CN101803594A - 一种器官保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种器官保存液及其制备方法,其特点是:在每1000ml器官保存液中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmol;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;右旋糖酐-40 16-24g;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmol;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水。所述的器官保存液采用双室袋包装,器官保存液中的右旋糖酐-40处在第一腔室,其余成分处在第二腔室,相邻腔室之间为弱焊接隔带。器官保存液稳定性好,成本较低;器官保存液制备方法工艺较为简单、合理,适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械及医学生物学技术领域,涉及人体或动物的器官组织或细胞的保存液,具体说是一种器官保存液及其制备方法。
背景技术
人类从20世纪初开始的器官移植技术,历经百年的艰辛探索,已成为救治脏器功能衰竭终末期的有效、常规性手段。特别是发达国家器官移植技术现已成为医学领域的一门新兴学科,取得了丰硕的成果和巨大进展。人们对器官移植的依赖也日益加重,在美国,每16分钟就有一个人加入到等待器官移植的行列,而我国年新增尿毒症患者达20万人。据我国器官移植登记处不完全统计,截至2005年,我国累计完成器官移植7.3万余例,目前每年完成超过7000例,数量仅次于美国;心脏移植取得突破性进展,此外骨髓移植、胰岛细胞移植、胰肾联合移植、多器官移植也不断取得新的成绩。
器官移植时供体器官的高效保存是保证移植成功的关键之一。合适的灌注保存液,对减少或减慢器官保存过程中的各种损伤、延长器官保存时间及提高器官质量具有十分重要的意义。目前我国临床应用的主要为进口器官保存液,如UW液、HTK液,其价格高昂,加大了患者的经济负担。国内虽然有器官保存液的专利和文献报道,但至今仍无一器官保存液经国家批准可在医疗市场流通。即使上海长征医院的长征-1号器官保存液也只是医院制剂,只能在其医院内部应用,且仅限于肾脏移植,影响了其普及推广。
UW液,是1988年美国威斯康星大学(University of Wisconsin)的研究人员研发的一种可以将离体移植器官保存较长时间的药液,是目前研制出的最为成功的长效多器官保存液,1989年获FDA批准,现已在国际上广泛应用,成为器官保存技术的金标准。但其黏滞偏高影响原位灌注,降温速度慢,钾离子含量过高,使用不当会引起术中心跳骤停,且价格昂贵。
随着外科手术、免疫抑制药物、器官和细胞分离保存技术及移植免疫学基础的迅速发展,器官移植已成为倍受关注的治疗方法,器官需求量激增,也迫切需要研制新型器官保存液,以求高效保存器官。而我国由于缺乏类似于UW或优于UW液这样的长效多器官保存液,从某种意义上说,限制和阻碍了除肾脏移植以外的其它大器官移植工作的发展,因此,目前迫切需要开发研制一种稳定性好、成本较低、使用效果好的多器官保存液。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题而提供一种器官保存液,其稳定性好,成本较低;提供一种器官保存液制备方法,其工艺较为简单、合理,适合规模化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种器官保存液,其特征在于:在每1000ml器官保存液中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmol;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;右旋糖酐-4016-24g;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmol;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水。
对上述技术方案的改进:所述的器官保存液采用双室袋包装,器官保存液中的右旋糖酐-40处在第一腔室,其余成分处在第二腔室,相邻腔室之间为弱焊接隔带。
对上述技术方案的进一步改进:第一腔室内为500ml,含有20g右旋糖酐-40,余量为注射用水;第二腔室内为500ml,含有枸橼酸钾7.10-7.30g;磷酸二氢钠0.90-0.95g;磷酸氢二钠4.91-5.22g;硫酸镁1.03-1.12g;氯化钾0.094-0.210g;甘露醇21.70-23.20g;腺苷1.14-1.28g;乙酰半胱氨酸0.72-0.80g;氢氧化钠0.18-0.19g;余量为注射用水。
一种上述器官保存液的制备方法,其特征在于,按照1000ml器官保存液配制量,由500ml A液和500ml B液组成,具体步骤如下:
(1)先配制500ml A液,取16-24g右旋糖酐-40加入适量注射用水,加热溶解,加入3-5g针用活性炭,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值5.0~6.0,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋中的第一腔室,加塞;
(2)再配制500ml B液,其中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmol;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmol;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水;具体配制步骤为:
a、取腺苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、枸橼酸钾、氯化钾、甘露醇加适量注射用水,加热溶解后,再加入硫酸镁,搅拌使溶解,加入0.2g针用活性炭,搅拌,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液备用;
b、将乙酰半胱氨酸与氢氧化钠用适量注射用水溶解,搅拌均匀后加入a步骤制备的溶液中,加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值7.3~7.4,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋的第二腔室,充入适量氮气,加塞。
上述器官保存液的制备方法中,优选的,500ml B液中,含有枸橼酸钾7.10-7.30g;磷酸二氢钠0.90-0.95g;磷酸氢二钠4.91-5.22g;硫酸镁1.03-1.12g;氯化钾0.094-0.210g;甘露醇21.70-23.20g;腺苷1.14-1.28g;乙酰半胱氨酸0.72-0.80g;氢氧化钠0.18-0.19g;余量为注射用水。
上述器官保存液的制备方法中,还包括以下步骤:
(1)产品经115℃、30分钟高压蒸汽灭菌;
(2)将灭菌后的产品与抗氧剂一起装入外包袋后,进行真空外包。
本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果
1、本发明所用原辅料全部为国产的符合国家药品标准或美国药典标准的药用成份,质量稳定,安全性提高,可达输液质量标准,主要性能指标基本达到进口保存液的水平,而价格可以大幅度降低。
2、本发明可规模化大生产,生产成本较低,生产工艺稳定、可重复性高;
3、本发明器官保存液采用双室袋包装,器官保存液中的右旋糖酐-40处在第一腔室,其余成分处在第二腔室,相邻腔室之间为弱焊接隔带,通过挤压将中间的弱焊接隔带打开,使两腔室中的药液混匀,即可使用,保存效果更好。
4、本发明组分间无配伍禁忌,可以高温高压消毒,制备、运输及使用均简单方便。
具体实施方式
本发明每1000ml器官保存液的配比如表1:
表1
因本发明器官保存液显弱碱性,右旋糖酐-40在弱碱性环境中长时间高温消毒不稳定,光、氧等对乙酰半胱氨酸也有影响,故本品采用双室袋(第一、二腔室)包装,即右旋糖酐-40处在第一腔室,其余成分处在第二腔室,相邻腔室之间为弱焊接隔带,使用时撕去产品外包,通过挤压将中间的弱焊接隔带打开,使第一、二两腔室中的药液混匀,即可使用。
第一腔室内的配比:
第一腔室内的500ml A液,其中,右旋糖酐-4020g,余量为注射用水;
第二腔室内的配比:
第二腔室内的500ml B液,其中,含有枸橼酸钾7.10-7.30g;磷酸二氢钠0.90-0.95g;磷酸氢二钠4.91-5.22g;硫酸镁1.03-1.12g;氯化钾0.094-0.210g;甘露醇21.70-23.20g;腺苷1.14-1.28g;乙酰半胱氨酸0.72-0.80g;氢氧化钠0.18-0.19g;余量为注射用水。
本发明一种上述器官保存液制备方法的实施例,按照1000ml器官保存液配制量,由500ml A液和500ml B液组成,具体步骤如下:
(1)先配制500ml A液,取16-24g右旋糖酐-40加入适量注射用水,加热溶解,加入3-5g针用活性炭,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值5.0~6.0,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋中的第一腔室,加塞;
(2)再配制500ml B液,其中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmo l;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmol;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水;具体配制步骤为:
a、取腺苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、枸橼酸钾、氯化钾、甘露醇加适量注射用水,加热溶解后,再加入硫酸镁,搅拌使溶解,加入0.2g针用活性炭,搅拌,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液备用;
b、将乙酰半胱氨酸与氢氧化钠用适量注射用水溶解,搅拌均匀后加入a步骤制备的溶液中,加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值7.3~7.4,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋的第二腔室,充入适量氮气,加塞。
(3)产品经115℃、30分钟高压蒸汽灭菌;
(4)将灭菌后的产品与抗氧剂一起装入外包袋后,进行真空外包。
第二腔室内500ml B液优选的配比如表2:
表2
本发明处方组成具有以下特点:
(1)K+、Na+、Mg2+、Cl-、PO4 3-、HCO3 -、SO4 2-模拟细胞内液的环境,高K+、低Na+、低Cl-的离子浓度与细胞内液更为相近,使得细胞内外离子浓度相近,保存器官期间细胞内外离子交换减少,能量消耗减少,有利于再灌注时迅速恢复跨膜的离子梯度和细胞功能,能阻止细胞水肿的发生;
(2)磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、乙酰半胱氨酸/氢氧化钠:作为缓冲对系统,使溶液pH值稳定在7.2~8.0之间,在维持细胞内pH值的组织内环境缓冲能力方面起着重要作用,可有效的抑制细胞酸中毒,降低糖酵解,保证了细胞内ATP水平;
(3)硫酸镁:Mg2+对维持细胞膜的完整性具有重要作用。在细胞膜上Mg2+与Ca2+具有共同的通道,故可与Ca2+相竞争而防止Ca2+的内流;
(4)乙酰半胱氨酸:乙酰半胱氨酸是一种巯基的物质,是体内游离巯基的重要组成部分之一,也是谷胱甘肽(GSH)的前体物质,它可促进GSH的合成,增加GSH的含量,可清除自由基,提高白细胞内还原巯基水平,抑制白细胞激活和炎症介质的产生,可抑制冷缺血/再灌注损伤,改善微循环;
(5)右旋糖酐-40:具有扩张血管、改善微循环、增加溶液黏度的作用,减少了细胞能量代谢的毒性产物的堆积,有利于再灌注;
(6)甘露醇:作为氧自由基的清除剂,可防止氧自由基的损伤,同时兼有渗透支持作用,有效抑制细胞水肿。其代谢是惰性的,不会增加“底物压力”和能量转换,不经过特殊的转运系统进入细胞。同时高渗的甘露醇还能减轻内皮细胞肿胀,增强细胞活力;
(7)腺苷:作为能量底物,在缺血再灌注间ATP的合成提供前体的物质,为缺氧条件下的细胞提供足够的能量;
(8)维持溶液的高渗性,溶液渗透压310~350mOsm/Kg,有助于减轻细胞水肿;
(9)原料全部为国产的符合国家药品标准或美国药典标准的药用成份。
本发明体外保存功能的试验及结果:
(1)动物及分组:取150-200g的Wistar雄性大鼠,随机分为3组,每组8只。第1组为正常组,肾脏4℃生理盐水切取后立即检测;第2组为HTK保存液对照组,将离体肾置于4℃HTK保存液中保存24h;第3组为实验组,将离体肾置于本发明保存液中4℃保存24h。
(2)建立体外动物实验模型:术前动物禁食12h,用质量浓度为30g/L戊巴比妥钠按1ml/kg腹腔注射,麻醉后腹腔内给药肝素500U/kg。取正中切口,在肾动脉汇入腹主动脉的平面上下1公分完整游离腹主动脉,在肾静脉汇入腔静脉平面下切断腔静脉,游离腹主动脉上下两端阻断后,依据动物分组,用4℃生理盐水、HTK保存液、本发明保存液作重力灌洗,灌洗压力保持在9.8KPa(100cm H2O),轻轻压肾脏,灌洗至肾表面苍白、肾静脉流出液清亮为止,约2min,灌洗液用量一般为5-10ml。
(3)分离肾细胞线粒体:将肾皮质剪碎、净血,磨成匀浆,低温高速(3000r/min)离心7min,取上清液离心(4000r/min)15min,将沉淀与0.25mol/L蔗糖溶液混匀后离心(4000r/min)10min,沉淀物即为线粒体。
(4)线粒体中钙含量测定:将肾细胞线粒体制成每毫升含2~3mg线粒体蛋白的悬浮液,在日立Z28000偏振塞曼原子吸收分光光度计以火焰法直接测定钙含量。
(5)肾组织腺苷酸提取与检测:取肾组织50mg于0℃下置于以液氮预冷的乳钵中研磨成粉末,加冰冻的0.4mol/L高氯酸溶液3ml,冰浴中制成匀浆,0℃条件下反应30min后离心(4000r/min)20min,取上清液以0.5mol/L的KOH中和,将pH调至7.0~7.2,于冰浴中冷却15min后第2次离心(0℃,3000r/min)10min,取上清液于-25℃保存备用。利用Gilson系列高效液相色谱分析仪进行样品检测。
试验结果:
各组肾皮质细胞线粒体内钙含量和肾组织ATP含量见表3。与肾切取后立即检测组相比,在HTK保存液和本发明保存液保存24h后肾细胞线粒体内Ca2+和ATP含量可得到显著改善,两组间无显著差异。
不同保存液组肾皮质细胞线粒体内Ca2+含量和肾组织中ATP的含量:
表3
注:生理盐水组与其它各组之间均存在统计学上差异;HTK保存液和本发明保存液组间不存在统计学上差异。
本发明(动物)体内保存功能试验及结果:
取150-200g的Wistar雄性大鼠共30只,随机分为3组,每组10只。第1组为正常组,肾脏4℃生理盐水切取后立即检测;第2组为HTK保存液对照组,将离体肾置于4℃HTK保存液中保存24h;第3组为实验组,将离体肾置于本发明保存液中4℃保存24h。将保存24小时后的肾脏移植给雄性SD大鼠。观察肾移植后一周受体鼠存活情况,观察和比较术后一周血肌酐值。
移植后存活分析:经生理盐水、HTK保存液、本发明保存液保存供肾24h后行移植实验各10只。移植后生理盐水组术后一周存活7只,本发明保存液组术后一周均存活9只,HTK保存液术后一周存活10只。
移植肾功能恢复:生理盐水组术后一周存活的7只动物,血肌酐水平56-109μmol/dl,平均80.1±19.2μmol/dl;HTK保存液术后一周存活的10只动物,血肌酐水平40-82μmol/dl,平均50.1±4.2μmol/dl;本发明保存液组术后一周存活的9只动物,血肌酐水平40-79μmol/dl,平均49.9±9.2μmol/dl。生理盐水组与其它各组间存在显著差异,HTK保存液组、本发明保存液组肾功能无统计学显著差异。
当然,上述说明并非是对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例,本技术领域的普通技术人员,在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,都应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种器官保存液,其特征在于:在每1000ml器官保存液中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmol;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;右旋糖酐-4016-24g;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmo l;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水。
2.按照权利要求1所述的器官保存液,其特征在于:所述的器官保存液采用双室袋包装,器官保存液中的右旋糖酐-40处在第一腔室,其余成分处在第二腔室,相邻腔室之间为弱焊接隔带。
3.按照权利要求2所述的器官保存液,其特征在于:第一腔室内为500ml,含有20g右旋糖酐-40,余量为注射用水;第二腔室内为500ml,含有枸橼酸钾7.10-7.30g;磷酸二氢钠0.90-0.95g;磷酸氢二钠4.91-5.22g;硫酸镁1.03-1.12g;氯化钾0.094-0.210g;甘露醇21.70-23.20g;腺苷1.14-1.28g;乙酰半胱氨酸0.72-0.80g;氢氧化钠0.18-0.19g;余量为注射用水。
4.一种上述器官保存液的制备方法,其特征在于,按照1000ml器官保存液配制量,由500ml A液和500ml B液组成,具体步骤如下:
(1)先配制500ml A液,取16-24g右旋糖酐-40加入适量注射用水,加热溶解,加入3-5g针用活性炭,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值5.0~6.0,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋中的第一腔室,加塞;
(2)再配制500ml B液,其中含有:枸橼酸钾21~29mmol;磷酸二氢钠6~10mmol;磷酸氢二钠30~45mmol;硫酸镁4~6mmol;氯化钾1~3mmol;甘露醇110~150mmol;腺苷4~6mmol;乙酰半胱氨酸4~6mmol;氢氧化钠4~6mmol;余量为注射用水;具体配制步骤为:
a、取腺苷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、枸橼酸钾、氯化钾、甘露醇加适量注射用水,加热溶解后,再加入硫酸镁,搅拌使溶解,加入0.2g针用活性炭,搅拌,煮沸保温20-40分钟,乘热滤过,滤液备用;
b、将乙酰半胱氨酸与氢氧化钠用适量注射用水溶解,搅拌均匀后加入a步骤制备的溶液中,加注射用水至500ml,搅拌均匀,调节pH值7.3~7.4,测定含量,微孔滤膜滤过,装入双室袋的第二腔室,充入适量氮气,加塞。
5.按照权利要求4所述的器官保存液制备方法,其特征在于,所述500ml B液中,含有枸橼酸钾7.10-7.30g;磷酸二氢钠0.90-0.95g;磷酸氢二钠4.91-5.22g;硫酸镁1.03-1.12g;氯化钾0.094-0.210g;甘露醇21.70-23.20g;腺苷1.14-1.28g;乙酰半胱氨酸0.72-0.80g;氢氧化钠0.18-0.19g;余量为注射用水。
6.按照权利要求4或5所述的器官保存液制备方法,其特征在于,还包括以下步骤:
(1)产品经115℃、30分钟高压蒸汽灭菌;
(2)将灭菌后的产品与抗氧剂一起装入外包袋后,进行真空外包。
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