eine zweidimensionale Darstellung des Kopfes der Extraktionssäule.

Die 1 zeigt eine eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 1 und eines Verfahrens zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen. Die Vorrichtung 1 ermöglicht eine In-Situ-Extraktion zur kontinuierlichen Abtrennung der extrazellulären Substanzen während der Kultivierung. Das In-Situ-Extraktionssystem umfasst dabei zwei wesentliche Bereiche, eine Kultivierungssäule 2 und eine Extraktionssäule 3, wodurch die Extraktion von der Kultivierung der Algen getrennt ist. Über einen Zulufteinlass 5 kann die Algenkultur in der Kultivierungssäule 2 mit Kohlendioxid (CO₂) und Luft versorgt werden. Die Abluft kann zum Druckausgleich über einen Abluftauslass 6 entweichen.
Bei der in 1 ersichtlichen In-Situ-Extraktion wird eine wässrige Algensuspension 4 über einen Bypass 7 mittels Pumpe, Druck oder Schwerkraft aus der Kultivierungssäule 2 in die Extraktionssäule 3 überführt. In dieser Extraktionssäule 3 durchwandert die wässrige Algensuspension 4 das leichtere und in Wasser unlösliche Lösungsmittel 8, die extrazellulären Substanzen werden aufgrund gleicher Polarität in das Lösungsmittel 8 gezogen und die extrahierte Algensuspension 4a reichert sich am Boden 9 der Extraktionssäule 3 an.
Über eine Verbindungsleitung 10 der Extraktionssäule 3 zur Kultivierungssäule 2 gelangt die überschüssige extrahierte Algensuspension 4a in die Kultivierungssäule 2 zurück, so dass der Füllstand 11 und die Phasengrenzschicht 12 zwischen extrahierter Algensuspension 4a und Lösungsmittel 8 in der Extraktionssäule 3 stetig auf gleicher Höhe bleiben. Über den Lösungsmittelablauf 13, welcher sich kurz über der Phasengrenzschicht 12 von extrahierter Algensuspension 4a und Lösungsmittel 8 befindet, kann das Lösungsmittel 8 während der Extraktion entnommen und ausgetauscht werden. Die komplette Entleerung der Extraktionssäule 3 erfolgt über den Ablauf 14 am Boden 9 der Extraktionssäule 3. Zum Druckausgleich beim Ablassen des Lösungsmittels 8 bzw. der Algensuspension weist die Extraktionssäule 3 eine Druckausgleichsöffnung 15 auf.
Um das Verfahren optimal auf den jeweiligen Organismus anzupassen, kann die Steuerung der effektiven Extraktionszeit der wässrigen Algensuspension 4 in der Lösungsmittelphase 6 sowohl über das Volumenverhältnis der wässrigen Algensuspension 4 zum Lösungsmittel 8 als auch über Drosselung des Zulaufs und Ablaufs der Extraktionssäule 3 erfolgen.
Die 2 stellt anhand eines Ausführungsbeispiels die Durchführung einer erfindungsgemäßen In-Situ-Extraktion schematisch dar, wobei hier die Vorrichtung 1 detaillierter dargestellt ist als in 1. Das In-Situ-Extraktionssystem besteht demnach aus zwei Bereichen, der Kultivierungssäule 2 als Kultivierungssystem und der Extraktionssäule 3, wodurch die Extraktion von der Kultivierung der Algen getrennt ist. Über ein Zulufteinlassventil V1 wird die Algenkultur in der Kultivierungssäule 2 mit CO₂ und Luft versorgt. Die Abluft kann zum Druckausgleich über ein Abluftauslassventil V7 entweichen. Am Bypass 7 ist eine Pumpe 16 vorgesehen, wobei entlang des Bypasses 7 vor und nach der Pumpe 16, bezogen auf die Pumprichtung 17, Pumpenventile V8 und V6 angeordnet sind. Die Pumpe 16 kann die wässrige Algensuspension 4 über das Ventil V8 ansaugen und diese aus der Kultivierungssäule 2 über den Bypass 7 und das Ventil V6 in die Extraktionssäule 3 transferieren, die ein mit Wasser unmischbares, unpolares Lösungsmittel 8, vorzugsweise Hexan, enthält. Aufgrund der geringeren Dichte des Lösungsmittels 8 gegenüber der wässrigen Algensuspension 4 schwimmt das Lösungsmittel 8 auf der wässrigen Algensuspension 4. Die Algenkulturtropfen 4b, welche durch ein Tauchrohr 18 in der Extraktionssäule 3 entstehen, wandern durch das Lösungsmittel 8 und treten an der Phasengrenzschicht 12 zwischen wässriger Algensuspension 4 und Lösungsmittel 8 wieder in die Algenkultur ein. Diese Phasengrenzschicht 12 befindet sich dabei kurz unterhalb des Lösungsmittelablaufs 13 mit dem Ventil V4. Mit Hilfe des unpolaren Lösungsmittels 8 in der Extraktionssäule 3 können die extrazellulären lipophilen Lipide aus den Algenkulturtropfen 4b extrahiert werden. Über die Ventile V3 und V2 kann dann die extrahierte Algensuspension 4a wieder in die Kultivierungssäule 2 eintreten.
Die Extraktion der extrazellulären Lipide der Mikroalgenkultur B. braunii mit Hilfe der In-Situ-Extraktion wird gestartet, indem das Verbindungsventil V2 an der Verbindungsleitung 10 zwischen Extraktionssäule 3 und Kultivierungssäule 2 geöffnet wird. Durch dieses Öffnen ist der Ablauf der extrahierten Algensuspension 4a zurück in die Kultivierung möglich. Danach werden am Bypass 7 vor und nach der Pumpe 16, bezogen auf die Pumprichtung 17, die Pumpenventile V8 und V6 geöffnet, um einen Transfer der wässrigen Algensuspension 4 von der Kultivierungssäule 2 in die Extraktionssäule 3 zu gewährleisten. Das Ventil V4 am Lösungsmittelablauf 13 bleibt geschlossen und das Ventil V3 am Ablauf 14 am Boden 9 ist in Richtung Ventil V2 geöffnet. Nach der Befüllung der Extraktionssäule 3 mit Lösungsmittel 8 wird die Pumpe 16 eingeschaltet. Die Durchflussmenge und die Extraktionszeit ergeben sich aus der effektiven Kontaktzeit der Algenkultur zum Lösungsmittel 8, welche für jeden Organismus spezifisch ist.
Nach einer vorbestimmten Zeit der Lipidanreicherung in dem Lösungsmittel 8 erfolgt eine Auswechslung des Lösungsmittels 8. Muss das Lösungsmittel 8 während der Extraktion gewechselt beziehungsweise erneuert werden, so werden die Ventile V2 und V6 geschlossen. Das Ventil V6 muss geschlossen werden, um den Volumenstrom der wässrige Algensuspension 4 zu stoppen. Das Ventil V2 muss geschlossen werden, um beim Ablassen des Lösungsmittels 8 einen Rückstrom der Algenkultur aus der Kultivierungssäule 2 zu vermeiden. Für den Druckausgleich muss ein Druckausgleichventil V5, das sich an einem abnehmbaren Kopf 19 der Extraktionssäule 3 befindet, geöffnet werden. Über das Öffnen des Ventils V4 kann das Lösungsmittel 8 dann abgelassen werden. Aufgrund dessen, dass sich die Phasengrenzschicht 12 zwischen wässriger Algensuspension 4 und Lösungsmittel 8 kurz unterhalb des Lösungsmittelablaufs 13 und Ventil V4 befindet, wird bei der Entleerung des Lösungsmittels 6 nur das Lösungsmittel 8 ablaufen und nicht die extrahierte Algensuspension 4a. Über das Ventil V5 an der Druckausgleichsöffnung 15 kann die Lösungsmittelsäule in der Extraktionssäule 3 dann wieder mit neuem Lösungsmittel 8 aufgefüllt werden. Über den abnehmbaren Kopf 19 der Extraktionssäule 3 wird dann wieder frisches Lösungsmittel 8 nachgefüllt und durch das Öffnen der Ventile V2 und V6 die Extraktion wieder in Gang gesetzt.
Das entfernte, mit Lipid angereichte Lösungsmittel 8 wird vom Lipid abgetrennt. Dazu eignet sich als Verfahren zur Abtrennung beispielsweise das Verdampfen, vorzugsweise über einen Rotationsverdampfer, wobei der zu gewinnende Lipid-Extrakt als Rückstand verbleibt. Das abgetrennte Lösungsmittel 8 kann als Extraktionsmittel wiederverwendet, das heißt der Extraktionssäule 3 über das Ventil V5 wieder zugeführt werden.
Eine komplette Entleerung der Extraktionssäule 3 erfolgt nach Beendigung der Extraktion oder gegebenenfalls, wenn die Algenkultur erneuert bzw. mit Frischkultur versehen werden muss, etwa bei einer unvorhergesehenen Kontamination.
Für eine komplette Entleerung der Extraktionssäule 3 müssen die Pumpe 16 ausgeschaltet sowie die Ventile V8 und V6 geschlossen werden. Um einen Rücklauf der Algenkultur in die Extraktionssäule 3 zu verhindern, muss Ventil V2 geschlossen werden. Über das Öffnen von Ventil V4 wird das Lösungsmittel 8 mit den extrahierten extrazellulären Lipiden abgelassen. Nach dem Ablassen des Lösungsmittels 8 wird Ventil V4 wieder geschlossen. Für die Entleerung wird nun das Zweiwegeventil V3 geöffnet. Durch das Öffnen von Ventil V3 wird die restliche extrahierte Algensuspension 4a, welche sich noch in der Extraktionssäule 3 befindet, abgelassen. Für den Druckausgleich muss Ventil V5 jeweils geöffnet sein. Das mit den extrazellulären Lipiden angereicherte Lösungsmittel 8 wird nach Beendigung der Extraktion zusammengeführt, gefiltert und in einem Verdampfungsrotameter rückgewonnen.
Die 3 zeigt eine Detailansicht einer Schraubverbindung 20 zwischen der Kultivierungssäule 2 als Hauptsäule und der Extraktionssäule 3 als Nebensäule in Form einer Schnittdarstellung. Dabei zeigt Abbildung a) die offene Schraubverbindung. Dafür ist im unteren Bereich der Seitenwand der Kultivierungssäule 2 ein im Wesentlichen zylindrischer Zulaufstutzen 21 für das Einbringen eines Mediums in die Kultivierungssäule 2 ausgebildet, der schräg nach oben ausgerichtet ist. Dieser Zulaufstutzen 21 korrespondiert an seinem Außenumfang 22, das heißt durch ein Außengewinde, mit der Innenseite, das heißt dem Innengewinde einer ebenfalls zylindrischen Schraubkappe 23, die wiederum die Verbindungsleitung 10 mit dem Ventil V2 umschließt. Die 3 zeigt in Abbildung b) die Schraubverbindung 20 im geschlossenen Zustand. Dabei sind die Innenseite der Schraubkappe 23 und der Außenumfang 22 des Zulaufstutzens 21 miteinander verbunden, wobei ein Ende der Verbindungsleitung 10 mit einem radialen Abstand von der Innenumfangsfläche des Zulaufstutzens 21 koaxial in den Zulaufstutzen 21 hineinragt. Vorzugsweise erfolgt die Verbindung zwischen Zulaufstutzen 21 und der Schraubkappe 23 unter Verwendung einer (nicht gezeigten) Dichtung, die die Verbindungsleitung 10 ringförmig umschließt.
Die 4 zeigt eine zweidimensionale Darstellung der Kultivierungssäule 2 zur Kultivierung von Mikroalgen. Im unteren Teil weist diese Kultivierungssäule 2 einen Zulufteinlass 5 mit Zuluftventil V1 sowie den bereits erwähnten Zulaufstutzen 21 auf. Im oberen Teil ist eine Schliffhülse 24 für die Aufnahme des Schliffkerns des abnehmbaren Säulenkopfes der Kultivierungssäule 2 ausgebildet.
Die 5 zeigt eine zweidimensionale Darstellung einer Extraktionssäule 3, die als Extraktionsreaktor im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Am Boden 9 der Extraktionssäule 3 ist die Verbindungsleitung 10 vorgesehen, wobei zwischen dem Boden 9 und dem Verbindungsventil V2 ein Zweiwegeventil V3 angeordnet ist, mit dem die komplette Entleerung der Extraktionssäule 3 über den Ablauf 14 ohne Rückführung in die Kultivierungssäule 2 eingestellt werden kann. An der Extraktionssäule 3 ist darüber hinaus der Lösungsmittelablauf 13 vorgesehen, der sich oberhalb des Bodens 9 der Extraktionssäule 2 befindet und von diesem ausreichend beabstandet ist, dass sich unterhalb des Lösungsmittelablaufs 13 und oberhalb des Bodens 9 eine Phasengrenzschicht zwischen dem Lösungsmittel und der extrahierten Algensuspension ausbilden kann. Darüber hinaus ist im oberen Teil der Extraktionssäule 3 eine Schliffhülse 25 für die Aufnahme des Schliffkerns des abnehmbaren Kopfes der Extraktionssäule 3 ausgebildet.
Die 6 zeigt eine zweidimensionale Darstellung des Säulenkopfes 26 einer Kultivierungssäule, wobei ein Schliffkern 27 mit der Schliffhülse 24 der Kultivierungssäule korrespondiert. In den Säulenkopf 26 integriert ist ein Steigrohr 28 mit dem Pumpenventil V8 als Teile des Bypasses zur Überführung eines Teils der Algensuspension aus der Kultivierungssäule in die Extraktionssäule. Ebenso ist in den Säulenkopf 26 der Abluftauslass 6 mit dem Abluftauslassventil V7 integriert.
Schließlich zeigt die 7 eine zweidimensionale Darstellung des abnehmbaren Kopfes 19 der Extraktionssäule mit dem Schliffkern 29. In diesen abnehmbaren Kopf 19 der Extraktionssäule sind sowohl das Tauchrohr 18 und das Pumpenventil V6 als auch die Druckausgleichsöffnung 15 mit dem Druckausgleichsventil V5 integriert.
Vorkulturen

Die Botroyococcus-Stämme, die von den Stammsammlungen Culture Collection of Algae Göttingen, Deutschland (SAG); Culture Collection of Algae Austin Texas, USA (UTEX); Culture Collection of Algae and Protozoa Argyll Schottland, UK (CCAP); Scandinavian Culture Collection of Algae and Protozoa Kopenhagen, Dänemark (SCCAP); Coimbra Collection of Algae Coimbra, Portugal (ACOI); der Culture Collection of Autotropic Organisms Trebon, Tschechische Republick (CCALA) unter folgenden Namen bezogen wurden, nämlich

Botryococcus braunii	SAG 30.81
Botryococcus braunii	SAG 807/1
Botryococcus braunii	UTEX 572
Botryococcus braunii	UTEX 2441
Botryococcus braunii	CCAP 807/2
Botryococcus braunii	ACOI 58
Botryococcus braunii	ACOI 1257
Botryococcus braunii	SCCAP K-1489
Botryococcus sp.	SCCAP K-1761
Botryococcus protuberans	CCALA 779,

werden jeweils als einzelner Stamm in einen Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von V = 250 ml überführt, der mit 100 ml sterilisiertem modifizierten BG11-Medium mit der in der Tabelle 2 aufgeführten Medienzusammensetzung gefüllt ist. Die Botryococcus-Stämme werden bei einer Temperatur von 25°C, kontinuierlicher Beleuchtung (Lichtintensität = 50 µmol Photonen*m^-2*s^-1) und einer Schüttlung von 110 rpm für mindestens 21 Tage kultiviert. Die Subkultivierung erfolgt für mindestens 21 Tage in 2 L-Doppelmantel-Glaszylindern (h = 50 cm, d = 8 cm) bei einer Startkonzentration der Biomasse von 0,1 g*L^-1 TS, bei 25°C, steriler Belüftung (Filter: 0,45 µm Porendurchmesser) mit einem Luft/CO₂-Gemisch (1 % CO₂ v/v) und einer Begasungsrate von 1 vvm. Die Beleuchtungsintensität beträgt durchgängig 100 µmol Photonen*m^-2*s^-1 , es werden 6 PHILIPS Leuchtstoffröhren à 36 W (Tageslicht 865) als Lichtquelle eingesetzt.

Kultivierung
Für die zerstörungsfreie Extraktion der extrazellulären Lipide aus den Botryococcus-Kulturen werden diese in die Kultivierungssäule 2 (h = 50 cm, d = 9 cm) der Extraktionsapparatur (siehe 2) überführt. Die Ausgangskultur wird mit einer bestimmten Menge modifiziertem BG11-Medium auf 2 I Gesamtvolumen aufgefüllt, sodass eine Biomassekonzentration von mindestens 0,5 g*l^-1 Trockensubstanz erreicht wird. Die Kultivierung erfolgt bei 25°C, einer Belüftung mit einem Luft/CO₂-Gemisch (1 % CO₂ v/v) und einer Begasungsrate von 1 vvm. Die Beleuchtungsintensität beträgt durchgängig 100 µmol Photonen*m^-2*s^-1, es werden 3 BRILONER Leuchtstoffröhren à 13 W (kalt weiß 840) als Lichtquelle eingesetzt.
Extraktion
Die Extraktion der extrazellulären Lipide erfolgt in der Extraktionssäule 3 (h = 45 cm, d = 3 cm) mit Hilfe des Lösungsmittels 8 n-Hexan. Vor Beginn der Extraktion werden alle benötigten Verbindungen zwischen Kultivierungssäule 2 und Extraktionssäule 3 geöffnet. Über eine Pumpe 16 wird die Kultur aus der Kultivierungssäule 2 in die Extraktionssäule 3 transferiert und gelangt über den Rücklauf zurück in die Kultivierungssäule 2. Zum Einleiten der Extraktion wird dann 150 ml n-Hexan (Lösungsmittel 8) über die Öffnung der Extraktionssäule 3 in diese gegeben. Die wässrige Algensuspension 4 wandert durch das leichtere, in Wasser unlösliche Lösungsmittel 8 zum Boden 9 der Extraktionssäule 3 und gelangt dort zurück in die Kultivierungssäule 2. Der eingestellte Volumenstrom sowie die Dauer des Extraktionsprozesses hängen maßgeblich von der effektiven Extraktionszeit, das heißt von der effektiven Kontaktzeit der wässrigen Algensuspension 4 mit dem Lösungsmittel 8 beim Durchwandern der Extraktionssäule 3, welche für die einzelnen Arten spezifisch ist, ab (siehe Tabelle 1).

Nach der Beendigung der Extraktion wird das Lösungsmittel 8 mittels Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 40 °C rückgewonnen. Die bis zur Trockne eingeengten extrahierten Lipide werden bei niedrigen Temperaturen (-20°C) gelagert. Tabelle 1

Stamm	*effektive Extraktionszeit [sd** ^-1 ]	*durchschnittliche Lipidausbeute [mgl** ^1* d ^-1 ]	Lipidklasse [% Lipidextrakt)
Stamm	*effektive Extraktionszeit [sd** ^-1 ]	*durchschnittliche Lipidausbeute [mgl** ^1* d ^-1 ]	C20-30	SQ	CE	TG	DG	FAME	R
SAG 807/1	<30	3,42	28,2	-	22,9	-	-	-	48,9
CCALA 779	<27	5,27	k.A.
CCAP 807/2	<12	5,47	22,1	-	8,3	-	-	22,7	46,9
SAG 30.81	<12	19,52	4,4	-	7,3	6,2	-	21,7	60,4
SCCAP 1761	<12	29,23	19,6	10,7	14,5	10,0	1,2	8,8	35,2

C20-30	neutrale Kohlenwasserstoffe
SQ	Squalen
CE	Cholesterolester
TG	Triacylglyceride
DG	Diacylglyceride
FAME	Fettsäuremethylester
R	unbestimmbarer Rest

Medienzusammensetzung

Tabelle 2

Komponente	*Menge [mgl** ^-1 ]
NaNO₃	1500
K₂HPO₄ * 3 H₂O	80
MgSO₄ * 7 H₂O	75
CaCl₂ * 2 H₂O	36
Zitronensäure	6
Ammoniumeisen(III)-citrat	6
EDTA	1
Na₂CO₃ H₃BO₃	2 0,061
MnSO₄ * H₂O	0,169
ZnSO₄ * 7 H₂O CuSO₄ * 5 H₂O	0,287 0,0025
(NH₄)₆Mo₇O₂₄ * 4 H₂O	0,0125

Bezugszeichenliste

1: Vorrichtung (zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden)
2: Kultivierungssäule
3: Extraktionssäule
4: wässrige Algensuspension
4a: extrahierte Algensuspension
4b: Algenkulturtropfen
5: Zulufteinlass
6: Abluftauslass
7: Bypass
8: Lösungsmittel
9: Boden
10: Verbindungsleitung
11: Füllstand (der Extraktionssäule)
12: Phasengrenzschicht (zwischen Kultursuspension und Lösungsmittel)
13: Lösungsmittelablauf (der Extraktionssäule)
14: Ablauf am Boden 9 (der Extraktionssäule)
15: Druckausgleichsöffnung
16: Pumpe
17: Pumprichtung
18: Tauchrohr
19: abnehmbarer Kopf der Extraktionssäule
20: Schraubverbindung
21: Zulaufstutzen
22: Außenumfang des Zulaufstutzens 21
23: Schraubkappe
24: Schliffhülse (der Kultivierungssäule 2)
25: Schliffhülse (der Extraktionssäule 2)
26: Säulenkopf (der Kultivierungssäule 2)
27: Schliffkern
28: Steigrohr
29: Schliffkern
V1: Zuluftventil, Ventil
V2: Verbindungsventil, Ventil
V3: Zweiwegeventil, Ventil
V4: Auslassventil, Ventil
V5: Druckausgleichsventil, Ventil
V6: Ventil,
V7: Abluftauslassventil, Ventil
V8: Pumpenventil, Ventil

Claims

Verfahren zur Abtrennung von extrazellulären Lipiden aus Algen durch Extrahieren der Lipide aus wässrigen Algensuspensionen (4) während der Kultivierung der Algen unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoffen mit einer Dichte von < 1 g/cm³ als Lösungsmittel (8), umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Überführung eines Teils der wässrigen Algensuspension (4) aus einer Kultivierungssäule (2) mit der wässrigen Algensuspension (4) in eine räumlich von der Kultivierungssäule (2) getrennte Extraktionssäule (3), b) Inkontaktbringen dieses Teils der wässrigen Algensuspension (4) als Algenkulturtropfen (4b) mit dem Lösungsmittel (8), welches in der Extraktionssäule (3) vorliegt, wobei die Algenkulturtropfen (4b) das Lösungsmittel (8) unter Abgabe der extrazellulären Lipide in das Lösungsmittel (8) durchwandern, wobei die Kontaktzeit der wässrigen Algensuspension (4) mit dem Lösungsmittel (8) über Pumpen (16) gesteuert wird, und wobei die Algensuspension (4a) nach Extraktion der Lipide wieder der Kultivierungssäule (2) zugeführt wird, c) Entnahme des mit Lipid angereicherten Lösungsmittels (8) aus der Extraktionssäule (3), wobei die Abtrennung extrazellulärer Lipide aus den wässrigen Algensuspensionen (4) während der Kultivierung erfolgt, und d) Entfernen des Lösungsmittels (8), wobei das Lipid zurückbleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel (8) n-Hexan eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Algenrohstoff Mikroalgen eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das entfernte Lösungsmittel (8) wiedergewonnen und erneut in die Extraktionssäule (3) eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel (8) durch Abdampfen entfernt und durch Kondensation wiedergewonnen und anschließend erneut in die Extraktionssäule (3) eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die extrahierten Lipide durch Veresterung zu Biodiesel und/oder durch Cracken zu anderen Kraftstoffen weiterverarbeitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung des Verfahrens eine Vorrichtung verwendet wird, umfassend die Kultivierungssäule (2) und die Extraktionssäule (3), die räumlich voneinander getrennt sind und die einerseits über einen Bypass (7) zur Überführung der wässrigen Algensuspension (4) von der Kultivierungssäule (2) in die Extraktionssäule (3) und andererseits über eine Verbindungsleitung (10), über die extrahierte Algensuspension (4a) aus der Extraktionssäule (3) in die Kultivierungssäule (2) überführbar ist, miteinander verbunden sind, wobei die Kultivierungssäule (2) eine Zuluftleitung (5) und eine Abluftleitung (6) aufweist und an der Extraktionssäule (3) ein Lösungsmittelablauf (13) sich oberhalb des Bodens (9) der Extraktionssäule (3) befindet und von diesem derart beabstandet ist, dass sich unterhalb des Lösungsmittelablaufs (13) und oberhalb des Bodens (9) eine Phasengrenzschicht (12) zwischen dem Lösungsmittel (8) und der extrahierten wässrigen Algensuspension (4a) ausbilden kann.