CN103323553B

CN103323553B - 一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法

Info

Publication number: CN103323553B
Application number: CN201310272510.XA
Authority: CN
Inventors: 尹冬丽; 叶芳; 刘春霞; 魏丹; 张旭东
Original assignee: Huaren Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Huaren Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103323553A

Abstract

本发明提供一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质定量检测方法，其特点是：包括（1）制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的限度确定；（2）检测方法的方法学验证及制剂中乙酰半胱氨酸有关物质的测定。采用HPLC检测方法，参照制剂中允许活性成分杂质的限度值及本制剂现有工艺，确定三种有关物质的定量限度；从专属性、线性、加样回收率、重复性、耐用性等方面对该检测方法进行方法学验证，证明器官保存液A液原液直接进样检测结果良好。摒弃不适用的自身对照定量法，首次实现了对器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质进行外标法定量测定，有效地控制了器官保存液的质量，有利于指导工艺研究，提高产品安全性。

Description

一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体说是一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法。

背景技术

器官保存液一般采用双室袋包装，器官保存液A液在第一腔室，其余成分为B液处在第二腔室，相邻腔室之间为弱焊接隔带，通过挤压将中间的弱焊接隔带打开，使两腔室中的药液混匀，即可使用，保存效果更好。现有工艺下生产出的器官保存液A液中，乙酰半胱氨酸的含量下降明显，乙酰半胱氨酸含量在灭菌前后普遍降低2%～3%，并且产品中残氧越高，乙酰半胱氨酸降低越明显，长时间放置甚至某些袋中乙酰半胱氨酸的含量可降至80%，溶液颜色明显变黄。但是目前没有合适的方法检验当前制备工艺下乙酰半胱氨酸可能产生的有关物质，质量控制不严格，无法精确指导工艺研究，特别是产品存在着安全隐患。

《化学药物杂质研究技术指导原则》中标明：已知杂质对主成分的相对响应因子在0.9-1.1范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量，超出0.9-1.1范围时，宜用杂质对照品法计算含量。本申请人结合现有工艺下的试验数据及自身对照数据，计算各有关物质相对于乙酰半胱氨酸的相对响应因子均超出0.9-1.1范围，即自身对照法不适用于此处乙酰半胱氨酸有关物质的检测。

如何找到一种快速、准确并能定量检测器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的方法，这是困扰本领域技术人员的技术难题，长期以来一种未能解决。

《中国药典》（2010版）中记载有乙酰半胱氨酸颗粒中乙酰半胱氨酸有关物质的检测方法，乙酰半胱氨酸颗粒中乙酰半胱氨酸有关物质的检测方法为：HPLC检测方法：照高效液相色谱法（附录ⅢD）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Kromasil C18,25cm×4.6mm,5μm）；流速：1.0ml/min；流动相：硫酸铵缓冲液（取硫酸铵2.25g，庚烷磺酸钠1.82g，用水稀释至450ml，用7M盐酸溶液调pH值为1.4-2.0）-甲醇（88:12）；检测波长为205nm；10μl进样。乙酰半胱氨酸颗粒有关物质检测中记载的只是L-胱氨酸与L-半胱氨酸，而没有检测其他有关物质。

如何提供一种对器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法，以便精确指导器官保存液的工艺研究，使器官保存液质量得到严格控制，并提高产品安全性，这是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明为解决现有技术存在的问题，提供一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法，摒弃不适用的自身对照定量法，对器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的进行定量检测（数量、种类及含量），可以更好地对器官保存液A液质量进行控制，从而指导工艺研究，提高产品安全性。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质定量检测方法的建立，其特征在于，包括如下步骤：

（1）限度确定

参照制剂中允许活性成分杂质的限度值，结合自身工艺与产品质量，确定各有关物质限度为：L-半胱氨酸20μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质C即N,N-双乙酰胱氨酸30μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质D即N,S-双乙酰半胱氨酸20μg/ml。

（2）检测方法及样品制备

检测方法为HPLC检测方法：照《中国药典》2010版附录ⅢD的高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.8-1.2ml/min；流动相：含0.02M庚烷磺酸钠或正戊烷磺酸钠、0.5%w/v硫酸铵的硫酸铵缓冲液（即硫酸铵缓冲液中除含0.5%w/v硫酸铵之外，还含0.02M庚烷磺酸钠或0.02M正戊烷磺酸钠），用盐酸溶液调pH值为1.4-2.0，硫酸铵缓冲液与甲醇混合，硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例为85-95:15-5；柱温为25-35℃；检测波长为203-215nm；10μl进样；

杂质对照储备液的制备：精密称取乙酰半胱氨酸杂质C对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取乙酰半胱氨酸杂质D对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取盐酸半胱氨酸对照品14.50mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；精密称取胱氨酸对照品10.07mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；

乙酰半胱氨酸储备液的制备：精密称取乙酰半胱氨酸对照品16.4mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀备用；

杂质对照溶液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C对照储备液3.00ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液2.00ml，半胱氨酸对照储备液各1.00ml置10ml量瓶中，用流动相定容，即得含三种有关物质的对照溶液；

系统适用性溶液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C对照储备液3.00ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液2.00ml，乙酰半胱氨酸、半胱氨酸与胱氨酸对照储备液各1.00ml置10ml量瓶中，用流动相定容，即得含乙酰半胱氨酸与四种有关物质的系统适用性溶液；

供试品溶液的制备：器官保存液A液，取原液直接进样。

（3）样品测定

依照所述HPLC检测方法，取器官保存液A液原液10μl直接进样，记录色谱图，外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，试验累积数据表明，器官保存液A液中三种有关物质的含量分别为：L-半胱氨酸含量范围为5-24μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质C即N,N-双乙酰胱氨酸的含量范围15-36μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质D即N,S-双乙酰半胱氨酸的含量范围为6-15μg/ml。

对上述技术方案的改进：胱氨酸对照品用流动相稀释至50ml容量瓶之前，先用1ml左右的0.1M HCL或NaOH溶解，再定容。

对上述技术方案的进一步改进：所述检测方法用于器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质检测时，为L-半胱氨酸，乙酰半胱氨酸杂质C即N,N-双乙酰胱氨酸，乙酰半胱氨酸杂质D即N,S-双乙酰半胱氨酸的外标法定量方法学模型。

对上述技术方案的进一步改进：所述HPLC液相条件中，流动相中硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例为88:12。

对上述技术方案的进一步改进：所述HPLC液相条件中，流动相中硫酸铵缓冲液的pH为1.4-1.5。

对上述技术方案的进一步改进：所述HPLC液相条件中，柱温为28-30℃。

对上述技术方案的进一步改进：所述HPLC液相条件中，检测波长为203-207nm。

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

通过对现有工艺下生产出的器官保存液A液及原辅料进行强制降解试验，结果表明器官保存液中乙酰半胱氨酸氧化分解产生的有关物质为：L-半胱氨酸、乙酰半胱氨酸杂质C（N,N-双乙酰胱氨酸）、乙酰半胱氨酸杂质D（N,S-双乙酰半胱氨酸），而不是《中国药典》2010版中乙酰半胱氨酸颗粒有关物质检测中记载的L-胱氨酸与L-半胱氨酸。摒弃不适用的自身对照定量法，借鉴《中国药典》2010版中乙酰半胱氨酸颗粒有关物质检测方法，本发明提供一种对器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法，以便精确指导器官保存液的工艺研究，使器官保存液质量得到严格控制，并提高产品安全性。通过验证，本发明灵敏度高，专属性强，阴性对照无干扰，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能指导科学研究和生产工艺，能更有效地控制器官保存液A液的产品质量，确保产品安全性。

具体实施方式

本发明一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质的定量检测方法的实施方式如下：

（1）限度确定

参照制剂中允许活性成分杂质的限度值，结合自身工艺与产品质量，确定各有关物质限度为：L-半胱氨酸20μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质C（N,N-双乙酰胱氨酸）30μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质D（N,S-双乙酰半胱氨酸）20μg/ml。

（2）检测方法及样品制备

检测方法为HPLC检测方法：照《中国药典》2010版附录ⅢD的高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.8-1.2ml/min；流动相：含0.02M庚烷磺酸钠或正戊烷磺酸钠、0.5%w/v硫酸铵的硫酸铵缓冲液（即硫酸铵缓冲液中除含0.5%w/v硫酸铵之外，还含0.02M庚烷磺酸钠或0.02M正戊烷磺酸钠），盐酸溶液调pH值为1.4-2.0，硫酸铵缓冲液与甲醇混合，硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例为（85-95）:（15-5）；柱温为25-35℃；检测波长为203-215nm；10μl进样；

杂质对照储备液的制备：精密称取乙酰半胱氨酸杂质C对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取乙酰半胱氨酸杂质D对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取盐酸半胱氨酸对照品14.50mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；精密称取胱氨酸对照品10.07mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀（胱氨酸难溶，可先用1ml左右的0.1M HCL或NaOH溶解，再定容）；

系统适用性溶液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C对照储备液3.00ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液2.00ml，乙酰半胱氨酸、半胱氨酸与胱氨酸对照储备液各1.00ml置10ml量瓶中，用流动相定容，即得含乙酰半胱氨酸与四种有关物质的系统适用性溶液。

供试品溶液的制备：器官保存液A液，取原液直接进样。

（3）样品测定及方法学验证

依照以上HPLC检测方法，分别取系统适用性溶液、流动相溶液、水、乙酰半胱氨酸对照品溶液、乙酰半胱氨酸三种有关物质对照溶液以及三种有关物质的对照混合溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从专属性、线性、加样回收率、重复性、耐用性等方面对该检测方法进行方法学验证。

本发明具体实施例为：

一、检测方法及样品制备

检测方法为HPLC检测方法：照《中国药典》2010版附录ⅢD的高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.8-1.2ml/min；流动相：含0.02M庚烷磺酸钠或正戊烷磺酸钠、0.5%w/v硫酸铵的硫酸铵缓冲液，盐酸溶液调pH值为1.4-2.0，硫酸铵缓冲液与甲醇混合，硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例为（85-95）:（15-5）；柱温为25-35℃；检测波长为203-215nm；10μl进样；

上述HPLC液相条件中，流动相中硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例优选为88:12，流动相中硫酸铵缓冲液优选的pH为1.4-1.5，优选的柱温为28-30℃，优选的检测波长为203-207nm。

阴性溶液制备：按处方量称取不含乙酰半胱氨酸的其余原辅料，用水定容摇匀即得。

供试品溶液的制备：器官保存液A液，取原液直接进样。

二、限度确定

制剂中乙酰半胱氨酸处方量为16.4mg/ml，稀释100倍后浓度为16.4μg/ml。参照制剂中允许活性成分杂质的限度值，结合自身工艺与产品质量，确定各有关物质限度为：L-半胱氨酸20μg/ml（对应自身对照法≤0.5%），乙酰半胱氨酸杂质C（N,N-双乙酰胱氨酸）30μg/ml（对应自身对照法约为1.5%），乙酰半胱氨酸杂质D（N,S-双乙酰半胱氨酸）20μg/ml（对应自身对照法约为1.0%）,如表1所示。

表1制剂中乙酰半胱氨酸及其有关物质浓度与峰面积对应表

名称	浓度（μg/ml）	峰面积（AU)
			乙酰半胱氨酸	16.4	131816
胱氨酸	29.73	128286
			半胱氨酸	59.62	125448
乙酰半胱氨酸杂质C	19.44	127389
			乙酰半胱氨酸杂质D	19.6	120759

三、方法学验证

1、专属性

依照以上HPLC检测方法，分别取系统适用性溶液、流动相溶液、水、乙酰半胱氨酸对照品溶液、乙酰半胱氨酸三种有关物质对照溶液以及三种有关物质的对照混合溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，该检测方法可以较好地检测器官保存液中乙酰半胱氨酸及其四种有关物质，分离度等系统适用性结果良好，并且其他原辅料对有关物质的检测没有影响。

2、定量限与检测限

将各个有关物质的对照储备液进行不同浓度的稀释，得乙酰半胱氨酸三种有关物质的定量限检测限，见表2：

表2乙酰半胱氨酸三种有关物质的定量限与检测限

3、线性与范围

杂质对照储备液的制备：精密称取乙酰半胱氨酸杂质C对照品10mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；10mg/瓶乙酰半胱氨酸杂质D对照品直接用流动相溶出瓶内物质，定容至50ml容量瓶中；精密称取盐酸半胱氨酸对照品14.50mg，用流动相稀释至25ml容量瓶中，摇匀。

线性储备液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C对照储备液30ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液20ml，半胱氨酸对照储备液各10ml置100ml量瓶中，用流动相定容摇匀即得。

分别精密量取线性储备液0.5ml、0.75ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml置10ml容量瓶中（L-半胱氨酸，乙酰半胱氨酸杂质C，乙酰半胱氨酸杂质D的线性浓度为：定量限到160%限度浓度），用流动相定容摇匀，10μl进样，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果表明在杂质C（N,N-双乙酰胱氨酸）在3.02μg/ml-48.44μg/ml范围内线性良好，杂质C（N,S-双乙酰半胱氨酸）在2.01μg/ml-32.19μg/ml范围内线性良好，半胱氨酸在2.02μg/ml-32.31μg/ml范围内线性良好（见表3、表4、表5）。

4、准确度（加样回收率）

按处方量配制器官保存液A液1000ml，取原液进样测定，外标法定量后，含量分别为L-半胱氨酸含量为0，乙酰半胱氨酸杂质C含量为3.4μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质D含量为0。分别精密称定L-半胱氨酸14.50mg，乙酰半胱氨酸杂质C15mg，乙酰半胱氨酸杂质D10mg各三份；L-半胱氨酸28.99mg，乙酰半胱氨酸杂质C30mg，乙酰半胱氨酸杂质D20mg；L-半胱氨酸43.49mg，乙酰半胱氨酸杂质C45mg，乙酰半胱氨酸杂质D30mg各三份（50%、100%、150%限度浓度）置于100ml容量瓶中，用水进行定容摇匀。再精密量取1.00ml置于10ml容量瓶中，用制剂定容摇匀备用。

依照以上HPLC检测方法，分别取10μl进样，记录色谱图，外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，计算回收率及RSD%，结果见表3、表4、表5。

5、重复性与中间精密度

取Z1209001批器官保存液，原液6次重复进样，检测仪器为：Waters2695-2489，记录色谱图。外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量及其RSD%，结果表明试验结果良好，均符合要求（见表3、表4、表5）。

不同操作人员，取Z1209001批器官保存液，取原液6次重复进样，检测仪器为：Aglient1200，记录色谱图。外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，计算12个数据的RSD%，结果表明试验结果良好，均符合要求（见表3、表4、表5）。

6、耐用性

6.1溶液稳定性

取Z1209001批器官保存液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取原液进样，记录色谱图。外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，结果表明8h内溶液稳定性良好（见表3、表4、表5）。

6.2流动相比例变化±5%、波长变化±2nm、流速变化±20%

HPLC条件中，流速：0.8-1.2ml/min；流动相比例为（85-95）:（15-5）；检测波长为203-215nm；取Z1209001批器官保存液原液10μl进样；记录色谱图。外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，实验结果良好，符合要求（见表3、表4、表5）。

表3乙酰半胱氨酸杂质C含量液相方法学验证

表4乙酰半胱氨酸杂质D含量液相方法学验证

表5半胱氨酸含量液相方法学验证

四、样品测定

依照以上HPLC检测方法，分别取Z1211001批、Z1211002批、Z1211003批器官保存液原液进样，记录色谱图。外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，结果如表6所示。

表6制剂检测结果

当然，上述说明并非是对发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）检测方法及样品制备

检测方法为HPLC检测方法：照《中国药典》2010版附录Ⅲ D的高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.8-1.2 ml/min；流动相：含0.02M庚烷磺酸钠或正戊烷磺酸钠、0.5 %w/v硫酸铵的硫酸铵缓冲液，盐酸溶液调pH值为1.4-1.5 ，硫酸铵缓冲液与甲醇混合，硫酸铵缓冲液与甲醇的体积比例为88:12；柱温为28-30℃；检测波长为203-207 nm；10μl进样；

杂质对照储备液的制备：精密称取乙酰半胱氨酸杂质C对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取乙酰半胱氨酸杂质D对照品10mg，用流动相稀释至100ml容量瓶中，摇匀；精密称取盐酸半胱氨酸对照品14.50 mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；精密称取胱氨酸对照品10.07mg，用流动相稀释至50ml容量瓶中，摇匀；

杂质对照溶液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C 对照储备液3.00ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液2.00ml，半胱氨酸对照储备液各1.00ml置10ml量瓶中，用流动相定容，即得含三种有关物质的对照溶液；

系统适用性溶液的制备：分别精密量取乙酰半胱氨酸杂质C 对照储备液3.00ml，乙酰半胱氨酸杂质D对照储备液2.00ml，乙酰半胱氨酸、半胱氨酸与胱氨酸对照储备液各1.00ml置10ml量瓶中，用流动相定容，即得含乙酰半胱氨酸与四种有关物质的系统适用性溶液；

供试品溶液的制备：器官保存液A液，取原液直接进样；

（2）样品测定

依照所述HPLC检测方法，取器官保存液A液原液10μl直接进样，记录色谱图，外标法计算制剂中乙酰半胱氨酸三种有关物质的含量，试验累积数据表明，器官保存液A液中三种有关物质的含量分别为：L-半胱氨酸含量范围为5-24 μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质C即N,N-双乙酰胱氨酸的含量范围15-36 μg/ml，乙酰半胱氨酸杂质D即N,S-双乙酰半胱氨酸的含量范围为6-15 μg/ml；

上述杂质对照储备液的制备时，胱氨酸对照品用流动相稀释至50ml容量瓶之前，先用1ml的0.1M HCL或NaOH溶解，再定容；

所述检测方法用于器官保存液中乙酰半胱氨酸有关物质检测时，为L-半胱氨酸，乙酰半胱氨酸杂质C即N,N-双乙酰胱氨酸，乙酰半胱氨酸杂质D即N,S-双乙酰半胱氨酸的外标法定量方法学模型。