CN114207098A - 复杂乳液的剪切诱导的相转化用于从生物质中回收有机成分 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从水性生物质中回收有机成分的方法，在该方法中包括以下步骤：(i)提供包含有机成分的水性生物质；(ii)处理水性生物质使得从生物质的细胞内释放出细胞内有机成分用以形成生物质悬浮液；(ii)将水不混溶性成分添加到生物质悬浮液中以形成包含生物质和水不混溶性成分的混合物；(iv)包含生物质和水不混溶性成分的混合物经受高剪切以形成水不混溶性成分包水的乳液；(v)从水相/水性相中分离出水不混溶性成分相。

Description

复杂乳液的剪切诱导的相转化用于从生物质中回收有机成分
技术领域
本发明涉及从生物质中回收目的有机成分(component)。特别地，本发明涉及一种从水性生物质(aqueous biomass)系统中回收有机成分的方法(process)。该方法适用于多种生物质，以及特别适用于从水藻(藻(algae))、植物(或其部分)、真菌、细菌、原生动物及其组合中回收有机成分。
背景技术
生物质用于生产许多人类感兴趣的有机成分。这是因为可以作为生物质培育的生物体(organisms)的范围广泛，包括水藻、植物(或其部分)、真菌、细菌、原生动物及其组合。由于可以培育/培养以生产生物质的生物体种类繁多，因此相应地可以回收的有机成分也种类繁多。因此，生物质可用于生成以油或碳水化合物形式存在的生物能源的原料，也可用于生产人类食品和/或动物/水产养殖饲料以及作为进一步精加工的化学前体。
生物质还可用于生产有机成分，如脂质、碳水化合物和蛋白质，这些成分可用作动物和水产养殖的饲料补充剂以及人类食品的营养补充剂和组成(ingredient)。
生物质可以由陆生植物、异养微生物或光合自养(photoautotrophic)水藻产生。特别感兴趣的生物质的示例是水藻生物质。水藻生物质的生产特别有吸引力，因为水藻在适量的二氧化碳和阳光存在下就能生长，所以水藻生物质生产可以在相对大的规模内进行，而不需要大片的耕地或有机碳源。此外，由于水藻的高生产力，生物质培育/培养方法的总产量通常将高于每单位面积的土地(land)的陆地作物，并且可以全年进行收获。
水藻生物质可用于生产大量感兴趣的有机成分，通常是脂质、色素、蛋白质和碳水化合物，其中甘油三酯脂质(油)通常是来自水藻生物质的所需的可提取(extractable)的有机成分。这种类型的脂质广泛应用于各种行业，例如生物燃料生产、食品添加剂、化妆品和医疗保健。
虽然水藻和异养微生物生产目的有机成分的能力通常是众所周知的，但生物质的应用却受到提取和回收步骤的限制。一般来说，从生物质生产产品的商业方法是能源密集型的，可能使用有毒溶剂并且通常非常昂贵。这限制这些方法仅应用在高价值产品的回收中。
举例来说，从水藻生物质中提取脂质通常涉及使用有机溶剂(例如己烷)从生物质中提取脂质。这有许多缺点，例如需要使用能源通过加热去除提取的化合物中的溶剂、易燃性相关的工艺(process)风险，以及溶剂的毒性，这种毒性使得由于回收目的有机成分之后在生物质中的残留溶剂，导致剩余的生物质不适合某些应用。例如，这意味着在加工(processing)生物质以生产多不饱和脂肪酸的过程中，如此进行溶剂提取工艺(process)以至于在许多情况下，脱脂的生物质被丢弃到垃圾填埋场。
此外，溶剂提取工艺的另一复杂之处在于，为了有效率，要么生物质必须首先干燥(这需要大量热能)，要么可选择地可以在湿生物质上进行提取，在这种情况下工艺通常涉及形成复杂的水包油型的乳液，这种乳液非常难以有效地破坏，导致提取效率低下。干燥所需的能量多于在提取的脂质所蕴含的能量。为了在湿生物质上进行提取，估计溶剂提取工艺中大约50％的设备成本归因于高速离心机相关的成本，这是破坏复杂乳液以允许回收目的有机成分所需的。如上所述，能源和设备的成本太高，以至于将这种工艺的商业可行性限制到高价值产品生产中。
因此，宜提供一种从生物质中回收有机成分的方法，以克服这些问题中的一个或多个。以成本效益高的方式从水性生物质(如水藻)中回收有机成分的能力是可取的，因为这种能力可以在经济可接受的成本水平上回收生物质中有机成分，因此允许扩大来自生物质的有机成分的市场。
发明内容
因为想提供一种用于从水性生物质中回收有机成分的替代方法(process)，申请人已经确定相对简单的方法，该方法可用于许多工业应用并克服许多已确定的问题。
因此，本发明提供一种从水性生物质中回收有机成分的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供包含有机成分的水性生物质；(ii)处理水性生物质以从生物质的细胞内释放细胞内有机成分以形成生物质悬浮液；(iii)将水不混溶性成分(water-immisciblecomponent)添加到生物质悬浮液中以形成包含生物质和水不混溶性成分的混合物；(iv)包含生物质和水不混溶性成分的混合物经受高剪切以形成水不混溶性成分包水(water-in-water-immiscible component)的乳液；以及(v)将包含有机成分的水不混溶性成分相与水相分离。
申请人已发现该方法适用于从多种水性生物质中回收有机成分。该方法通常非常节能并可进行定制，以轻松满足加工不同生物质的需要。
附图说明
图1.用水(w)和水-甘油(g)制备的己烷-生物质混合物的宏观图像。(A)显示手摇震动后的混合物。(B)显示声波处理(sonication)(以20kHz和3.2W/mL)开始后2秒的‘g’混合物。(C)显示声波处理(以20kHz和3.2W/mL)5秒结束时的‘g’混合物。(D)显示低速离心(34×g达1分钟)后的声波处理过的混合物。
图2.经声波处理后，未离心的(A)和离心(500×g，1分钟)后的(B)通过己烷(HX)、癸烷(DC)和十六烷(HXDC)提取的生物质的宏观图像。使用(C)己烷、(D)癸烷和(E)十六烷作为溶剂的下层清液生物质层的光学显微图像。比例尺：50μm。
图3.以1.5：1.0的油比水性生物质的比率形成的油包水(W/O)乳液分别在以1000×g离心3分钟之前和之后的整体外观(A和C)，以及1.0：1.0的油比水性生物质的比率形成的水包油(O/W)乳液分别在以1000×g离心3分钟之前和之后的整体外观(B和D)。对箭头指示的样本部分拍摄光学显微图像(i-iv)。比例尺：50μm。
图4.导致剪切诱导相转化以产生油-连续乳液的初始油-生物质比率(v/v)范围作为生物质固体浓度的函数，以实心灰色显示。纵向虚线区域表示以下所需的油比生物质比率：从最初油比生物质比率较低的油-生物质混合物生产油-连续乳液，并经受高剪切得到稳定的水包油乳液。三角形和圆形表示测试条件。
图5.己烷-生物质混合物的宏观图像，(A)在转子-定子预混合步骤(生物质pH＝12)下；(B)在pH＝4.5(B)和12(C)下超声处理(ultrasonication)20秒后。
图6.鳄梨油的提取方案的图片：(i)掺和(blending)前将去皮去核的鳄梨切丁；(ii)掺和后的鳄梨泥/生物质；(iii)加入溶剂；(iv)超声处理20秒后即刻出现明显的相分离；(v)转子-定子搅拌后稳定的己烷-生物质混合物；以及(vi)施加低离心力(100×g，1分钟)后明显的相分离差异。
具体实施方式
在本说明书中，许多术语的用法是本领域技术人员熟知的。尽管如此，为了清楚起见，许多术语将被定义。
在本说明书的全部说明和权利要求书中，词语“包括(comprise)”和该词语的变体，例如“包含(comprising)”和“含有(comprises)”并不旨在排除其他添加剂、成分、整数(integer)或步骤。
如本文所用，术语“生物质(biomass)”是指一团(mass)活的或死的生物材料，并且包括处于其自然或天然状态的材料和已经进行加工以产生半加工的生物质的材料。
如本文所用，术语“水性生物质(aqueous biomass)”是指含有水的生物质材料或指在水环境中的生物质材料(即，其中生物质本身可含有很少或不含水，但与其它水混合)。
如本文所用，术语“培养(culturing)”是指通过为细胞或生物体提供合适的条件以进行其部分或全部自然生物过程(例如繁殖或复制)，从而有意地促进细胞或生物体的生长和增殖，使得生物质的总量增加。
“乳液”是两种或多种通常互不混溶(immiscible)(不可混合(unmixable)或不可交融(unblendable))的液体的混合物，其中一种液体形成分散相，以及另一种液体形成分散介质。两种液体可以形成许多不同类型的乳液。例如，油和水可以形成水包油乳液，其中油是分散相以及水是分散介质。或者，它们可以形成油包水乳液，其中水是分散相以及油是分散介质。多重乳液也是可能的，例如水包油包水乳液或油包水包油乳液。在同一乳液中有多个相似相的情况下(如油包水包油乳液中的两个油相)，每个相可能含有不同的溶质。
如本文所用，术语“混溶性(miscibility)”及其派生词例如“混溶的(miscible)”是指两种物质能以所有比例混合的特性(property)或能力，或者换句话说，它们在任何浓度下完全溶解于彼此的能力。
因此，如本文所用，术语“水不混溶性(water-immiscible)”是指存在一定比例的不溶于水的物质。例如，丁酮(甲基乙基酮)可明显溶于水，但因为这两种溶剂并非在所有比例下都能彼此溶解，所以丁酮仍被归类为水不混溶性的。
如本文所用，术语“油”是指任何既疏水又亲脂的非极性化学物质，以及可包括甘油的和脂肪酸的三酯。油在室温下通常是液体。
如本文所使用的术语“回收”是指从水性生物质的残余物中有效地分离出水不混溶性目的成分。术语“回收”可包括直接分离水不混溶性目的成分、或将水不混溶性目的成分移入到水不混溶性溶剂中。然后可以使用已知的分离技术分离出水不混溶性目的成分。
如上所述，本发明涉及从水性生物质中回收目的有机成分的改进的方法。一般而言，在生物质生产系统中通常会出现许多离散步骤，我们将更详细地讨论这些步骤。
可从生物质中回收的有机成分
可以从生物质中回收有许多成分并在工业意义上加以利用。例如，仅举几例，生物质可能含有脂质、蛋白质、碳水化合物或色素。生物质还可含有其他目的有机成分，如可用作调味剂、香料或药物的化合物。一般来说，存在于生物质中的有机成分可能会因所选择的生物质而有很大不同。事实上，在现代，科学家们正在对生物体(如水藻、植物、真菌和细菌)进行基因工程，以生产特定的目的化合物。
可以从生物质中分离的特别感兴趣的有机成分的一个示例是含有饱和或不饱和脂肪酰基链的脂质。这种类型的脂质有多种应用，可用于生产生物燃料，如生物柴油或喷气燃料。事实上，某些水藻品种可以“养殖”，其单位面积的脂质产量高于陆生油料作物，使其成为生产商品燃料工业原料的有吸引力的作物。
除了在燃料工业中用作原料外，许多脂质还可以进一步加工以提供用于工业用途的其他碳氢化合物的有用来源。例如，许多脂质含有碳氢化合物，例如C10、C12、C14、C16、C17或C18链长的饱和碳氢化合物和单不饱和碳氢化合物。此外，这些脂质可以作为传统植物油的替代品用作食品和烹饪油。
除了饱和以及单不饱和脂肪酸之外，许多生物质还含有大量的多不饱和脂肪酸(PUFA)，已确定这些多不饱和脂肪酸具有广泛的用途，例如在营养和保健方面。这些成分已用于婴儿和成人食品、药物组合物中以及用作营养补充剂。
多种PUFA是已知的，优选PUFA是长链(例如，C18、C20或C22)的omega-6或omega-3脂肪酸。这些不饱和脂质包括二十二碳六烯酸(DHA，omega-3)；α-亚麻酸(ALA，omega-3)；花生四烯酸(ARA，omega-6)；二十碳五烯酸(EPA，omega-3)；和γ-亚麻酸和二高-γ-亚麻酸(分别是GLA和DGLA，每个都是omega-6)。
生物质还含有蛋白质，例如作为人类的饮食来源或动物或水产养殖的饲料应用可能是有意义的。此外，生物质可包含特定功能的蛋白质，例如酶、凝集素、藻胆蛋白(phycobiliprotein)、生物活性肽或抗微生物剂。这些蛋白质可能存在于天然株中、或由基因改造的生物体表达。
生物质还可能含有一些感兴趣的碳水化合物，如淀粉、纤维素、半纤维素、半乳甘露聚糖、果胶、琼脂、藻酸盐、卡拉胶和黄原胶，它们可作为糖的来源，用于发酵成乙醇和乳酸的一系列产品，或作为食品添加剂，例如作为稳定剂或增稠剂。
除脂质、蛋白质和碳水化合物之外，生物质还可包含许多可用作调味剂、色素、抗氧化剂或药物活性化合物的有机成分。这种类型的有机成分的示例包括色素，例如类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素和玉米黄质)、叶绿素、藻胆蛋白和多酚(例如，儿茶素和黄酮醇)。
原则上，本发明的方法可用于从包含有机成分的水性生物质中回收任何有机成分。已发现该工艺可广泛应用于各种水性生物质，因此可用于根据所选择的水性生物质回收各种有机成分。
生物质生产
本发明方法的第一步是提供包含有机成分的水性生物质。如上所述，水性生物质可以是具有足够高的水含量的生物质，或者水性生物质可以是通过用水稀释不够湿的生物质形成、或由干燥的生物质材料与水混合形成。可以通过多种方式提供这种类型的水性生物质。
例如，在一个实施方案中，有机材料可以与水混合形成水性生物质。因此，例如，食物(如鳄梨或橄榄等)或食品工业的废物(如橙皮、葡萄压榨物等)可以与水混合以产生含有有机材料的水性生物质。在一个实施方案中，水性生物质通过将果实制浆形成水性生物质而形成。可制浆的果实的示例包括苹果、梨、橙子、葡萄柚、柑橘、柠檬、酸橙、油桃、杏、桃子、李子、香蕉、芒果、草莓、覆盆子、蓝莓、猕猴桃、百香果、西瓜、哈密瓜、蜜瓜、橄榄、葡萄、西红柿和鳄梨。在某些实施方案中，水性生物质通过将整个果实制浆形成。在某些实施方案中，水性生物质仅包含果实的一部分，例如果皮。如上所述，可以理解，根据果实的水含量可能有必要添加额外的水。
然而，应当理解，一般来说，生物质通常由培育或培养生物体，例如植物作物、培育水藻或微生物来产生。
正如本领域技术人员所理解的那样，有很多方法可以生产生物质，包括通过在合适的培养条件下培育合适的植物(以及收获植物或其部分)或生物体，例如水藻、真菌、酵母、细菌或原生动物，这通常是本领域众所周知的。在一个实施方案中，水性生物质是水藻生物质。在一个实施方案中，水性生物质是真菌生物质。在一个实施方案中，水性生物质是细菌生物质。在一个实施方案中，水性生物质是原生动物生物质。
在生物质是水藻生物质的实施方案中，申请人注意到有大量的水藻品种已经被培育/培养以形成生物质，并且有大量的水藻尚未被培育或分离出来。水藻包括微藻(微观尺寸)和无需显微镜即可观察到的大型水藻/丝状水藻。可以使用的微藻的示例包括以下属中的品种，例如微拟球藻属(Nannochloropsis)、小球藻属(Chlorella)、红球藻属(Haematococcus)、杜氏藻属(Dunaliella)、栅藻属(Scenedesmus)、金藻属(Isochrysis)、褐指藻属(Phaeodactylum)、衣藻属(Chlamydomonas)、舟形藻属(Navicula)、紫球藻属(Porphyridium)、葡萄藻属(Botryococcus)和壶菌属(Thraustochytrium)。可以使用的大型水藻的示例包括紫菜属(Porphyra)、巨藻属(Macrocystis)、水绵属(Spirogyra)、石莼属(Ulva)、马尾藻属(Sargassum)、Augophyllum和鞘藻属(Oedogonium)。除了真核生物水藻外，还可以使用蓝绿藻/蓝细菌(光合细菌)，包括，例如螺旋藻属(Spirulina)、微胞藻属(Microcytis)、鱼腥藻属(Anabaena)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、念珠藻属(Nostoc)和集胞藻属(Synechocytis)。
申请人已经发现本发明的方法适用于从多种生物质中回收有机成分。然而，为了完整性起见，我们将描述从水藻中生产生物质的一般程序。
一般来说，水藻生物质的培育通常包括在基于水藻特征选择的合适培养基(淡水、盐水或海洋)中培养水藻。通常，这将包括补充有营养物质(例如，氮、磷、矿物质、微量元素和可能的维生素来源)的适当盐度的水源(例如，淡水、微咸水、海水或高盐度水)。如本领域技术人员所熟知的，所选择的确切培养基将因水藻类型而异。
水藻品种可以在室内或室外在各种培育系统中培育，从大型开放式池塘系统(如，跑道池)到管状的或平板式光照生物反应器(photo-bioreactor)。系统的选择通常取决于培育设施的规模、资本成本、待生产的品种的特殊要求，以及与生产地点和其他过程变量(例如，可用空间和能源要求)相关的因素。
以这些方式培育水藻品种可能涉及使用自然阳光，或者其可能涉及将培养物置于人造光下以允许室内培育、或加强或延长培养系统暴露在光下的时间段以增加产量。也可以在混合营养(mixotrophic)条件下进行培育，其中向培养物提供光和有机碳源，例如，葡萄糖、甘油或醋酸盐。或者，一些水藻可以通过提供有机碳源而不是光源来异养地(heterotrophically)生长。
一般来说，水藻的培养温度在10℃至40℃之间，但根据气候和所选择的水藻品种，在一段有限时间内使培养温度低于或超过这个温度的情况并不罕见。在本领域众所周知，培养生物质的温度在地理上和时间上都会有所不同，特别是对于户外培养而言。对于室内培养，技术人员可以基于所选水藻品种的同一性容易选择和控制温度。
当水藻已经培养足够长的时间足以达到所需的生物质浓度时，然后通常会从全部或部分的培养基中收获生物质，以产生适当浓度的水性生物质用于进一步加工。由于水藻通常作为稀释的液体悬浮液进行培养，因此收获通常包括使用化学絮凝法、膜过滤法或浮选法对水藻进行初始浓缩的步骤，然后是进一步浓缩的步骤，例如使用离心、转鼓过滤法或压滤法以产生浓缩的水性生物质。
上述方法产生适合进一步加工的水性生物质。水性生物质的特性可根据生物质的类型和性质变化而变化，其中固体含量取决于所使用的加工条件。提及与水性生物质相关的固体含量是指生物质固体(即，不包括细胞内水或细胞间水)或细胞间盐类(或灰分(ash)含量)。例如，对于在盐水培养基中生长的水藻，术语“无灰(ash-free)”干重是适用的。
在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在0.1wt％至90wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在0.1wt％至75wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在0.1wt％至60wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在1wt％至50wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在2wt％至45wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在5wt％至40wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在10wt％至35wt％的范围内。在一些实施方案中，水性生物质的固体浓度将在15wt％至30wt％的范围内。
生物质处理-细胞裂解
在大多数情况下，打算回收的生物质的有机成分包含在生物质的细胞中。因此，该方法通常需要对生物质进行处理以破坏细胞壁，从而从生物质所在的细胞内释放出细胞内的成分。
已经利用许多本领域公知的方法用于破坏细胞壁/膜并允许细胞内的成分释放出来。例如，可通过对水性生物质进行剪切、机械压制、高压均质化(high-pressurehomogenisation)、微流化(microfluidisation)、酶促或化学处理、珠研磨、微波辐射、超声处理、脉冲电场或渗透压力来破坏细胞壁/膜。
水性生物质可以直接由含水的生物质产生，或者通过生物质成分与水组合以形成水性生物质，例如当果实或其部分是生物质时，可以通过使生物质经受剪切或机械压制来实现细胞裂解。例如，可以通过单独或与水一起将果实制泥(pureeing)形成果实泥(puree)来实现。
在一个实施方案中，水性生物质经过高压均质化处理。在一个实施方案中，水性生物质经受微流化。在一个实施方案中，水性生物质经受珠研磨。在一个实施方案中，水性生物质经受微波辐射。在一个实施方案中，水性生物质经受超声处理。在一个实施方案中，水性生物质经受脉冲电场。在一个实施方案中，水性生物质经受渗透压力。在一个实施方案中，水性生物质经受机械压制。在一个实施方案中，水性生物质经受制泥。
如上所述，细胞壁破裂后，经处理的生物质通常会形成含有水、液体有机成分和固体有机物的生物质悬浮液(可全部或部分为乳液形式)。在生物质悬浮液是乳液的情况下，该乳液通常是复杂乳液，其中连续相是水性的以及有机成分是由细胞有机物稳定的分散相。因此，这是一种非常稳定且难以破坏的复杂的水包油型乳液，结果是有机相与水相的相分离是非常能源密集型的，并且使用当前技术(包括离心和/或添加化学破乳剂(demulsifies))通常无效。乳液的确切物理表征将取决于水性生物质前体，申请人指出，如果处理的生物质固体含量较低(如5wt％)，则复杂乳液通常具有较低的粘度，通常<200cP(25℃，1s-1)；而如果生物质中的固体浓度较高(如20wt％)，则复杂乳液的粘度可能>10,000cP(25℃，1s-1)。申请人注意到，在如此高的浓度下，经处理的生物质的高粘度可能导致在稍后的分离过程中的高能耗成本，所述分离过程可需要水不混溶性相的聚结(coalescence)和乳液分层(creaming)，以便回收所需的有机成分以及添加的水不混溶性试剂。
申请人发现，根据生物质的性质，宜对生物质进行pH调节之后对生物质进行余下加工(process)。在某些情况下，申请人发现宜将提高水性生物质的pH作为提高提取效率和分离效率的手段。
一般而言，取决于是希望降低还是提高水性生物质的pH，可以通过添加酸或碱来调节水性生物质的pH。合适的商业上可获得的酸和碱的示例是公知的。
在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到5.0至13.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到7.0至11.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到8.0至10.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到8.6至9.0的范围内。
在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到5.0至7.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到6.0至8.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到7.0至9.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到8.0至10.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到9.0至11.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到10.0至12.0的范围内。在一个实施方案中，水性生物质的pH值调节到11.0至13.0的范围内。
在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约5.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约5.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约6.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约6.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约7.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约7.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约8.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约8.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约9.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约9.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约10.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约10.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约11.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约11.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约12.0。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约12.5。在一个实施方案中，水性生物质的pH值为约13.0。
在某些实施方案中，水性生物质可以使用酶处理并调节pH值(如果包括该步骤)，以促进界面活性生物聚合物(例如，水性生物质中存在的蛋白质和碳水化合物)的分解，并因此减弱乳液稳定性和促进有机成分从水性生物质连续相中释放。这类的酶辅助水提取技术是本领域公知的，可用于本发明的方法中。
申请人还发现，提取效率和分离效率也可受水性生物质温度的影响。因此，在一些实施方案中，申请人发现在使水性生物质进行余下过程之前宜调节水性生物质的温度。在一个实施方案中，水性生物质的温度调节到20℃至30℃之间。在一个实施方案中，水性生物质的温度调节到30℃至40℃之间。
添加水不混溶性成分
如上所述，使用现有技术来加工细胞破裂后所形成的复杂生物质悬浮液，通常效率低下，因为悬浮液非常稳定且难以破坏，这意味着从生物质中提取所需的有机成分进入添加的水不混溶性试剂中以及随后的相分离是能源密集型和低效的。因此，为克服这种问题，申请人已开发出一种可导致相转化(phase inversion)的技术从而将生物质悬浮液转化为油包水乳液。为进行相转化，申请人发现宜向复杂的生物质悬浮液中加入额外量的水不混溶性成分，因为这有利于相转化步骤。
水不混溶性成分可以采取任何形式，通常基于从生物质中回收的有机成分的所需最终用途以及材料的成本、可用性和特性，来选择水不混溶性成分的性质(identity)。例如，当回收的有机成分打算用作食品添加剂时，宜尝试使用食品级水不混溶性成分。原则上，任何水不混溶性成分都可使用，优选水不混溶性液体。
在一些实施方案中，水不混溶性成分是油或油的组合。油可以是有机油或矿物油。可以使用的油的示例包括C6-C18碳氢化合物、甘油三酯、天然油、石油基的油和硅油。在一些实施方案中，油是天然油，选自扁桃仁(almond oil)油、杏仁(apricot kernel)油、鳄梨油、橄榄油、红花油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、菜籽油(rapeseed oil)、麻(hemp)油、芥花油(canola oil)、可可脂、花生油、小麦胚芽油和其他植物油。
在一些实施方案中，水不混溶性成分是溶剂或溶剂的组合。可以使用的合适溶剂的示例包括四氯化碳、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、乙醚、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯和2,2,4-三甲基戊烷或其组合。在一个实施方案中，水不混溶性成分是己烷。
在一个特别优选的实施方案中，水不混溶性成分与从生物质中提取的油的类型相同。因此，当生物质是水藻生物质时，优选水不混溶性成分是藻油或其衍生物(例如，脂肪酸甲酯)。相应地，当生物质是鳄梨时，优选水不混溶性成分是鳄梨油。这通常是在精炼(refining)步骤中已经分离或加工高价值有机成分之前或之后，从回收或转换过程的后期阶段中回收。这种回收过程避免由于添加有机溶剂而导致的潜在化学污染，并避免需要将产品与提取剂分离(例如，在有机溶剂的情况下使用能源密集型的蒸馏)。
添加/回收的水不混溶性成分的量取决于生物质悬浮液的含油量而不同。例如，与生物质悬浮液的含油量相对较高的情况相比，当生物质悬浮液的含油量相对较低时，需要添加更多量的水不混溶性成分。
然而，通常添加到生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率至少为1.0：1.0(v/v)。虽然在添加的水不混溶性成分的量低于该比率的情况下，该方法也能发挥作用，但从生物质中回收的有机成分通常会减少。
在一个实施方案中，添加到生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率至少为1.5：1.0。在一个实施方案中，添加到生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率至少为2.0：1.0。在一个实施方案中，添加到生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率至少为2.5：1.0。在一个实施方案中，添加到生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率为至少3.0：1.0。虽然在添加的水不混溶性成分的量高于该比率时，该方法也能发挥作用，但方法效率会随着该比率的增加而降低。在每种情况下，该比率都是基于体积对比体积。
在添加水不混溶性成分之后，通常轻轻搅拌所得混合物以确保水不混溶性成分与生物质悬浮液混合以形成包含生物质和水不混溶性成分的混合物。包含生物质和水不混溶性成分的混合物通常呈多相的复杂乳液形式。
剪切引起的相转化
然后，通过高剪切如上所述产生的包含生物质和水不混溶性成分的混合物以诱导相转化，从而形成具有微观尺寸液滴的水不混溶性成分包水的乳液。剪切诱导的相转化过程导致目的有机成分被分配到加入的水不混溶性试剂中。此外，所得的转化的乳液相对于正在加工的体积具有较高的界面面积，这提高了随后将所需的目的有机成分提取到添加的水不混溶性试剂中的效率。申请人已经观察到，相转化的结果是将生物质悬浮液从高粘度的水性连续相转变为较低粘度的水不混溶性物质(substance)连续相，这极大地提高了分离效率。
正如本领域技术人员将理解的，其中水不混溶性物质是油，相转化产生油包水乳液。可以利用许多高剪切技术进行这种高剪切诱导的相转化。
提供产生必要剪切力的高剪切的技术示例包括高压均质化、微流化(microfluidisation)、水力空化(hydrodynamic cavitation)和超声处理(ultrasonication)。
在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(iv)中，通过声波处理包含生物质和水不混溶性成分的混合物，使得该包含生物质和水不混溶性成分的混合物经受高剪切作用。尽管使用的声波处理频率通常在20kHz至200kHz的范围内，但可能会有很大差异。在一个实施方案中，声波处理以20kHz至200kHz的频率进行。在一个实施方案中，声波处理以20kHz至150kHz的频率进行。在一个实施方案中，声波处理以20kHz至100kHz的频率进行。在一个实施方案中，声波处理以20kHz至40kHz的频率进行。
本领域的技术人员会理解，声波处理频率只是超声处理方法中的一个变量。一般来说，阈值能量密度是确定声波处理步骤的较好方法。
阈值能量密度(E)可以定义为：
E＝(PXt)/V；
其中，P＝功率(power)输入(W)、t＝时间(秒)以及V(mL)是加工体积。
在某些实施方案中，在能量密度大于20J/mL时进行声波处理。
可以在任何必要的时间段内进行声波处理，以实现所需的相转化。在一个实施方案中，声波处理进行1秒至600秒。在一个实施方案中，声波处理进行5秒至300秒。在一个实施方案中，声波处理进行10秒至200秒。在一个实施方案中，声波处理进行15秒至100秒。在一个实施方案中，声波处理进行20秒至50秒。
在一个实施方案中，声波处理进行约5秒。在一个实施方案中，声波处理进行约10秒。在一个实施方案中，声波处理进行约15秒。在一个实施方案中，声波处理进行约20秒。在一个实施方案中，声波处理进行约25秒。在一个实施方案中，声波处理进行约30秒。在一个实施方案中，声波处理进行约35秒。在一个实施方案中，声波处理进行约40秒。在一个实施方案中，声波处理进行约45秒。在一个实施方案中，声波处理进行约50秒。在一个实施方案中，声波处理进行约55秒。在一个实施方案中，声波处理进行约60秒。
在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(iv)中，通过高压均质化包含生物质和水不混溶性成分的混合物，使得该包含生物质和水不混溶性成分的混合物受到高剪切作用。
在一个实施方案中，高压均质化在10MPa至400MPa的压力下进行。在一个实施方案中，高压均质化在10MPa至300MPa的压力下进行。在一个实施方案中，高压均质化在10MPa至200MPa的压力下进行。在一个实施方案中，高压均质化在20MPa至200MPa的压力下进行。在一个实施方案中，高压均质化在50MPa至200MPa的压力下进行。在一个实施方案中，高压均质化在50MPa至200MPa的压力下进行。
在一个实施方案中，高压均质化在10℃至90℃的温度下进行。在一个实施方案中，高压均质化在10℃至70℃的温度下进行。在一个实施方案中，高压均质化在10℃至50℃的温度下进行。在一个实施方案中，高压均质化在20℃至50℃的温度下进行。在一个实施方案中，高压均质化在20℃至30℃的温度下进行。
在某些实施方案中，高压均质化包括使包含生物质和水不混溶性成分的混合物多次通过均质器(homogeniser)。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器6次。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器5次。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器4次。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器3次。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器2次。在一个实施方案中，包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过均质器一次。
包含生物质和水不混溶性成分的混合物通过高压均质器的流速将取决于许多变量，包括均质器设备的确切参数和规模(scale)，尽管如此流速通常在10至28000L/h的范围。
相分离
如上所述，在使用高剪切进行相转化后，申请人发现，与包含生物质和水不混溶性成分的初始混合物相比，所形成的水不混溶性成分包水的乳液稳定性要低得多。这有助于将水(水性)相和水不混溶性成分相进行分离。使用本领域已知的常规技术进行两相分离。例如，可以使用重力沉降、拌合(malaxation)或离心进行分离。在一个实施方案中，使用重力沉降进行分离。在一个实施方案中，使用拌合进行分离。在一个实施方案中，使用离心进行分离。在一个实施方案中，在低于10,000×g的力下进行离心，时间不超过10分钟。
通常，来自生物质的有机成分倾向于分配到水不混溶性相中，因此当两相分离时，有机成分会现于水不混溶性相中。然后，在需要进一步纯化有机成分的情况下，可以进一步精炼水不混溶性相。
在相分离之后，在一个实施方案中，将一部分回收的水不混溶性相返回到过程的前端(即，添加到如上所述的复杂的生物质悬浮液中)以充当提取剂，以及从过程中回收剩余部分并可能将其进一步精炼或加工。进一步精炼/加工可包括但不限于脱胶、酯基转移(transesterification)、氢化作用(hydrogenation)和纯化等步骤。可选择的，虽然不认为是必要的，可以在返回之前精炼/加工分离出的水不混溶性成分。
在一个实施方案中，该方法还包括从水不混溶性相中分离有机成分的步骤(vi)。
用于从水不混溶性相中回收和进一步精炼有机成分的确切方法将根据有机成分的性质而有所不同。正如本领域技术人员所理解的，从不同的生物质来源将回收不同的有机成分。实际上，将从不同的水藻品种中回收不同的有机成分。一般来说，有一些众所周知的精炼技术可供利用。
例如，一种众所周知的技术是使用液-液提取，通常可用于选择性地提取某些有机成分。通过这种方式，技术人员可以改变用于提取某些成分的液体。
作为一种可选择的方案，有可能使用固相提取系统，该系统含有为现有(in hand)的提取工作而设计的固相。在这样的系统中，粗混合物添加到柱子中，然后使用各种洗脱溶液选择性地从柱子上洗脱(strip)各个有机成分。
在另一可选择的方案中，可对水不混溶性相进行蒸馏以分离出挥发性成分。
如将理解的，原则上可使用已知的任何生物精炼技术用于进一步精炼水不混溶性相中的成分，以提供所需纯度的有机成分。
现在通过实施例来说明本发明；然而，这些实施例不应解释为对其的限制。
实施例
实施例1：通过剪切诱导相转化法从微藻生物质中回收脂质
水藻生物质培育
微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)单培养物(monoculture)使用15L的大玻璃瓶(carboy)在室内生长、20℃、光照：黑暗周期为14：10小时。生物反应器的通气是由流量为190L/h的水族箱气泵进行。在14天的生长期后，收获水藻培养物并通过碟式离心机(Separator OTC2-02-137，GEA Westfalia，意大利)进行浓缩。通常的浓缩水藻糊的固体浓度范围为约28至32wt％，这是在60℃下过度干燥24小时后通过重量分析测定。
总脂质和非极性脂质部分的确定
每个批次的可提取总脂质的含量是通过改良的Bligh和Dyer的提取方法确定，如其他地方所述(Bligh,E.G.和W.J.Dyer,A rapid method of total lipid extractionand purification.Canadian journal of biochemistry and physiology,1959.37(8)：第911-917页)。简而言之，对氯仿/甲醇/生物质的混合物(1.0：2.0：0.8v/v/v，其中应用的生物质的固体浓度为约9至10wt％)进行搅拌，然后另外添加氯仿和水，对混合物进行重力分离。丢弃上面的水性层，得到底部的氯仿层，之后加入新鲜溶剂以达到前述的提取比率。这个过程循环进行，直到生物质的颜色从绿色变成灰色。收集到的脂质通过固相提取分为中性脂质(NL)、磷脂(PL)和糖脂(GL)(Olmstead,I.L.等人，A quantitative analysis ofmicroalgal lipids for optimization of biodiesel and omega-3production.Biotechnology and Bioengineering,2013.110(8)：第2096-2104页)。
细胞破碎
将新鲜的浓缩的水藻糊稀释至约25wt％的固体浓度，之后将糊在40℃下温育24小时以诱导细胞减弱(weakening)。温育的生物质在1200bar的施加压力下一次通过高压均质处理(Panda 2K NS1001L，GEA Niro Soavi，意大利)进行破裂。在光学显微镜下通过细胞计数确定细胞破裂的效率。破裂比率约为细胞总数的80至90％。
通过剪切诱导相转化进行水藻脂质的回收
乳液的相转化可以突变式(catastrophically)地发生、或过渡式(transitionally)地发生。当乳液的组成(composition)发生变化，使得分散相比连续相的比率改变时，可能会发生突变式的相转化，例如水包油(O/W)乳液转化到油包水(W/O)乳液。如果界面特性发生改变，例如加入破乳剂、温度变化、界面活性化合物的浓度变化或相的粘度变化，可能会发生过渡式相转化。此外，暴露至剪切会导致动态的相转化过程(
Figure BDA0003495564090000181
A.和J.-L.Salager,Effect of stirring energy upon the dynamic inversion hysteresisof emulsions.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2001.181(1-3)：第319-323页)。目前的相转化方法可以包括所有这些方面(改变连续相比分散相的比率、改变界面特性和施加剪切)以实现提高从生物质中回收有机化合物。在以下示例中，超声处理和高压均质化(HPH)均用于创建高剪切环境。这两种方法的结果是相当的，所需的能量也是类似的数量级。
水藻脂质的总回收效率既基于提取效率(分配到添加的水不混溶性成分(芥花油)中的可提取脂质的比例)又基于分离效率(提取的水藻脂质和从混合物中物理分离出的水不混溶性成分(芥花油)之间的比例)。在应用离心法将芥花油-水藻脂质混合物与残留的水性生物质分离后，用重量分析法确定分离效率。通过测量在回收的芥花油-水藻脂质混合物中的水藻脂质的浓度来确定提取效率。回收的芥花油-水藻脂质混合物中水藻脂质的浓度通过测量在670nm处的紫外线吸光度来确定，所述吸光度与叶绿素a浓度相关并用作可提取水藻脂质浓度的指标(proxy)。
共溶剂在水相中的作用
众所周知，共溶剂(如水中的多元醇)的存在可以改变界面活性，稳定乳液的大分子，如蛋白质和多糖。因此，可以通过改变制剂来促进过渡式相转化，例如从O/W乳液转化到W/O乳液。在使用基于壳聚糖的乳液系统的初步测试中，在水相中添加甘油作为共溶剂，减少实现过渡式相转化所需的油部分。然后，在水藻生物质系统中研究甘油的作用。通过用水或甘油稀释20wt％的生物质来制备10wt％固体浓度的生物质样本。使用己烷作为溶剂并且己烷-生物质的比率为1.1：1.0(v/v)。如图1的A所示，两种样本都经过手摇震动从而形成了稳定的O/W乳液(在室温下超过24小时未发生相分离)。然后，将混合物以3.2W/mL经超声处理5秒。超声处理期间和之后拍摄的图像(图1的B和图1的C)显示出从水连续乳液到己烷连续乳液的相转化，如在生物质周围形成的富含叶绿素的己烷的深绿色通道(channel)所示。此外，在超声处理后可在乳液上部立即出现清晰的己烷层(图1的C)。可以看到淡绿色的水性生物质相由于密度差异在重力作用下自然沉淀，证实己烷已成为连续相。在施加最小离心力(34×g，1分钟)的情况下，己烷与甘油作为共溶剂从样本中完全分离出来。相比之下，水稀释的样本在这种特定的组合物中形成了高度稳定的凝胶状O/W乳液，该特定组合物具有次优的溶剂比生物质的比率。在实施例9中探讨了溶剂比生物质的比率的影响。这些结果表明，通过添加共溶剂可以改进相转化方法从而提高对油的回收。
烷烃的碳链长度对水不混溶性提取剂/溶剂的影响
水不混溶性成分的化学结构会影响乳液形成。例如，饱和碳氢化合物的碳链长度增加将增加液体(fluid)的粘度和疏水性。乳液的形成使用三种常见的碳氢化合物测试：己烷(HX、C6)、癸烷(DC、C10)和十六烷(HXDC、C16)。通过用甘油稀释20wt％的糊制备10wt％的生物质。由于碳氢化合物之间的密度差异，油-生物质的比率保持在1.17(以体积而非质量为基础)。进行与实施例6相同的混合程序(手动混合，然后以3.2W/mL超声处理5秒)。在超声处理后立即出现乳液，表明样本呈油性连续(图2的A)，在己烷样本中可观察到清晰的相分离。然而，癸烷和十六烷样本中更粘稠的水不混溶性相减缓了相分离，这正如在癸烷样本中发现了较小程度的相分离以及在十六烷样本中没有可见的相分离(图2的A)。施加中等离心力(500×g，1分钟)后，在所有样本中都发现明显的相分离(图2的B)。在光学显微镜下检查下层清液层中残留油的量。有趣的是，尽管己烷样本分离速度最快，但剩余油滴最多(图2的C)。癸烷样本中残留的油非常少(图2的D)，其中下层清液的主要成分是细胞碎片。在十六烷样本中发现从O/W到W/O的完全相转化(图2的E)，其中含有细胞碎片的水滴在十六烷相中自由流动。这些结果表明，长链碳氢化合物可以在微观水平上破坏水藻生物质乳液的稳定性，导致在较低的油-生物质比率下出现更大程度的相转化。然而，需要考虑由于油相的粘度增加、以及由于水和水不混溶性相的密度差减少而在分离步骤中需要的额外能量。
油-生物质比率的影响
改变水不混溶性相的部分可导致突变式相转化。根据实施例7的结果，可使用疏水性越来越强的水不混溶性成分改进回收过程。在回收水藻脂质的情况下，回收的水藻脂质可潜在用作水不混溶性相，因为水藻脂质的主要成分是高度疏水的甘油三酯。此外，通过对回收的脂质进行循环利用(recycling)，不需要使用有毒溶剂用于进一步回收。这提高了水和水不混溶性部分的质量，并通过避免需要热去除常规溶剂(例如己烷)而显著降低所需的能量。由于水藻脂质资源有限，芥花油被用作回收的水藻脂质的模拟物。使用固体浓度为20wt％(pH＝6.2)的破裂后的生物质，添加芥花油以达到在1.0：1.0至3.0：1.0(v/v)之间的油-生物质比率。将不同油-生物质比率的芥花油和生物质的混合物手动混合，然后以3.2W/mL的功率密度应用超声波达10秒。通过目视和光学显微镜检查样本中的乳液。对油-生物质比率为1.5：1.0时制得的混合物进行声波处理导致相转化，产生W/O乳液。对油-生物质比率为1.0：1.0时制得的混合物进行声波处理并未导致相转化，仍然为O/W乳液。W/O和O/W油-生物质乳液的整体外观截然不同，W/O乳液看起来在稠度上(in consistency)非常液体化，并且由于含有油溶性叶绿素所以颜色为深绿色，而O/W乳液为淡绿色以及具有高度粘稠的、凝胶状的稠度(图3的A和图3的B)。当以1000×g离心5分钟时，W/O样本发生明显分离，然而在O/W样本中未观察到可见的水-油相分离(注意图3的D中的多的淡绿色上层是乳液，以及明显的深绿色底层是分离出的水)。通过光学显微成相来检查乳液层(图3的i至图3的iv)。在以1.5：1.0的油-生物质比率产生的W/O乳液在离心后，获得清晰的油相(图3的ii)和无油生物质层(图3的iii)。相比之下，即使在油-生物质比例为1.0：1.0时产生的O/W乳液离心后，也发现油滴被粘稠的生物质基质所稳定。在该系统中，实现剪切诱导的相转化的最小油-生物质比率为1.25：1.0。使用高压均质器作为剪切诱导器进行类似的实验，结果证实HPH可以在这种油-生物质比率下对这种乳液类型进行相转化(类似于超声系统)。
HPH压力和加工通过的次数
上述的初步试验是用超声处理作为相转化的剪切方法进行的。发现增加声波处理功率密度会增加水藻脂质的回收。在30、60和100MPa下，使用油-生物质比率为3.0：1.0(v/v)的芥花油和生物质(20wt％，pH＝6.2)的混合物测试HPH压力的影响。在施加压力为30MPa的情况下，使用相同的油-生物质比率的混合物，还检查使用多次加工通过(1、3或6次)的影响。在通过HPH所需次数后，将油包水乳液在1500×g下离心5分钟。
不同HPH操作条件下的提取和分离效率可见表1。对于单次通过，当施加的压力从30MPa增加到60MPa时，发现提取效率从36％翻倍到73％。此外，分离效率也从78％增加到95％。与60MPa相比，30MPa时的低回收效率可能由于剪切力不足够高，以至于不能完全克服粘性水性生物质屏障以释放被截留的脂质滴而导致的不完全相转化。然而，当压力从60MPa进一步增加到100MPa时，没有发现提取效率显著提高，这表明有可能为节能提取找到最佳操作压力。在30MPa的施加压力下，随着加工通过次数从1次增加到3次，提取效率也从36％增加到65％。在6次通过时观察到提取仅略有增加。
比较在不同的HPH压力和通过次数下得到的结果，可以看出，增加施加的压力比增加通过次数对回收效率的影响更大。此外，可以看出，在相对较低的压力(小于100MPa)下可以实现微观尺度的相转化，这将有利于节能。
为了强调由超声处理和HPH产生的高剪切环境的重要性，针对水藻脂质的提取，与低剪切形式的搅拌进行比较(benchmarked)，在低剪切环境中相同的油-生物质混合物在10rpm的旋转台上进行72小时的批量(bulk)旋转。发现所得的提取效率低于10％。在超声处理和HPH过程中产生的局部高强度剪切环境能够在微观尺度上轻松地使高弹性生物质基质变形，产生高界面面积和强大的聚结力，从而显著提高了物质转移。使用高剪切相转化产生的微观W/O乳液，能够使高度稳定的生物质基质内的脂质能够被释放出并聚结成连续(水不混溶性)相。
表1.使用固体浓度为20wt％、pH＝6.2的破裂的生物质在不同HPH操作条件下处理的水藻脂质的提取和分离效率。
Figure BDA0003495564090000221
固体浓度的影响
发现固体浓度对水藻脂质的回收有很大影响，主要是由于界面活性的变化，这可能与以下三种影响有关：1)含水量；2)界面活性成分的浓度，如蛋白质、多糖和细胞碎片；3)由于乳液历史(history)的相转化滞后。由于高剪切方法(如超声和高压均质化)有可能产生高度稳定的乳液，因此产生所需的乳液类型非常重要。在水藻脂质回收的情况下，维持油-连续系统的重要性可以从表2中看出，表2显示了固体浓度为5、10和20时破裂的生物质(水)和油-连续的生物质混合物的流变学行为。当固体浓度从5wt％增加到20wt％时，生物质的粘度从172.4cP急剧增加到16250cP，形成一种半固体/凝胶状材料，其中脂质被丰富的界面活性成分(如蛋白质、多糖和细胞碎片)良好地稳定下来。由于这些界面活性成分的存在，即使在低剪切搅拌下，任何添加的提取溶剂也会被乳化到水性生物质基质中，从而增加相分离的难度。相比之下，通过引入芥花油(60cP、25℃、1s-1)来生产油连续的W/O乳液，在1s-1的剪切速率下，混合物的粘度在10wt％时降低了9倍，在20wt％时降低了37倍。这些结果表明，与水性生物质相比，通过产生水不混溶性(例如，芥花油)的连续相可以实现显著的粘度降低，这对于整个回收过程都是有利的，在较高的固体浓度下尤其重要。
表2.破裂生物质和油-连续的油-生物质混合物(油比生物质比率为3.0：1.0)在不同剪切速率下的含水浆液的粘度。
Figure BDA0003495564090000231
进行进一步的实验用于证明通过控制油：生物质比率(v/v)和提供高剪切来产生油连续乳液的重要性。众所周知，油比水比率的降低会导致从W/O到O/W的相转化。在水藻脂质回收的情况下，O/W乳液通常是凝胶状的且高度稳定，这是不利的。因此，在高剪切过程后可以形成W/O形成(formation)的油比生物质比率的最小阈值是所需的关键参数之一。为探索高剪切过程中固体浓度对乳液形成的影响，使用Milli-Q水作为稀释剂，在未调整的pH为6.2的情况下，将破裂的水藻生物质制成10、20和24wt％的固体浓度。使用实施例8中描述的方法，对每种固体以3.2W/mL使用超声处理30秒，用于测试在高剪切环境下产生W/O乳液的最小油比生物质比率。
表3显示允许相转化以在不同固体浓度下产生O/W乳液的最小油比生物质比率。随着固体浓度从10wt％增加到24wt％，最小油比生物质比率(v/v)从1.5：1.0降低到1.0：1.0。该比率的降低可能是由于在较高固体浓度下水含量减少，这可能会限制存在于水相中的所有表面活性成分的界面活性。与此一致的是，显微镜观察表明，随着固体浓度的降低，水-油界面的膜厚度增加。
表3.生产W/O乳液所需的最小芥花油比生物质的比率作为生物质固体浓度的函数(pH＝6)。
Figure BDA0003495564090000241
进行额外的实验以证明控制水性生物质和水不混溶性成分的比例以获得油连续相的重要性。将芥花油引入生物质中，在不同的固体浓度下产生具有较小油比生物质比率(v/v)的混合物(分别为10wt％时的1.22：1.0、20wt％时的1.0：1.0和24wt％时的0.75：1.0)。使混合物经相同的超声处理。然而，当受到高剪切而不是相转化时，产生高度稳定的O/W乳液凝胶(实施例8，图3的B)。随后，将更多的芥花油添加到这些O/W生物质乳液凝胶中，以达到表3中的最小的油-生物质比率。然后按照相同的程序对样本进行超声处理。对于所有样本，都没有发生相转化。随着含油量的进一步增加，重复添加油和超声处理的过程，直到实现相转化。图4显示当开始的油比生物质比率低于确定的最小比率时，所需的最终油比生物质比率。最终比率高于最小比率，以及所需的额外油的量随着固体浓度的增加而增加。额外的油添加可归因于由于水包油乳液类型的高稳定性而导致相转化的滞后性。
基于上述理解，然后使用实施例9中描述的相同分析操作方案，确定不同固体浓度和油比生物质比率时，HPH加工乳液的回收效率。在60MPa时使用单次通过进行HPH加工。尽管在低固体浓度(5wt％和9wt％)下使用较高的油比生物质比率，但提取率只有约50％，这可能是由于当水含量过高时，水包油乳化也被高剪切所促进。在更高的固体浓度下提取效率得到提高，从20％的固体时73％的提取效率提高到23％的固体时的80％的提取效率。然而，略低的分离效率表明，在过高的固体浓度下，离心分离反而可能成为限制因素。
表4.不同固体浓度的破裂生物质在其自然pH下，在60MPa时使用单次通过HPH所加工的水藻脂质的提取和分离效率。
Figure BDA0003495564090000251
生物质的pH对回收效率的影响
pH是改变表面活性成分的界面活性的关键参数之一。在复杂的乳液体系中，例如水藻生物质中存在多种表面活性成分(例如，蛋白质和多糖)，pH的变化可能导致成分的溶解度和结构改变，从而导致界面活性和粘度变化。发现在温育后水藻生物质的pH值从9降低到6。可能是由于水藻细胞代谢产生的CO2酸化以及细胞质物质和成分(蛋白质和多糖)从细胞壁释放出来导致pH值下降。在细胞破裂步骤之后，发现生物质的pH值为6.2。
使用固体浓度为23wt％的破裂生物质确定pH值的影响，使用彻底混合的氢氧化钠粉末将生物质的pH值提高到8.8和12。表5显示，当pH值从6.2增加到8.8时，生物质的粘度减少大约一半。pH值进一步升高导致粘度从27570cP略微增加到33860cP。
表5.不同pH下破裂生物质的粘度，剪切速率为1s-1
Figure BDA0003495564090000252
为避免脂质在高pH下发生皂化，在样本的pH＝6.2和pH＝8.8之间测试回收效率(表6)。根据回收的水不混溶性相的UV-vis分析和残留生物质的Bligh和Dyer提取验证，发现提取效率从80％增加到94％。分离效率略有增加可能是由于调节pH值而降低的粘度。
表6.在pH＝6.2和pH＝8.8，固体浓度为23wt％的情况下，使用油-生物质比率为1.5，在60MPa下单次通过HPH，水藻脂质的提取和分离效率。
Figure BDA0003495564090000261
实施例2：通过剪切诱导的相转化方法从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中回收虾青素/类胡萝卜素
按照其他地方所述的，培育雨生红球藻(参见，例如，
Figure BDA0003495564090000262
G.Baroni，K.Y.Yap，P.A.Webley，P.J.Scales和G.J.Martin，Algal Research，2019，39，101454)，从中积累了酮式类胡萝卜素(keto-carotenoids)、抗氧化色素。经测量，收获的水藻的固体浓度为按重量计约15wt％。
使用高强度的低频(20kHz)超声波以脉冲模式(开5秒和关10秒)进行10分钟对生物质进行部分破裂。在超声处理过程中，生物质的温度控制在25至30℃左右。部分破裂的生物质的pH为4.5。在pH＝4.5和12的情况下，用己烷研究引发突变性相转化的最小阈值油-生物质比率(v/v)。
以己烷为溶剂，在两个pH值水平(4.5和12)下确定剪切诱导的相转化法的回收效率。在pH＝4.5和12的情况下，使用预定的最小的己烷比生物质比率，使用转子定子(rotor-stator)混合器在12000rpm(60W)下对生物质和己烷进行1分钟的预混合。发现预混合的生物质包己烷乳液是高度稳定和粘稠的(图5的A)，即使在500×g离心2分钟后也无法实现可观察到的相分离。使用1W/mL的高强度低频超声波达20秒，完成了剪切诱导的相转化，之后观察到瞬间的相分离。值得注意的是，与pH＝4.5(图5的B)相比，pH＝12(图5的C)时分散的生物质水相的粘性要小得多，这表明相转化的程度更高。
为了强调相分离和自然沉降(由于溶剂的低粘度)的重要性，分离的有机相在重力沉降5分钟后直接倾析，从中确定可倾析(decantable)的部分(在氮气流下除去己烷)。然后，将生物质以5000×g离心5分钟，随后收集另一部分有机相，即用离心后的部分。通过加入可倾析的和用离心后的部分，确定每干生物质重量的总回收。
为获得使用己烷作为溶剂的总可提取含量，一式三份称量生物质样本并完全干燥，然后在55℃下进行48小时的己烷提取过程。收集己烷部分，以及在55℃和氮气流下通过溶剂蒸发获得提取物。使用提取物相对干生物质的重量来计算每干生物质重量的总可提取重量，用于进一步定量比较。
如表7所示，发现在pH＝12时，己烷比生物质比率(v/v)从3.5：1.0显著降低至2.5：1.0。在这两种情况下，一旦成功开始相转化，无需离心就可容易地实现高的有机相回收。然而，发现每干生物质的总回收在pH＝12时要高得多。高pH值下有机化合物的高回收可能是由于较低的乳液稳定性，其与骤降的己烷比生物质比率相一致。确定的总可提取含量(己烷作为溶剂)对于每克干生物质为约122mg，当前的提取分离方法在pH 4.5和pH 12时分别产生约75％和约21％的回收效率。
表7.在固体浓度为15wt％以及两个测试pH值时，最小油-生物质比率、相转化后可倾析的有机部分占总收集体积的百分比、可回收成分的质量浓度以及最终回收效率。
Figure BDA0003495564090000271
实施例3：用相转化分离方法回收鳄梨油
新鲜的鳄梨果实来自当地市场。鳄梨浆(pulp)是在去皮和去核后得到的。然后，将浆制成泥，从中确定固体含量和总含油量(在55℃下使用己烷提取48小时)分别为约23wt％和约11wt％。
在约23wt％的固体浓度时确定的最小己烷比生物质比率为1.0：1.0(v/v)。值得注意的是，由于鳄梨生物质的高粘度，不能通过手摇震动提取鳄梨油(图6的iii)。与其他报道的系统相似，混合物经转子-定子混合后变成稳定且粘稠的生物质乳液，其中己烷最后被截留(trapped)在生物质基质中(图6的v)。通过实施例12中所述相同的程序进行剪切诱导的相转化，之后在应用超声处理后观察到快速的相分离(图6的iv)。相比之下，转子-定子混合乳液在离心后不被破坏(图6的vi，100×g，1分钟)。
还在pH 5和13以及鳄梨油的自然pH 6.4下测试鳄梨油的回收。通过实施例12中所述相同的方法确定鳄梨油的回收(即，在氮气流下除去己烷后确定可倾析和离心后的部分)。在自然pH值下经过20秒的超声处理后，总回收率最高约95％，其中大部分是在重力沉降后从可倾析部分中回收。两种pH调节都会降低回收，在pH＝5和13时回收率分别降低至81％(77％可倾析)和70％(67％可倾析)，这与pH为5和13时生物质的粘度明显增加是一致的。
使用在4℃下陈化7天的鳄梨泥进行另外的测试。油脂回收率从新鲜生物质的94％降低到陈化生物质的80％(pH＝6.4)，相转化后在生物质的质地上有着显著的差异，从砂质颗粒到粘性簇。这些变化可能与陈化过程中的酶促反应有关，并且，例如在拌合、冷压生产中涉及的破乳步骤中，升高的温度可以促进这种反应(Da Silva,C.,&Da Silva,C.(2018)，U.S.专利号9,894,908.华盛顿特区：美国专利和商标局)。
最后，可以理解的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本文所述的本发明的方法和组合物的各种修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管本发明已经结合具体优选的实施方案进行了描述，但应该理解，所要求的本发明不应该被不适当地限制在这些具体的实施方案中。实际上，对本领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的所述方式的各种修改都旨在落入本发明的范围内。

Claims (22)

1.一种从水性生物质中回收有机成分的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供包含有机成分的水性生物质；
(ii)处理所述水性生物质以从生物质的细胞内释放出细胞内有机成分以形成生物质悬浮液；
(iii)将水不混溶性成分添加到所述生物质悬浮液中以形成包含生物质和水不混溶性成分的混合物；
(iv)所述包含生物质和水不混溶性成分的混合物经受高剪切以形成水不混溶性成分包水的乳液；
(v)将包含有机成分的水不混溶性成分相与水相分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机成分选自脂质、蛋白质、碳水化合物、色素及其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述包含有机成分的水性生物质具有基于重量计1％至50％的固体含量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物质是含油生物质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物质包含选自水藻、植物(或其部分)、真菌、细菌、原生动物及其组合的生物体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述处理包括使所述生物质经受加工，所述加工选自高压均质化、珠研磨、声波处理、脉冲电场、渗透压力、酶促处理、微波辐射、机械压制或制泥。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(ii)中对所述生物质进行高压均质化。
8.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(ii)中对所述生物质进行声波处理。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，添加到所述生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率为至少1.0：1.0(v/v)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(iii)中，添加到所述生物质悬浮液中的水不混溶性成分的量足以形成混合物，其中水不混溶性成分：生物质悬浮液的比率为至少1.5：1.0(v/v)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述水不混溶性成分是水不混溶性粗生物质提取物。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述水不混溶性成分是水不混溶性溶剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，通过声波处理包含生物质/水不混溶性成分的混合物，而使其经受高剪切。
14.根据权利要求13所述的方法，其中包含生物质/水不混溶性成分的混合物经受20kHz至200kHz频率的声波处理。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中包含生物质/水不混溶性成分的混合物经受20kHz至40kHz频率的声波处理。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中以大于0.8W/mL的功率密度对包含生物质/水不混溶性成分的混合物进行声波处理。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，通过对包含生物质和水不混溶性成分的混合物进行高压均质化，使得包含生物质和水不混溶性成分的混合物经受高剪切。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述高压均质化在10MPa至200MPa的压力下进行。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其中所述高压均质化在10MPa至150MPa的压力下进行。
20.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述高压均质化在30MPa至100MPa的压力下进行。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在步骤(v)中，将所述水不混溶性成分相与所述水相分离包括以小于10,000×g的力离心不超过10分钟。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，还包括从水不混溶性相中分离所述有机成分的步骤(vi)。
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