CN103319578A - 来源于甘蓝枯萎病菌的影响致病力和分生孢子产生的基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于甘蓝枯萎病菌的影响致病力和分生孢子产生的基因及其应用。该蛋白是具有序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列。该蛋白经转基因实验表明，该基因具有影响甘蓝枯萎病菌致病力和分生孢子产生的功能，该基因在甘蓝枯萎病菌失活后可以大大降低其致病力和分生孢子产生的能力。

Description

来源于甘蓝枯萎病菌的影响致病力和分生孢子产生的基因及应用

技术领域

本发明涉及植物保护领域中来源于甘蓝枯萎病菌的影响致病力和分生孢子产生的基因及其应用。

背景技术

甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)是由尖孢镰刀菌引起的一种世界性的真菌土传病害(郝晓娟，刘波，谢关林.植物枯萎病生物防治研究进展[J].中国农学通报，2005,21(7):319-322.)，尖孢镰刀菌属半知菌类(Fungiimperfecti）、梗孢目（Moniliales）、痤孢科（Tubercular）、镰刀菌属（Fusarium）。能够引起瓜类、茄科、豆科、十字花科以及花卉和经济作物等100余种植物枯萎病的发(HarterL L.Fusarium wilt of cabbage[J].Science，1909,30(782):934.李明远，张涛涛，李兴红，等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定[J].植物保护，2003,29(3):44-45.)。甘蓝在我国种植面积约1300余万亩，甘蓝枯萎病造成的年平均损失20-30%，严重时可能绝产，每年造成直接经济损失达几亿元人民币。该病已经成为严重危害我国甘蓝的重要病害之一。基于甘蓝枯萎病危害日趋严重的现状，从分子水平上研究其致病机理，（Jin X,Ming-He M,et al.Improvement on genetic transformation inthe nematode-trapping fungus Arthrobotrysoligospora and its quantification ondungsamples[J].Mycopathologia，2005,159(4):533-538.袁婷露，曹秀云，等.禾谷镰刀菌致病力和致病基因的研究进展[J].安徽农业科学，2008,14（4）：32-34.)已经愈来愈受到重视。

尖孢镰刀菌在土壤中属兼性寄生，它的腐生能力使得它可在土壤中长期生存。在植株残株上也能生存。以菌丝体或3种孢子（即小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子)存在。孢子萌发管或菌丝体的侵入部位为植物根部，可直接从根尖、根部伤口或是在侧根生长点进去植物体。一旦进入植物体内，菌丝体就在根皮层细胞间生长，当菌丝体到达木质部后，通过木质部的纹孔侵入导管，而后在导管中向上生长，至植物的茎或顶部。病原菌丝体生长过程会产生分枝、生成小型分生孢子，小型分生孢子顺着导管从下而上移动，当小型分生孢子萌发时，菌丝体会穿过木质部上层壁，在相邻的导管中产生更多的小型分生孢子。同时，尖孢镰刀菌也会通过木质部的纹孔横向进行进一步扩展。由于病原菌在植物维管组织内生长，植株的营养和水分供应受到了很大的影响，导致叶片气孔的关闭、萎蔫和植株的整体死亡。这时，病原菌侵入植株的软组织，直至最终到达死亡组织的表面，在那里大量地产生孢子，这些孢子又成为病原菌进一步扩散的接种体。因此，甘蓝枯萎病菌的分生孢子是主要的侵染源和再侵染源在病害侵染循环中不可缺少。甘蓝枯萎病的严重度与甘蓝枯萎病菌形成分生孢子的多少直接相关，研究甘蓝枯萎病菌分生孢子形成和形态建成的分子遗传不仅对于揭示甘蓝枯萎病菌、丝状真菌产生分生孢子的分子机制具有重要的理论意义，而且对于甘蓝枯萎病的防治具有重要应用价值。

目前在甘蓝枯萎病菌分生孢子形成及变异方面的报道比较少，即使有报道一般也都没有关于基因克隆与分子机理的内容。

发明内容

本发明的目的旨在提供影响甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)分生孢子产生和致病力的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的影响甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)分生孢子产生和致病力的蛋白，来源于甘蓝枯萎病菌，名称为FOG1，是如下1）或2）的蛋白质：

1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1）衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由1070个氨基酸残基组成。

为了便于序列1编码的FOG1纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述FOG1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述FOG1的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第1035-4250位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述影响甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述影响甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列2自5′末端第1035-4250位核苷酸所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶的DNA分子；

4）与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有影响甘蓝枯萎病菌的致病力和分生孢子产生的功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为5100个核苷酸，包含一个长度为3215个核苷酸的基因序列（自序列2的5’端第1035-4250位核苷酸序列）、，编码一个长度为1070个氨基酸（序列表中序列1）、分子量约为120KD蛋白，即为影响甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述影响甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白的编码基因的重组表达载体、表达盒、或重组菌均属于本发明的保护范围。

影响甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白及其编码基因在控制甘蓝枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种提高甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力的方法，其特征在于，将甘蓝枯萎病分生孢子产生和致病力的蛋白的编码基因导入甘蓝枯萎病菌中，筛选得到致病力和分生孢子产生的能力均增强的菌株。

本发明还保护一种降低甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力的方法，其特征在于，将甘蓝枯萎病菌中的上述的编码基因灭活，筛选得到致病力和分生孢子产生的能力均降低的菌株。所述灭活的方法为将所述编码基因序列从其基因组中敲除。

所述敲除的方法是用同源重组的方法使所述基因灭活。

具体是，先用线性化的pUCATPH转化甘蓝枯萎病菌菌株JZB310079原生质体，得到阳性转化子，然后再用敲除重组载体转化所述阳性转化子，筛选得到阳性的重组菌株；；或者直接用敲除重组载体转化甘蓝枯萎病菌菌株JZB310079原生质体筛选得到阳性的重组菌株；

所述敲除重组载体为将自序列表中序列2的第4250-5100位核苷酸左臂片段插入到pKOV21载体的SpeI和HindIII位点之间，将自序列表中序列2的第4250-5100位核苷酸所示的片段插入到XhoI和KpnI位点之间，得到的重组载体。

本发明证明FOG1基因的突变导致甘蓝枯萎病菌减少分生孢子的产生，并降低了对甘蓝的侵染能力，说明FOG1基因是甘蓝枯萎病菌引起甘蓝枯萎病的致病相关基因。因此，筛选能够阻止该基因表达、转录物的剪切及其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制甘蓝枯萎病菌分生孢子的产生和甘蓝枯萎病的发生，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用或改善之后加以利用。也就是说，本发明所提供的FOG1的一个重要用途是，该基因的表达和转录物的剪切及其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要候选靶位点用于抗真菌药剂（特别是抗甘蓝枯萎病菌药剂）的筛选和设计中。进一步，解析该基因参与的分生孢子产生的信号传递途径，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂（特别是甘蓝枯萎病菌药剂）的筛选和设计中。此外，也可以以该基因核苷酸序列的某一区段作为探针或作为PCR引物设计的基础在甘蓝枯萎病菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。

附图说明

图1、敲除转化载体构建示意图。

图2、敲除转化子扩敲除基因FOG1的PCR检测。K1-K12:敲除转化子；WT:野生型。

图3、敲除转化子扩插入替换片段的PCR验证。图中，K1-K5:敲除转化子；WT:野生型。

图4、野生型菌株JZB310079及其敲除转化体FOG1-9孢子形态的比较。

图5、野生型菌株JZB310079及其敲除转化体FOG1-9、FOG1-12的产孢量比较。

图6、野生型菌株JZB310079与敲除转化体对甘蓝致病能力的比较。

图7、互补转化载体构建示意图。

图8、互补转化体致病力的检测。WT:野生型菌株；HB01-HB10:互补转化体。

具体实施方式

实施例1、源于甘蓝枯萎病菌的影响分生孢子产生和致病力的蛋白及其编码基因的获得

1、突变株的获得

以甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）菌株JZB310079（李伶俐等，甘蓝枯萎病菌原生质体的制备与再生条件的优化，中国农学通报，2011,27（10）:203-207，公众可从北京市农林科学院获得）为野生菌株，制备基因插入突变体库，并筛选突变体。

首先是通过REMI转化的方法构建基因插入突变体库，然后通过与野生型的侵染能力的比较筛选出了致病力减弱的突变体菌株并通过对突变体菌株基因组DNA的Southern blot分析发现该突变菌株为单位点插入，即单基因突变。通过质粒拯救的方法获取了该单基因的序列。并据此分析序列设计了其特异性引物序列。

2、本发明影响分生孢子产生和致病力的蛋白及其编码基因的获得

以甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）菌株JZB310079为模板，通过设计引物

F:5'-TATGGATCCTCGTTTGCCTTGCCTTAG-3′

R:5'-TATCTGCAGTCTTCTTCTTGCCGTGGT-3'

扩增得到一个基因片段。将获得的基因片段进行测序，测序结果表明，该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表中序列2全长为5100个核苷酸，包含一个长度为3215个核苷酸的基因（自序列2的5’端第1035-4250位核苷酸序列），将该基因命名为FOG1，它编码一个长度为1071个氨基酸（序列表中序列1）、分子量约为120KDa的蛋白，即为源于甘蓝枯萎病菌的影响分生孢子产生和致病力的蛋白。

实施例2、源于甘蓝枯萎病菌的影响分生孢子产生和致病力的蛋白及其编码基因的功能验证

FOG1甘蓝枯萎病菌分生孢子产生中作用的证明包括互补实验和基因置换实验。在这部分内容中包括互补载体和基因置换载体的构建以及将上述两类载体导入甘蓝枯萎病菌中，得到相应的转化体。互补载体的构建是指将包含FOG1的全长功能性序列（序列表中序列2的第1035-4250位核苷酸）的DNA片段与一个带有新霉素抗性基因的载体相连。互补载体所导入的甘蓝枯萎病菌受体菌株是突变体菌株。基因置换载体的构建是指将位于FOG1的两侧各一段DNA序列连入一个载体中，两者之间用潮霉素抗性基因隔开。基因置换载体通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点FOG1的基因组基因序列与潮霉素基因置换。基因置换载体所导入的野生型甘蓝枯萎病菌菌株是甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）菌株JZB310079（李伶俐等，甘蓝枯萎病菌原生质体的制备与再生条件的优化，中国农学通报，2011,27（10）:203-207，公众可从北京市农林科学院获得）。

一、敲除实验证明本发明蛋白的功能

1、敲除载体（基因置换载体）的构建

a）左臂片段的获得

以甘蓝枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans）菌株JZB310079基因组基因为模板，左臂正向引物5'-ACTAGTCCTCGTACTTCTTGTTCTTC-3'，其5’带有SpeI酶切位点，反向引物为5'-AAGCTTATACGGGTCAAGTTCATTCT-3'，其5’端带有HindIII酶切位点；进行PCR扩增，扩增得到扩增出带有限制性内切酶SpeI和HindIII位点的位于FOG1起始密码子上游的序列片段（自序列表中序列2的第1-1034位核苷酸），将其命名为左臂片段。

b）右臂片段的获得

以甘蓝枯萎病菌（Fusarium_oxysporum f.sp.conglutinans）菌株JZB310079基因组基因为模板，右臂正向引物5'-CTCGAGTTAACCTTTCCGTACCCTTT-3'其5’带有XhoI酶切位点，反向引物为5'-GGTACCTACACCTGATTACTGCTTAA-3'其5’带有KpnI酶切位点；进行PCR扩增，扩增得到扩增出带有XhoI和KpnI位点的位于FOG1终止密码子下游的序列片段（自序列表中序列2的第4250-5100位核苷酸），将其命名为右臂片段。

c）敲除载体（基因置换载体）的构建

将扩增出基因的左臂和右臂片段，结合含有两个抗性基因（hyg和neo抗性基因）的载体质粒pKOV21中潮霉素序列两端，先连左臂后连右臂。即将左臂片段插入到pKOV21载体的SpeI和HindIII位点之间，将右臂片段插入到XhoI和KpnI位点之间，得到含有左臂片段和右臂片段的重组载体，将测序验证正确的载体命名为pKOV21+L+R（图1）。

2、敲除突变体的获得

利用同源重组的原理，将pKOV21+L+R用限制性内切酶KpnI线性化后转化野生型甘蓝枯萎病菌JZB310079，FOG1基因就被潮霉素磷酸转移酶基因所代替，在潮霉素磷酸转移酶基因的两侧分别留下999bp和1019bp的FOG1的基因组基因的侧端序列。具体方法如下所述：

在本发明中，甘蓝枯萎病菌的转化选用PEG介导的转化真菌原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法如下：

a．原生质体的制备

500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基（酵母提取物0.1%,酶水解干酪素0.05%，葡萄糖1%，硝酸钙0.1%，磷酸二氢钾0.02%，硫酸镁0.025%,氯化钠0.015%），分别接入所需甘蓝枯萎病菌菌株的适量菌丝、孢子混和体，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液（含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制），26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC（1.2M山梨醇,10mM Tris-Cl，pH7.5，50mM氯化钙）洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×10⁸个/毫升。

b．甘蓝枯萎病菌REMI转化

向50mL离心管中分别加入150μL原生质体，2μg线性化质粒pUCATPH，20U限制性内切酶HindⅢ，用STC补足至每管300μL，冰上放置20min。每管逐滴加入2mL PTC(每100ml PTC:60g PEG3350，10mM Tris-HCl pH7.5，10mMCaCl₂)，溶液，缓慢混匀，冰上静置20min。每管各加入25mL预冷的STC溶液，颠倒混匀，4℃，4000g离心15min，弃上清。每管加入3mL灭菌的LR培养基，28℃静置培养12～18h。向培养液中加入15mL50℃左右的SR再生培养基，混匀后铺板，凝固后在其表面覆盖一层10mL50℃左右含有50μg/mL Hygromycin B的1.5％水琼脂。28℃下黑暗培养3-4d后挑出转化子。将挑出的转化子PCR鉴定后，保存。

c.敲除转化

利用构建好的敲除转化载体pKOV21+L+R以a项中获得的原生质体，进行转化。

具体方法如下：

1）向50mL离心管中分别加入150μL原生质体，2μg线性化载体质粒pKOV21+L+R，用STC补足至每管300μL，冰上放置20min。

2）管逐滴加入2mL PTC溶液，缓慢混匀，冰上静置20min。

3）每管各加入25mL预冷的STC溶液，颠倒混匀后，于4℃，2000g离心15min，弃上清。

4）每管加入3mL LR培养基，28℃静置培养12～18h。

5）向培养液中加入12mL50℃左右的SR再生培养基，混匀后铺板，凝固后在平板表面覆盖10mL50℃左右含有50μg/mL Hygromycin B的1.5％水琼脂。

6）28℃培养箱中培养3-4d后挑出转化子。

7）将挑出的转化子接种到含有400μg/mL新霉素的CM板上进行二次筛选。

8）筛选出能够在潮霉素板上正常生长，而在新霉素板上不能生长的转化子，通过PDA培养基活化培养后进行单孢分离保存。

d.将单孢分离的转化子进行PCR鉴定

以敲除目的基因FOG1序列片段上设计的引物F:5'-TATGGATCCTCGTTTGCCTTGCCTTAG-3'

R:5'-TATCTGCAGTCTTCTTCTTGCCGTGGT-3'

扩增转化子的基因组DNA，其中5株转化子没有扩增得到片段，而野生型扩增到3.2kb条带（图2）。表明这5个转化子基因组中的FOG1可能已经被潮霉素基因替换掉了。

将上面PCR没有扩增出条带的5个转化子的基因组DNA，根据潮霉素的两端序列设计引物并分别用在敲除载体左右臂的外侧300bp左右的序列设计引物，进行替换基因片段扩增验证。发现有5个转化子分别扩增到了2kb和1.6kb大小的片段，而野生型和水没有扩增出条带（图3）。因此可以推断这五株转化子是敲除转化体。并将其中两株分子鉴定阳性的菌株分别命名为FOG1-9、FOG1-12。

3、敲除突变体的表型验证

1）产孢能力检测

野生型菌株JZB310079及其敲除转化体FOG-1产孢状态的比较。将菌丝充分打断，均匀地涂布到土豆培养基（每升含200g土豆煮沸后过滤取滤液、20克琼脂）平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时后，显微拍摄培养基表面产生的分生孢子，放大倍数100倍。野生型菌株JZB310079及其敲除转化体FOG1-9产孢状态的比较如图4所示，经过观察发现敲除转化体的分生孢子形态与野生型相比差异不大，但数量明显减少。

采用同上的方法，将野生菌株与突变体菌株在培养皿（直径10cm）内产生的分生孢子用同样体积水洗下，用血球记数板测定单位体积中所含有的分生孢子数。野生型菌株JZB310079及其敲除转化体FOG1-9、FOG1-12的产孢量比较结果如图5和表2所示，敲除实验表明，潮霉素基因置换FOG1后，2个敲除转化体FOG1-9、FOG1-12都丧失了部分产孢能力，表现出与突变体一样的性状。

表2.FOG1敲除转化体与野生型菌分生孢子产量的比较

2）致病力检测

分别将野生型菌JZB310079、FOG1敲除突变体FOG1-9和FOG1-12接种于PDA培养基平板上，26℃-28℃培养5天后，将分生孢子刮下，分别调节浓度至10⁶个/mL，采用蘸根法接种在25℃恒温生长20天左右的中甘-21甘蓝五叶期幼苗，接种后25℃恒温培养14天后观察发病情况。发现野生型菌JZB310079在甘蓝上形成了典型的枯萎病症，调查发现病情指数平均为60.13，而FOG1缺失突变体FOG1-9、FOG1-12病症明显减轻，只有少数嫩叶枯萎且病情指数平均为37.25和32.5，说明敲除转化体的致病力明显降低（结果见图6）。

二、互补实验

1．互补转化载体的构建（构建示意图见图7）

以质粒载体pS65T-C1（gi:1019893）为模板，以引物上游引物：N1:5′－TCTAGAＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣ－3′，下游引物：N2:5′－ＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＡ－3′进行PCR扩增，得到新霉素磷酸转移酶基因，将该基因插入到pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的重组载体，将测序验证正确的载体命名为KN。

在PCR正向引物设计酶切BamHI酶切位点5'-GGATCCTCGTTTGCCTTGCCTTAG-3',反向引物含有PstI酶切位点为5'-CTGCAGTCTTCTTCTTGCCGTGGT-3'，从野生菌株JZB310079中扩增出约3.2kb包含编码FOG1的核苷酸片段（自序列2的5’端第1035-4250位核苷酸序列），将该片段与限制性内切酶BamHI、PstI酶切的KN载体连接，将得到的测序验证的包含有功能性FOG1全长基因和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的互补载体KNC（图7）

用互补载体KNC转化敲除突变体FOG1-9，具体方法为同步骤一中的步骤2的c敲除转化，用新霉素筛选阳性转化子,将筛选获得的阳性转化子进行PCR扩增分子鉴定，扩增引物为F:5'-TATGGATCCTCGTTTGCCTTGCCTTAG-3'，R:5'-TATCTGCAGTCTTCTTCTTGCCGTGGT-3'；扩增得到3.2kb DNA片段的转化子即为阳性转KNC的菌株，将10株鉴定阳性的菌株命名为HB01、HB02、……、HB10。

2.敲除突变体FOG1-9的互补转化子的表型鉴定。

1）产孢能力检测

野生型菌株JZB310079及敲除突变体FOG1-9的10株互补转化体HB01-HB10进行产孢能力的检测，检测方法同步骤一的步骤3。

结果表面，敲除突变体FOG1-9的10株互补转化体HB01-HB10的分生孢子产生量与野生型菌JZB310079相当，两者的比较结果如表3所示。互补实验的结果表明互补载体在甘蓝枯萎病菌突变体FOG1-9基因组中的异位整合使突变体恢复了分生孢子的产生能力。

表3.FOG1-9互补转化体FOHB1与野生型菌分生孢子产量的比较

2）互补转化体的致病力检测

将步骤1中通过互补转化实验得到的10个互补转化体（HB01-HB10），与野生型菌株在相同的培养条件，28℃黑暗恒温培养7d后，用无菌水冲洗孢子，调节至孢子浓度为1×10⁶个/ml，采用蘸根法接种在25℃恒温生长20天左右的中甘-21甘蓝五叶期幼苗，接种后25℃恒温培养14天后观察发病情况发现，野生型的病情指数为65，而互补体大部分恢复了野生型的致病力且病情指数从45到70不等（图8）。接种实验的结果表明互补载体在甘蓝枯萎病菌突变体FOG1-9基因组中的异位整合使突变体基本恢复了致病力。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）将序列表中的SEQ ID№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有影响甘蓝枯萎病菌致病力和分生孢子产生功能的由SEQ ID№：1衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为具有影响甘蓝枯萎病菌的致病力和分生孢子产生的功能的蛋白质。

3.权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的cDNA的核苷酸序列如下1)、2）、3）或4）所示：

1）序列表中SEQ ID№：2自5′末端第1035-4250位核苷酸所示的核苷酸序列(请指明编码序列)；

2）序列表中SEQ ID№：2的核苷酸序列；

3）在严格条件下可与1）或2）所述的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4）与序列表中SEQ ID№：2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。

5.含有权利要求3或4所述的编码基因的重组表达载体、或转基因重组菌。

6.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在控制甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力中的应用。

7.一种提高甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力的方法，其特征在于，将权利要求3或4所述的编码基因导入甘蓝枯萎病菌中，筛选得到致病力和分生孢子产生的能力均增强的菌株。

8.一种降低甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)的致病力和分生孢子产生的能力的方法，其特征在于，将甘蓝枯萎病菌中的权利要求3或4所述的编码基因灭活，筛选得到致病力和分生孢子产生的能力均降低的菌株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述将甘蓝枯萎病菌中的权利要求3或4所述的编码基因灭活的方法为将所述编码基因序列从其基因组中敲除；所述甘蓝枯萎病菌为甘蓝枯萎病菌菌株JZB310079；所述敲除的方法是用同源重组的方法使所述基因灭活。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述敲除的方法是先用线性化的pUCATPH转化甘蓝枯萎病菌菌株JZB310079原生质体，得到阳性转化子，然后再用敲除重组载体转化所述阳性转化子，筛选得到阳性的重组菌株；或者直接用敲除重组载体转化甘蓝枯萎病菌菌株JZB310079原生质体筛选得到阳性的重组菌株；

所述敲除重组载体为将自序列表中序列2的第4250-5100位核苷酸左臂片段插入到pKOV21载体的SpeI和HindIII位点之间，将自序列表中序列2的第4250-5100位核苷酸所示的片段插入到XhoI和KpnI位点之间，得到的重组载体。

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