CN103314100A

CN103314100A - 重组正丙醇和异丙醇产生

Info

Publication number: CN103314100A
Application number: CN2011800635822A
Authority: CN
Inventors: T·格罗特克杰尔; S·T·乔根森; T·B·雷圭拉; B·克里斯滕森; A·贝里
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Inc
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-09-18
Also published as: AU2011320329A1; EP2633030A1; BR112013010353A2; CA2810903A1; US20130280775A1; JP2013544083A; AU2011320329B2; MX2013004353A; WO2012058603A1

Abstract

本发明涉及产生正丙醇，异丙醇，和同时产生正丙醇与异丙醇的方法。本发明亦涉及用于产生乙烯的方法，以及能够产生正丙醇和异丙醇的宿主细胞。

Description

重组正丙醇和异丙醇产生

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月29日提交的美国临时申请号61/408,154，2010年10月29日提交的美国临时申请号61/408,146，和2010年10月29日提交的美国临时申请号61/408,138的优先权权益。这些申请的内容如同全文在下文中列出一般通过提述并入本文。

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

涉及保藏的生物材料

本申请包含对生物材料的保藏的引用。该保藏通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及重组产生正丙醇和异丙醇的方法。

背景技术

对于未来石油供应的忧虑促进了在可再生能源以及可再生的其它原材料的来源领域的研究。生物燃料，如乙醇和生物塑料(例如特别是聚乳酸)为可使用微生物直接从农业来源制备的产品的实例。然后，其它所需产品可使用非酶化学转化来衍生，例如将乙醇脱水为乙烯。

乙烯的聚合提供聚乙烯，其为具有广泛范围的有用用途的塑料类型。乙烯传统上通过精炼的非可再生性化石燃料来产生。然而，将生物来源的乙醇脱水为乙烯提供了从可再生的碳源得到乙烯的替代途径，即来自可发酵糖的发酵的乙醇。该工艺已应用于产生“绿色聚乙烯(Green Polyethylene)”，其除了在碳同位素分布方面的微小差异之外，与从石油产生的聚乙烯完全相同。

类似地，可将异丙醇和正丙醇脱水为丙烯，其随即可聚合为聚丙烯。如同聚乙烯，使用生物来源的起始材料(即异丙醇或正丙醇)会得到“绿色聚丙烯(Green Polypropylene)”。然而，不像聚乙烯，从可再生的来源产生聚乙烯起始材料已证明具挑战性。已提出的对于丙烯产生的努力报道于WO2009/049274，WO 2009/103026，WO 2009/131286，WO 2010/071697，WO2011/031897，WO 2011/029166，和WO 2011/022651。显而易见，生物产生丙醇的工艺的成功开发需要仔细选择代谢途径中的酶，以及有效的总体代谢工程策略。

在本领域中，提供产生重组的正丙醇和异丙醇的方法会是有利的。本发明提供了此类方法，以及用于这些方法中的重组宿主细胞。

发明内容

本发明涉及用于产生正丙醇和/或异丙醇的重组宿主细胞，等等。在一个方面，所述宿主细胞包含硫解酶活性，CoA转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性，和/或异丙醇脱氢酶活性，其中所述宿主细胞产生(或能够产生)异丙醇。在一个方面，所述宿主细胞包含醛脱氢酶活性，其中所述宿主细胞产生(或能够产生)正丙醇。在一个方面，所述宿主细胞包含硫解酶活性，CoA转移酶活性，异丙醇脱氢酶活性，和/或醛脱氢酶活性，其中所述宿主细胞产生(或能够产生)正丙醇和异丙醇。在一些这些方面，所述宿主细胞任选地进一步包含甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性，甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性。

在一个方面，所述重组宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸(例如，一种或多种(几种)编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的异源多核苷酸)，编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸，和/或编码醛脱氢酶的异源多核苷酸。所述宿主细胞可任选地进一步包含编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸，和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

本发明亦涉及使用重组宿主细胞产生正丙醇，产生异丙醇，或共同产生正丙醇和异丙醇的方法。

在一个方面，本发明涉及产生异丙醇的方法，其包括：(a)在合适条件下在培养基中培养具有硫解酶活性，CoA转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性，和异丙醇脱氢酶活性的重组宿主细胞以产生异丙醇；和(b)回收异丙醇。在本方法的一些实施方案中，所述重组宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；和/或编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

在另一个方面，本发明涉及产生正丙醇的方法，其包括：(a)在合适条件下在培养基中培养具有醛脱氢酶活性的重组宿主细胞以产生正丙醇；和(b)回收正丙醇。在本方法的一些实施方案中，所述重组宿主细胞包含编码醛脱氢酶的异源多核苷酸。在本方法的实施方案中，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

在另一个方面，本发明涉及共同产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：(a)在合适条件下在培养基中培养具有硫解酶活性，CoA转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性，异丙醇脱氢酶活性，和醛脱氢酶活性的重组宿主细胞以产生正丙醇和异丙醇；和(b)回收正丙醇。在本方法的一些实施方案中，所述重组宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸多核苷酸(例如，一种或多种(几种)编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的异源多核苷酸)；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸;和/或编码醛脱氢酶的异源多核苷酸。本方法的宿主细胞可进一步包含编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸，和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸

本发明亦涉及产生丙烯的方法，其包括：(a)在合适条件下在培养基中培养本文中所述的重组宿主细胞以产生正丙醇和/或异丙醇；(b)回收所述正丙醇和/或异丙醇；(c)在合适条件下将所述正丙醇和/或异丙醇脱水以产生丙烯；和(d)回收丙烯。

在一些方面，所述宿主细胞是乳杆菌属(Lactobacillus)宿主细胞(例如植物乳杆菌(L.plantarum)或路氏乳杆菌(L.reuteri)宿主细胞)。在其它方面，所述宿主细胞是丙酸杆菌属(Propionibacterium)(例如产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)宿主细胞)。

附图说明

图1显示从葡萄糖产生异丙醇的代谢途径。

图2显示从葡萄糖产生正丙醇的代谢途径。

图3显示从葡萄糖同时产生异丙醇和正丙醇的代谢途径。

图4显示pTRGU88的限制性图。

图5显示pSJ10600的限制性图。

图6显示pSJ10603的限制性图。

定义

硫解酶：术语“硫解酶”在本文中定义为一种酰基转移酶，其催化两个分子的乙酰CoA至乙酰乙酰CoA和CoA的化学反应(EC2.3.1.9)。就本文中所述的本发明而言，硫解酶活性可根据由D.P.Wiesenborn等,1988,Appl.Environ.Microbiol.54:2717-2722(其内容通过全文提述并入本文)所述的步骤来确定。例如，硫解酶活性可通过监控与使用100mM Tris盐酸(pH7.4)，1.0mM乙酰CoA，0.2mM NADH，1mM二硫苏糖醇，和2U的3-羟酰基-CoA脱氢酶中的3-羟酰基-CoA脱氢酶氧化NADH偶联的缩合反应来以分光光度法测量。在将小杯中的内含物在30℃平衡2分钟之后，反应通过添加10μL中的约125ng硫解酶来起始。测量在340nm由于NADH的氧化减少的吸光度，并使用6.22mM^-1cm^-1的消光系数。一个单位的硫解酶活性等于能够在pH7.4，30℃每分钟释放1微摩尔的乙酰乙酰CoA的酶的量。

硫解酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:3，35，114或116的成熟多肽的硫解酶活性。

CoA转移酶：如用于本文中，术语“CoA转移酶”定义为催化从乙酰乙酰CoA去除辅酶A以生成乙酰乙酸的任何酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC2.8.3.9的乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC3.1.2.11的乙酰乙酰CoA水解酶。在一些方面，所述CoA转移酶是将乙酰乙酰CoA和乙酸转化为乙酰乙酸和乙酰CoA的乙酰乙酰CoA转移酶。

CoA转移酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的包含SEQ ID NO:37的成熟多肽和SEQ ID NO:39的成熟多肽的蛋白复合物，或包含SEQ ID NO:41的成熟多肽和SEQ ID NO:43的成熟多肽的蛋白复合物的CoA转移酶活性。

在一些方面，所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。如用于本文中“琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶”是催化乙酰乙酰CoA和琥珀酸至乙酰乙酸和琥珀酰CoA的化学反应的乙酰转移酶(EC2.8.3.5)。所述琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶可为包含一种或多种(几种)如本文中所述的亚基(例如两种杂聚亚基)的蛋白复合物形式。就本文中所述的本发明而言，琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性可根据由L.Stols等,1989,Protein Expression and Purification53:396-403(其内容通过全文提述并入本文)所述的步骤来确定。例如，琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性可通过监控乙酰乙酰CoA的烯醇型阴离子的形成来以分光光度法测量，其中吸光度在50mM Tris，pH9.1中的67mM乙酰乙酸锂，300μM琥珀酰CoA，和15mM MgCl₂的测定缓冲液中在310nm/30℃测量4分钟。一个单位的琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性等于能够在pH9.1，30℃每分钟释放1微摩尔的乙酰乙酸的酶量。

琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的包含SEQ ID NO:6的成熟多肽和SEQID NO:9的成熟多肽的蛋白复合物，或包含SEQ ID NO:12的成熟多肽和SEQID NO:15的成熟多肽的蛋白复合物的琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性。

乙酰乙酸脱羧酶：术语“乙酰乙酸脱羧酶”在本文中定义为催化乙酰乙酸至二氧化碳和丙酮的化学反应(EC4.1.1.4)的酶。就本文中所述的发明而言，有需要斯坦索姆活性可根据D.J.Petersen,等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56,3491-3498(其内容通过全文提述并入本文)所述的步骤来确定。例如，乙酰乙酸脱羧酶活性可通过在监控在26℃在5nM乙酰乙酸，0.1M KPO₄，pH5.9中乙酰乙酸的消耗以分光光度法来测量。一个单位的乙酰乙酸脱羧酶活性等于能够在pH5.9，26℃每分钟消耗1微摩尔的乙酰乙酸的酶量。

乙酰乙酸脱羧酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:18，45，118或120的成熟多肽的乙酰乙酸脱羧酶活性。

异丙醇脱氢酶：术语“异丙醇脱氢酶”在本文中定义为催化丙酮至异丙醇的还原的任何合适的氧还酶(例如任何合适的EC1.1.1.1或EC1.1.1.80的酶)。就本文中所述的本发明而言，异丙醇脱氢酶活性可通过在包含在25℃的25mM磷酸钾，pH7.2中的200μM NADPH和10mM丙酮的测定中在340nm的吸光度的减少来以分光光度法确定。一个单位的异丙醇脱氢酶活性可定义为使用NADPH摩尔消光系数为6220M^-1*cm^-1，每分钟释放1微摩尔的NADP+的酶量。

异丙醇脱氢酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:21，24，47或112的成熟多肽的异丙醇脱氢酶活性。

醛脱氢酶：术语“醛脱氢酶”在本文中定义为催化醛的氧化的酶(EC1.2.1.3)。所述醛脱氢酶可为可逆的，例如其还可催化丙酰CoA至丙醛的化学反应。就本文中所述的本发明而言，醛脱氢酶活性可根据N.Hosoi等,1979,J.Ferment.Technol.,57:418-427(其内容通过全文提述并入本文)中所述的步骤来确定。例如，醛脱氢酶活性可通过监控NAD+的减少(即使用3mL含有100μmol丙醛，3μmol NAD+，0.3μmol CoA，30μmol GSH，100μg牛血清白蛋白，120μmol巴比妥-HCl缓冲液(pH8.6)的溶液，在30℃在340nm的吸光度的增加)以分光光度法确定。一个单位的醛脱氢酶转移酶活性等于能够在pH8.6，30℃释放1微摩尔的丙酰CoA的酶量。

醛脱氢酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的醛脱氢酶活性。

在一个方面，所述醛脱氢酶对于乙酰CoA底物具有的起始反应速率(v0)低于在相同条件下对于丙酰CoA底物的起始反应速率(v₀)的95%，90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，15%，10%，7.5%，5%，2.5%或1%。

甲基丙二酸单酰CoA变位酶：术语“甲基丙二酸单酰CoA变位酶”在本文中定义为催化甲基丙二酸单酰CoA至琥珀酰CoA的可逆异构化的酶(EC5.4.99.2)。在一些方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶需要维生素B12以供甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性。就本文中所述的本发明而言，甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性可根据由T.Haller等,2000,Biochemistry,39:4622-4629(其内容通过全文提述并入本文)所述的步骤来确定。例如，甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性可通过HPLC分析测量在37℃在含由琥珀酰CoA(2-43μM)，甲基丙二酸单酰CoA变位酶(8nM)，KCl(30mM)和动力学过量的甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶(ygfG,T.Haller等,2000,见上文)的钠Tris-HCl(50mM)pH7.5的500μL溶液中琥珀酰CoA的消耗来测量。一个单位的甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性等于能够在pH7.5，37℃每分钟消耗1微摩尔琥珀酰CoA的酶量。

甲基丙二酸单酰CoA变位酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:93的成熟多肽序列，或包含具有SEQ ID NO:66的成熟多肽序列的第一亚基和具有SEQ ID NO:69的成熟多肽序列的第二亚基的蛋白复合物的甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性。

甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶：术语“甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶”在本文中定义为催化甲基丙二酸单酰CoA至丙酰CoA和二氧化碳的化学反应的酶(例如EC4.1.1.41)。所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可催化(2R)-甲基丙二酸单酰CoA，(2S)-甲基丙二酸单酰CoA或两者的转化。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶对于(2R)-甲基丙二酸单酰CoA相对于(2S)-甲基丙二酸单酰CoA在相同条件下具有更高的特异性。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶对于(2S)-甲基丙二酸单酰CoA相对于(2R)-甲基丙二酸单酰CoA在相同条件下具有更高的特异性。

就本文中所述的本发明而言，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性可根据由T.Haller等,2000,见上文所述的步骤来确定。甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性可通过连续分光光度法分析确定甲基丙二酸单酰CoA转化为丙酰CoA(即在草酰乙酸，转羧酶，和乳酸脱氢酶存在下在37℃监控NADH的氧化)来测量。在此实例中，磷酸钾(16.7mM)的1.2mL溶液含有pH7.2的甲基丙二酸单酰CoA脱氢酶(0.6μM)，甲基丙二酸单酰CoA(3-45μM)，草酰乙酸(8.3mM)，NADH(0.33mM)，转羧酶(5mU)和乳酸脱氢酶(4mU)。一个单位的甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶等于能够在pH7.2，37℃每分钟使1微摩尔的甲基丙二酸单酰CoA脱羧的酶量。

甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:103的成熟多肽序列的甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性。

甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶：术语“甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶”在本文中定义为催化甲基丙二酸单酰CoA的化学差向异构的酶(例如R-甲基丙二酸单酰CoA至S-甲基丙二酸单酰CoA和/或S-甲基丙二酸单酰CoA至R-甲基丙二酸单酰CoA，参见EC5.1.99.1)。就本文中所述的本发明而言，甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性可根据由Dayem等,2002,Biochemistry,41:5193-5201(其内容通过全文提述并入本文)所述的方法来确定。

甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶可具有至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的SEQ ID NO:75的成熟多肽序列的甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性。

正丙醇脱氢酶：术语“正丙醇脱氢酶”在本文中定义为催化丙醛至正丙醇的还原的任何醇脱氢酶(EC1.1.1.1)。就本文中所述的本发明而言，正丙醇脱氢酶活性可根据由C.Drewke和M.Ciriacy,1988,Biochemica et BiophysicaActa,950:54-60(其内容通过全文提述并入本文)所述的步骤来确定。例如，正丙醇脱氢酶活性可遵循在pH8.3NADH氧化的NAD+还原的动力学来以分光光度法确定。一个单位的正丙醇脱氢酶活性等于能够在pH8.3，30℃每分钟转化1微摩尔丙醛的酶量。

异源多核苷酸：术语“异源多核苷酸”在本文中定义为对于宿主细胞并非天然的多核苷酸；其中已对编码区进行结构修饰的天然多核苷酸；作为通过重组DNA技术(例如，不同的(外源)启动子)操纵DNA的结果其表达定量改变的天然多核苷酸；或其表达通过将一个或多个(几个)额外拷贝的多核苷酸导入宿主细胞而定量改变的天然多核苷酸。

分离的/纯化的：术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合(associated)的成分分离的多肽或多核苷酸。举例而言，如通过SDS-PAGE确定的，该多肽可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，至少93%纯，至少95%纯，至少97%纯，至少98%纯，或至少99%纯；且如通过琼脂糖电泳确定的，该多核苷酸可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，至少93%纯，至少95%纯，至少97%纯，至少98%纯，或至少99%纯。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在任何翻译后修饰(如N-末端加工和/或C-末端截短)之后参照的多肽序列的部分。成熟独特序列可例如基于SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)或InterProScan程序(The European Bioinformatics Institute)来预测。在一些情况下，所述成熟多肽序列可与整个参照的多肽序列完全相同。在本领域中已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端)的混合物

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码参照成熟多肽的多核苷酸。

序列同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数“序列同一性”所描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套组(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。

片段：术语“片段”意指从参照的多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的多肽。在一个方面，所述片段具有硫解酶活性，CoA转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性)，乙酰乙酸脱羧酶活性，异丙醇脱氢酶活性，甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性，甲基丙二酸单酰脱羧酶活性，醛脱氢酶活性，或正丙醇脱氢酶活性。在另一个方面，片段中的氨基酸残基的数量为任何本文中参照的氨基酸序列的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%或95%。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从参照的核苷酸序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(例如两个、几个)核苷酸的多核苷酸。在一个方面，所述亚序列编码具有硫解酶活性，CoA转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性)，乙酰乙酸脱羧酶活性，异丙醇脱氢酶活性，甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性，醛脱氢酶活性，或正丙醇脱氢酶活性的片段。在另一个方面，亚序列中的核苷酸残基的数量为任何本文中参照的多核苷酸的核苷酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%或95%。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

编码序列：术语“编码序列”的意思是直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重组多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指可通过反转录得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子而制备的DNA。cDNA序列可存在于相应基因组DNA序列中的内含子。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。在一些情况下，cDNA序列可与相应的基因组DNA序列相同。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或为合成的。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对于编码本发明的多肽的多核苷酸的表达所必需的所有组分。每种调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，所述调控序列包含启动子，和转录和翻译终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并与提供其表达的其它核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。

变体：术语“变体”意指具有参照的酶活性的多肽，或具有参照的酶活性的蛋白复合物的多肽，其中所述多肽在一个或多个(几个)位置包含变化即取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同氨基酸替换；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在占据某位置的氨基酸的相邻处添加一个或多个(几个)，例如1-3个氨基酸。

体积产量：术语“体积产量”指每单位时间每体积(例如，培养基及其中内含物的总体积)使用的系统所产生的参照的产物的量(例如，产生的正丙醇和/或异丙醇的量)。

发酵培养基：术语“发酵培养基”指包含一种或多种(几种)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖的培养基，其中所述培养基能够部分地通过宿主细胞转化(发酵)为所需产物，如丙醇。在一些情况下，所述发酵培养基源自天然来源，如甘蔗，淀粉，或纤维素，并可为通过酶水解(糖化)而预处理所述来源的结果。在一个方面，所述发酵培养基不包含1,2-丙二醇。

甘蔗汁：术语“甘蔗汁”指来自经压榨的甘蔗属(Saccharum)草本(甘蔗)的液体提取物，如经压榨的甘蔗(Saccharum officinarum)或Saccharum robustom。

在本文中，提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言，提及“约X”的描述包括了“X”的方面。

如用于本文中和所附权利要求中，除非上下文明确地表示相反，单数形式“一(个/种…)(a)”和/或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的发明的各方面包括了“由…组成(consisting)”和/或“基本上由…组成(consisting essentially of)”的方面。

除非另行定义或上下文明确指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的相同的含意。

发明详述

本发明描述了在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中过表达特定基因以产生正丙醇或异丙醇(例如如图1和2中所描述)或同时产生正丙醇或异丙醇(例如如图3中所描述)。本发明涵盖了异源基因在通过硫解酶将乙酰CoA乙酰化为乙酰乙酰CoA，通过CoA转移酶将乙酰乙酰CoA转化为乙酰乙酸，通过乙酰乙酸脱羧酶将乙酰乙酸脱羧为丙酮，通过异丙醇脱氢酶将丙酮还原为异丙醇，通过甲基丙二酸单酰CoA将琥珀酰CoA异构化为甲基丙二酸单酰CoA，通过甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶将甲基丙二酸单酰CoA脱羧为丙酰CoA，通过醛脱氢酶将丙酰CoA还原为丙醛，和/或通过正丙醇脱氢酶将丙醛还原为正丙醇中的用途。任何合适的硫解酶，CoA转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，异丙醇脱氢酶，甲基丙二酸单酰CoA变位酶，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，醛脱氢酶，和/或正丙醇脱氢酶可用于产生正丙醇和/或异丙醇。

在一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含硫解酶活性，琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性和/或异丙醇脱氢酶活性，其中所述重组宿主细胞产生(或能够产生)异丙醇，所述重组宿主细胞可包含一种或多种(几种)异源多核苷酸，如编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)的异源多核苷酸；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸;和/或编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

在一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含醛脱氢酶活性，其中所述重组宿主细胞产生(或能够产生)丙醛或正丙醇。在一些方面，所述重组宿主细胞从丙酰CoA产生(或能够产生)丙醛或正丙醇。所述重组宿主细胞可包含编码醛脱氢酶的异源多核苷酸。在一些方面，所述重组宿主细胞进一步包含一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸;和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

在一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含硫解酶活性，CoA转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性)，乙酰乙酸脱羧酶活性，异丙醇脱氢酶活性，和醛脱氢酶活性，其中所述重组宿主细胞产生(或能够产生)正丙醇和异丙醇。所述重组宿主细胞可包含一种或多种(几种)异源多核苷酸，如编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸;和/或编码醛脱氢酶的异源多核苷酸。所述宿主细胞可任选地进一步包含编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

硫解酶和编码硫解酶的多核苷酸

在本发明中，所述硫解酶可为任何适于实践本发明的硫解酶。在一个方面，所述硫解酶是在其中产生增加量的乙酰乙酰CoA的培养条件下过表达的硫解酶。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述硫解酶选自：(a)硫解酶，其与SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)硫解酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)由多核苷酸编码的硫解酶，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下，所述硫解酶可符合上示的选择(a)，(b)和(c)中的超过一项。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3，35，114，或116m具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，且具有硫解酶活性。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，且具有硫解酶活性。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:35的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，且具有硫解酶活性。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:114的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，且具有硫解酶活性。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，且具有硫解酶活性。

在一个方面，所述硫解酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3，35，114，或116相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述硫解酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位变体；或前述具有硫解酶活性的片段。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:3的成熟多肽。在另一个方面，所述硫解酶包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:3的氨基酸1至392。在一个方面，所述硫解酶包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或其等位变体；或前述具有硫解酶活性的片段。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:35的成熟多肽。在另一个方面，所述硫解酶包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:35的氨基酸1至392。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:114的成熟多肽。在另一个方面，所述硫解酶包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在另一个方面，所述硫解酶包含或组成为SEQ ID NO:116的成熟多肽。在另一个方面，所述硫解酶包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交(参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:34的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:113的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述硫解酶由SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的亚序列编码；其中所述亚序列编码具有硫解酶活性的多肽。

SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的多核苷酸，或其亚序列；以及SEQ IDNO:3，35，114，或116的氨基酸；或其片段，可用于设计核酸探针以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码硫解酶的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但应为至少14个核苷酸，优选至少25个核苷酸，更优选至少35个核苷酸，和最优选至少70个核苷酸的长度。优选所述核酸探针为至少100个核苷酸的长度。例如，所述核酸探针可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸的长度。可使用甚至更长的探针，如优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有硫解酶的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115，或它们的亚序列同源的克隆或DNA，所述载体材料优选用于Sounthern印迹。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列，或其全长互补链；或前述序列的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个方面，核酸探针是SEQID NO:2的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:2。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:3的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:34的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:34。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:35的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:113的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:113。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:114的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:115。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:116的多肽或其片段的多核苷酸。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:34的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:113的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述硫解酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述硫解酶是SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。优选地，氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质：使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的硫解酶活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在一些方面，SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在一些方面，SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。

在另一个方面，所述硫解酶是SEQ ID NO:3，35，114，或116的片段，其中所述片段具有硫解酶活性。在另一个方面，所述片段具有硫解酶活性，并包含SEQ ID NO:3，35，114，或116中的氨基酸残基数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%或95%。

所述硫解酶可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。

融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。

用于分离或克隆编码硫解酶的多核苷酸以及其它多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)菌株，或其他或相关生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可为例如核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体。

硫解酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，与给定的来源有关的术语“获得自”用于本文中，意思应为由多核苷酸编码的硫解酶由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。

所述硫解酶可以是细菌硫解酶。例如，所述硫解酶可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)硫解酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)硫解酶。

在一个方面，所述硫解酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是梭菌属(Clostridium)硫解酶如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)硫解酶(例如SEQ ID NO:3的丙酮丁醇梭菌硫解酶)。在另一个方面，所述硫解酶是乳杆菌属(Lactobacillus)硫解酶，如路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)硫解酶(例如SEQ ID NO:35的路氏乳杆菌硫解酶)或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)硫解酶(例如SEQ ID NO:114的短乳杆菌硫解酶)。在另一个方面，所述硫解酶是丙酸杆菌(Propionibacterium thiolase)硫解酶，如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)硫解酶(例如，SEQ IDNO:114的费氏丙酸杆菌硫解酶)。

所述硫解酶可为真菌硫解酶。在一个方面，所述真菌硫解酶为酵母硫解酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是丝状真菌硫解酶，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)硫解酶。

在另一个方面，所述硫解酶是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黄曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Asperigullus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)硫解酶。

其它可用于实践本发明的硫解酶多肽包括例如大肠杆菌(E.coli)硫解酶(NP_416728,Martin等,Nat.Biotechnology21:796-802(2003))和酿酒酵母(S.cerevisiae)硫解酶(NP_015297,Hiser等,J.BioI.Chem.269:31383-31389(1994))，巴氏梭菌(C.pasteurianum)硫解酶(例如蛋白ID ABAI8857.l)，拜氏梭菌(C.beijerinckii)硫解酶(例如蛋白ID EAP59904.1或EAP59331.1)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)硫解酶(例如蛋白ID ABG86544.l，ABG83108.l)，艰难梭菌(Clostridium diflicile)硫解酶(例如蛋白ID CAJ67900.1或ZP_01231975.1)，热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)硫解酶(例如蛋白ID CAB07500.1)，Thermoanaerobacter tengcongensis硫解酶(例如蛋白IDA.L\.M23825.1)，生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)硫解酶(例如蛋白ID ABB13995.l)，Desulfotomaculum reducens MI-l硫解酶(例如蛋白IDEAR45123.1)，或热带假丝酵母(Candida tropicalis)硫解酶(例如蛋白IDBAA02716.1或BAA02715.1)。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

亦可使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述硫解酶。用于从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码硫解酶的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合适探针检测到编码硫解酶的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述序列分离或克隆(参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。

CoA转移酶和编码CoA转移酶的多核苷酸

在本发明中，所述CoA转移酶可为任何适于实践本发明的CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC2.8.3.9的乙酰乙酰CoA:乙酸/丁酸CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是EC3.1.2.11的乙酰乙酰CoA水解酶。在一些方面，所述CoA转移酶是将乙酰乙酰CoA和乙酸转化为乙酰乙酸和乙酰CoA的乙酰乙酰CoA转移酶。在一些方面，所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。在一个方面，所述CoA转移酶是在其中产生增加量的乙酰乙酸的培养条件下过表达的CoA转移酶。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述CoA转移酶是具有CoA转移酶活性的蛋白复合物，其中所述一种或多种(几种)编码所述CoA转移酶复合物的异源多核苷酸包含编码第一多肽亚基的第一异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的第二多核苷酸。在一个方面，蛋白复合物是杂聚蛋白复合物，其中所述第一多肽亚基和所述第二多肽亚基包含不同的氨基酸序列。

在一个方面，所述编码第一多肽亚基的第一异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的第二多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中。在另一个方面，所述编码第一多肽亚基的第一异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的第二多核苷酸包含于不同的异源多核苷酸中。对于涉及CoA转移酶和其它多肽的核酸构建体的扩展讨论描述于本文。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述CoA转移酶是具有CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含第一多肽亚基的编码异源多核苷酸和第二多肽亚基的编码多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:6，12，37，或41的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQID NO:4，5，10，11，36，或40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4，5，10，11，36，或40的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:9，15，39，或43的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7，8，13，14，38，或42的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:7，8，13，14，38，或42的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述第一和第二多肽亚基可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述CoA转移酶是具有CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物琥珀酰，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:37的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:39的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:43的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列杂交，或其全长互补链；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:6，12，37，或41的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:9，15，39，或43的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:6，12，37，或41相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:9，15，39，或43相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:37的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:39的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:43的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含或组成为SEQ ID NO:6，12，37，41的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段；和所述第二多肽亚基包含或组成为SEQ ID NO:9，15，39，43的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和所述第二多肽亚基包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；和所述第二多肽亚基包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在本文中所述的SEQ ID NO:9的一些方面，SEQ ID NO:9的氨基酸1可为缬氨酸或甲硫氨酸。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；和所述第二多肽亚基包含SEQID NO:39的氨基酸序列。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和所述第二多肽亚基包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:4，5，10，11，36，40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7，8，13，14，38，42的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述第一多肽亚基由SEQ ID NO:4，5，10，11，36，或40的亚序列编码；和/或所述第二多肽亚基由SEQ ID NO:7，8，13，14，38，或42的亚序列编码；其中所述第一多肽亚基连同所述第二多肽亚基形成具有CoA转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性或乙酰乙酰CoA转移酶活性)的蛋白复合物。

SEQ ID NO:4，5，7，8，10，11，13，14，36，38，40，或42的多核苷酸；或其亚序列；以及SEQ ID NO:6，9，12，15，37，39，41，43的编码的氨基酸序列；或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码所述多肽亚基的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码多肽亚基的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:4，5，7，8，10，11，13，14，36，38，40，或42。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:6，9，12，15，37，39，41，43，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为包含于大肠杆菌DSM24122中的质粒pTRGU60的成熟多肽编码序列，其中所述成熟多肽编码序列编码具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物的多肽亚基。在另一个方面，所述核酸探针为包含于大肠杆菌DSM24123中的质粒pTRGU61的成熟多肽编码序列，其中所述成熟多肽编码序列编码具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物的多肽亚基。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上所述定义。对于长度为约15个核苷酸中约70个核苷酸的短探针，严格条件和洗涤条件如上所述定义。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:4，5，10，11，36，或40的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:7，8，13，14，38，或42的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQID NO:13或14的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由成熟多肽编码序列编码，所述成熟多肽编码序列包含于大肠杆菌DSM24122中的质粒pTRGU60；和/或所述第二多肽亚基由成熟多肽编码序列编码，所述成熟多肽编码序列包含于大肠杆菌DSM24123中的质粒pTRGU61。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述第一多肽亚基是SEQ ID NO:6，12，37，41的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和/或所述第二多肽亚基是SEQ ID NO:9，15，39，或43的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:6，9，12，15，37，39，41，或43的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一个方面，SEQ ID NO:6，9，12，15，37，39，41，或43的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10。

在另一个方面，所述第一多肽亚基是SEQ ID NO:6，12，37，或41的片段，和/或所述第二多肽亚基是SEQ ID NO:9，15，39，或43的片段，其中所述第一和第二多肽亚基一同形成具有CoA转移酶活性(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性或乙酰乙酰CoA转移酶活性)的蛋白复合物。

所述CoA转移酶(及其多肽亚基)亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码CoA转移酶及其多肽亚基的多核苷酸的技术描述于上文。

所述CoA转移酶(及其多肽亚基)可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述CoA转移酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌CoA转移酶转移酶。在一个方面，所述CoA转移酶是芽孢杆菌属琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶，例如枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶，其第一多肽亚基为SEQ ID NO:6和第二多肽亚基为SEQ ID NO:9；或摩加夫芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶，其第一多肽亚基为SEQ ID NO:12和第二多肽亚基为SEQ ID NO:15。在另一个方面，所述CoA转移酶是大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶，例如大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶，其第一多肽亚基为SEQ ID NO:37和第二多肽亚基为SEQ ID NO:39。在另一个方面，所述CoA转移酶是丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶，例如丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶，其第一多肽亚基为SEQ ID NO:41和第二多肽亚基为SEQ ID NO:43。

其它可用于实践本发明的琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶包括，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(YP_627417，YP_627418，Corthesy-Theulaz等，J Biol Chem272:25659-25667(1997))，和智人(Homo sapiens)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(NP_000427，NP071403，Fukao，T.等，Genomics68:144-151(2000)；Tanaka，H.等，Mol Hum Reprod8:16-23(2002))。

所述CoA转移酶(及其多肽亚基)亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

乙酰乙酸脱羧酶和编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸

在本发明中，所述乙酰乙酸脱羧酶可为任何适于实践本发明的乙酰乙酸脱羧酶。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是在其中产生增加量的丙酮的条件下过表达的乙酰乙酸脱羧酶。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸选自：(a)乙酰乙酸脱羧酶，其与SEQ ID NO:18，45，118，或120的成熟多肽至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述乙酰乙酸脱羧酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:18相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含SEQ ID NO:18的成熟多肽。在一个方面，SEQ ID NO:18的成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸1至246。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶与SEQ ID NO:45的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:45相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:45的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含SEQ ID NO:45的成熟多肽。在一个方面，SEQ ID NO:45的成熟多肽是SEQ ID NO:45的氨基酸1至259。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶与SEQ ID NO:118的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:118相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:118的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含SEQ ID NO:118的成熟多肽。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶与SEQ ID NO:120的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:120相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:120的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶包含SEQ ID NO:120的成熟多肽。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:16或17的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由SEQ ID NO:16或17的亚序列编码，其中所述乙酰乙酸脱羧酶具有乙酰乙酸脱羧酶活性。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:44的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由SEQ ID NO:44的亚序列编码，其中所述乙酰乙酸脱羧酶具有乙酰乙酸脱羧酶活性。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:117的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由SEQ ID NO:117的亚序列编码，其中所述乙酰乙酸脱羧酶具有乙酰乙酸脱羧酶活性。

在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:119的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由SEQ ID NO:119的亚序列编码，其中所述乙酰乙酸脱羧酶具有乙酰乙酸脱羧酶活性。

SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的多核苷酸；或其亚序列；以及SEQ ID NO:18，45，118，或120的氨基酸序列；或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码乙酰乙酸脱羧酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码乙酰乙酸脱羧酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:16，17，44，117，或119。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:16。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:17。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:44。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:17。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:117。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:17。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:119。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:18，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:45，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:118，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:120，或其亚序列。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:16或17的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，其编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:44的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，其编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:117的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，其编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:119的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，其编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是的成熟多肽SEQ ID NO:18，45，118，或120的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:18或45的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一个方面，SEQ ID NO:18，45，118，或120的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10。

在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是SEQ ID NO:18，45，118，或120的片段，其中所述片段具有乙酰乙酸脱羧酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:18，45，118，或120中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述乙酰乙酸脱羧酶亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸的技术描述于上文。

所述乙酰乙酸脱羧酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌乙酰乙酸脱羧酶。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是梭菌属乙酰乙酸脱羧酶，例如SEQ ID NO:18的拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶或SEQ ID NO:45的丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶。在另一个方面，所述乙酰乙酸脱羧酶是乳杆菌属(Lactobacillus)乙酰乙酸脱羧酶，例如SEQ ID NO:118的唾液乳杆菌(Lactobacillus salvarius)乙酰乙酸脱羧酶或SEQ ID NO:120的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)乙酰乙酸脱羧酶。

其它可用于实践本发明的乙酰乙酸脱羧酶包括，例如糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)乙酰乙酸脱羧酶(AAP42566.1，Kosaka等，Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))。

所述乙酰乙酸脱羧酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

异丙醇脱氢酶和编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸

在本发明中，所述异丙醇脱氢酶可为任何适于实践本发明的异丙醇脱氢酶。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶是在其中产生增加量的异丙醇的培养条件下过表达的异丙醇脱氢酶。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述编码的异源多核苷酸异丙醇脱氢酶选自：(a)异丙醇脱氢酶，其与SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述异丙醇脱氢酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:47的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶与SEQ ID NO:122的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:21，24，47，122的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含的成熟多肽SEQ ID NO:21。在一个方面，SEQ ID NO:21的成熟多肽是SEQ ID NO:21的氨基酸1至351。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含SEQ ID NO:24的成熟多肽。在一个方面，的成熟多肽SEQ ID NO:24是SEQ ID NO:24的氨基酸1至352。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含SEQ ID NO:47的成熟多肽。在一个方面，的成熟多肽SEQ ID NO:47是氨基酸SEQ ID NO:47的1至356。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶包含SEQ ID NO:122的成熟多肽。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的亚序列编码，其中所述异丙醇脱氢酶具有异丙醇脱氢酶活性。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:19或20的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由SEQ ID NO:19或20的亚序列编码，其中所述异丙醇脱氢酶具有异丙醇脱氢酶活性。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:22，或23的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由SEQ ID NO:22或23的亚序列编码，其中所述异丙醇脱氢酶具有异丙醇脱氢酶活性。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:46的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由SEQ ID NO:46的亚序列编码，其中所述异丙醇脱氢酶具有异丙醇脱氢酶活性。

在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:121的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由SEQ ID NO:121的亚序列编码，其中所述异丙醇脱氢酶具有异丙醇脱氢酶活性。

SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的多核苷酸；或其亚序列；以及SEQ ID NO:21，24，47，或122的氨基酸序列；或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码异丙醇脱氢酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码异丙醇脱氢酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:19或20的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:19或20。在另一个方面，所述核酸探针为的成熟多肽编码序列SEQ ID NO:22或23。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:22或23的成熟多肽编码序列。在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:46的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:46。在一个方面，所述核酸探针为SEQ IDNO:121的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:121。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:21，24，47，122，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:21，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:24，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:47，或其亚序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:122，或其亚序列。

在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:19或20的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:22或23的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:46的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:121的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:21的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:24的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:47的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:122的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一些方面，SEQ ID NO:21，24，47或122的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一个方面，SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10。

在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是SEQ ID NO:21，24，47，或122的片段，其中所述片段具有异丙醇脱氢酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:21，24，47，或122中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述异丙醇脱氢酶亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码异丙醇脱氢酶的多核苷酸的技术描述于上文。

所述异丙醇脱氢酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述异丙醇脱氢酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是梭菌属异丙醇脱氢酶，例如SEQ IDNO:21的拜氏梭菌异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)异丙醇脱氢酶，例如SEQ ID NO:24的产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)异丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述异丙醇脱氢酶是乳杆菌属(Lactobacillus)异丙醇脱氢酶，例如SEQ ID NO:47的Lactobacillus antri异丙醇脱氢酶或SEQ ID NO:122的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)异丙醇脱氢酶。

其它可用于实践本发明的脱氢酶包括，例如布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)脱氢酶(P14941.1，Hanai等，Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007)；Peretz等，Anaerobe3:259-270(1997))，a Ralstonia eutropha脱氢酶(formerly Alcaligenes eutrophus)(YP_299391.1，Steinbuchel和Schlegel等，Eur.J.Biochem.141:555-564(1984))，伯克霍尔德氏菌菌属菌种(Burkholderia sp.)AIU652脱氢酶，和植物单胞菌属(Phytomonas)菌种脱氢酶(AAP39869.1，Uttaro和Opperdoes等，Mol.Biochem.Parasitol.85:213-219(1997))。

所述异丙醇脱氢酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

醛脱氢酶和编码醛脱氢酶的多核苷酸

在本发明中，所述醛脱氢酶可为任何适于实践本发明的醛脱氢酶。在一个方面，所述醛脱氢酶是在其中产生增加量的丙醛的培养条件下过表达的醛脱氢酶。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述醛脱氢酶选自：(a)醛脱氢酶，其与SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述醛脱氢酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述醛脱氢酶SEQ ID NO:27的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性与。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:33的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:51的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:54的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:57的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:60的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在另一个方面，所述醛脱氢酶与SEQ ID NO:63的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的氨基酸序列，其等位变体，或前述的片段。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，见上文)。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:25或26的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:28或29的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:31或32的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:48，49，或50的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:52或53的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:55或56的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:58或59的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在另一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:61或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述醛脱氢酶由SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的亚序列编码；其中所述亚序列编码具有醛脱氢酶活性的多肽。

SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的多核苷酸；或其亚序列；以及SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的编码的氨基酸序列；或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码醛脱氢酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码醛脱氢酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:25或26的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:28或29的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:31或32的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:48，49，或50的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:52或53的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:55或56的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:58或59的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:61或62的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述醛脱氢酶是SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一个方面，SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的片段，其中所述片段具有醛脱氢酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述醛脱氢酶亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码醛脱氢酶的多核苷酸的技术描述于上文。

所述醛脱氢酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述醛脱氢酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌醛脱氢酶。

在一个方面，所述醛脱氢酶是是细菌醛脱氢酶。例如，所述醛脱氢酶可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)醛脱氢酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)(Dawes等，1956，Biochim.Biophys.Acta，22:253，其内容通过提述并入本文)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)醛脱氢酶。

在一个方面，所述醛脱氢酶是芽孢杆菌属醛脱氢酶，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)醛脱氢酶。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是乳杆菌属(Lactobacillus)醛脱氢酶，如丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:30的丘状菌落乳杆菌醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是丙酸杆菌(Propionibacterium thiolase)硫解酶，如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)硫解酶(例如，SEQ IDNO:27或51的费氏丙酸杆菌醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)醛脱氢酶，如Rhodopseudomonas palustris醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:54的Rhodopseudomonas palustris醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是红细菌属(Rhodobacter)醛脱氢酶，如荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:57的荚膜红细菌醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是红螺菌属(Rhodospirillum)醛脱氢酶，如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:60的深红红螺菌醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是真杆菌属(Eubacterium)醛脱氢酶，如霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:63的霍氏真杆菌醛脱氢酶)。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是链球菌属醛脱氢酶，如似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)醛脱氢酶。在另一个方面，所述醛脱氢酶是链霉菌属醛脱氢酶，如不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)醛脱氢酶。

在另一个方面，所述醛脱氢酶是梭菌属(Clostridium)醛脱氢酶如拜氏梭菌醛脱氢酶(例如SEQ ID NO:33的拜氏梭菌醛脱氢酶)，或Clostridium kluyveri醛脱氢酶(Burton等，1953，J.Biol.Chem.，202:873，其内容通过提述并入本文)。

其它可用于实践本发明的醛脱氢酶包括但不限于混浊红球菌(Rhodococcus opacus)(GenBank登录号AP011115.1)，Entamoeba dispar(GenBank登录号DS548207.1)和路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(GenBank登录号ACHG01000187.1)。

所述醛脱氢酶亦可包含正丙醇脱氢酶活性，其中所述酶能够将丙酰CoA转化为丙醛，并进一步将丙醛还原为正丙醇。此种具有醇脱氢酶活性和醛脱氢酶活性的多功能酶的实例包括但不限于清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)(GenBank登录号CR936503.1)，Giardia intestinalis(GenBank登录号U93353.1)，Shewanella amazonensis(GenBank登录号CP000507.1)，Thermosynechococcus elongatus(GenBank登录号BA000039.2)，丙酮丁醇梭菌(GenBank登录号AE001438.3)和Clostridium carboxidivorans ATCC No.BAA-624T(GenBank登录号ACVI01000101.1)。

所述醛脱氢酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

甲基丙二酸单酰CoA变位酶和编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的多核苷酸

在所述重组宿主细胞及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性.在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸。所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶可为任何适于实践本发明的甲基丙二酸单酰CoA变位酶。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是在其中产生增加量的R-甲基丙二酸单酰CoA的培养条件下过表达的甲基丙二酸单酰CoA变位酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶选自：(a)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其与SEQ ID NO:93的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:79或80的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ IDNO:79或80的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶包含或组成为氨基酸序列，其具有与SEQ ID NO:93的成熟多肽至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:93的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶包含或组成为SEQ ID NO:93的成熟多肽，其等位变体，或前述具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的片段的氨基酸序列。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶包含或组成为SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶包含或组成为SEQ ID NO:93的成熟多肽。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:79或80的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由多核苷酸编码，其与SEQID NO:79或80的成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由SEQ ID NO:79或80，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由SEQ ID NO:79或80，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由SEQ ID NO:79或80的成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶由SEQ ID NO:79或80的亚序列或其简并编码序列编码，其中所述亚序列编码具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的多肽。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是SEQ ID NO:93的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是SEQ ID NO:93的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是SEQ ID NO:93的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一些方面，SEQ ID NO:93的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。

在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是SEQ ID NO:93的成熟多肽的片段，其中所述片段具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:93中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

在本文中所述的重组宿主细胞和方法的一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的蛋白复合物，其中一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸复合物包含编码第一多肽亚基的第一异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的第二异源多核苷酸。在一个方面，所述第一多肽亚基和所述第二多肽亚基包含不同的氨基酸序列。

在一个方面，所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中。在另一个方面，所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸包含于不同的异源多核苷酸中。对于涉及甲基丙二酸单酰CoA变位酶和其它多肽的核酸构建体的扩展讨论描述于本文。

在所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶蛋白复合物的一个方面，所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与成熟多肽SEQ ID NO:66具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQID NO:64或65的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:64或65的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:69的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:67或68的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:67或68的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:66的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:69的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一个方面，所述第一多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:66的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸；和所述第二多肽亚基包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:69的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述第一多肽亚基包含或组成为SEQ ID NO:66的氨基酸序列，SEQ ID NO:66的成熟多肽，其等位变体，或前述的片段；和所述第二多肽亚基包含或组成为SEQ ID NO:69的氨基酸序列，SEQ ID NO:69的成熟多肽；其等位变体，或前述的片段。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；和所述第二多肽亚基包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在另一个方面，所述第一多肽亚基包含SEQ ID NO:66的成熟多肽；和所述第二多肽亚基包含SEQ ID NO:69的成熟多肽。

在一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与杂交所述成熟多肽编码序列SEQ ID NO:66，或其全长互补链；和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:69的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，见上文)。

在一个方面，所述第一多肽亚基由SEQ ID NO:66的亚序列编码；和/或所述第二多肽亚基由SEQ ID NO:69的亚序列编码；其中所述第一多肽亚基连同所述第二多肽亚基形成具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的蛋白复合物。

在另一个方面，所述第一多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:66的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和所述第二多肽亚基由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:69的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述第一多肽亚基由SEQ ID NO:66，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码；和所述第二多肽亚基由SEQ ID NO:69，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述第一多肽亚基由SEQ ID NO:66，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述第二多肽亚基由SEQ ID NO:69，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述第一多肽亚基由SEQ ID NO:66的成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述第二多肽亚基由SEQ ID NO:69的成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。

在另一个方面，所述第一多肽亚基是SEQ ID NO:66或其成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和/或所述第二多肽亚基是SEQ ID NO:69或其成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:66或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数；或SEQ ID NO:69或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数，不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。

在另一个方面，所述第一多肽亚基是SEQ ID NO:66的片段，和/或所述第二多肽亚基是SEQ ID NO:69的片段，其中所述第一和第二多肽亚基一同形成具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的蛋白复合物。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:66或69中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶(或其亚基)亦可为甲基丙二酸单酰CoA变位酶的等位变体或人工变体。

所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶(或其亚基)亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶(及其亚基)的多核苷酸的技术描述于上文。

SEQ ID NO:79，80，64，65，67，和68的多核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:93，66，和69的氨基酸序列或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶，及其亚基，可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶，如SEQ ID NO:93的大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶。

在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是丙酸杆菌属甲基丙二酸单酰CoA变位酶，费氏丙酸杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶蛋白复合物，其包含的第一亚基为SEQ ID NO:66和第二亚基为SEQ ID NO:69。

其它可用于实践本发明的甲基丙二酸单酰CoA变位酶包括但不限于人(Homo sapiens)甲基丙二酸单酰CoA变位酶(GenBank ID P22033.3；参见Padovani，Biochemistry45:9300-9306(2006))，和扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)甲基丙二酸单酰CoA变位酶(mcmA亚基，GenBank ID Q84FZ1和mcmB亚基，GenBank ID Q6TMA2；参见Korotkova，J Biol Chem.279:13652-13658(2004))，以及弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)sbm(GenBank ID NP_838397.1)，肠沙门氏菌(Salmonella enteric)SARI04585(GenBank ID ABX24358.1)，和弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)YfreA_01000861(GenBank ID ZP_00830776.1)。

所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶，及其亚基亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

在所述重组宿主细胞及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞进一步包含编码多肽的异源多核苷酸，所述多肽与所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或符合。此类多肽可增加甲基丙二酸单酰CoA变位酶的活性，并可从例如来源于邻近甲基丙二酸单酰CoA变位酶来源基因的基因表达。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:72或94的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:70，71，81，或82的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:70，71，81，或82的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包含或组成为氨基酸序列，其与SEQ ID NO:72的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:72的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包含或组成为氨基酸序列，其与SEQ ID NO:94的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:94的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包含或组成为SEQ ID NO:72或94的成熟多肽，其等位变体，或前述具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性的片段的氨基酸序列。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:70或71的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:81或82的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:70或71的成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:81或82的成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽由SEQID NO:70，71，81，82，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。

在一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽是SEQ ID NO:72或94的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一些方面，SEQ ID NO:72或94的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一个方面，所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽是SEQ ID NO:72或94的成熟多肽的片段。

其它可用于实践本发明的与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽包括但不限于来自疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)KPAI71202(GenBank ID YP_055310.1)和扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)meaB(GenBank ID2QM8_B；参见Korotkova，J Biol Chem.279:13652-13658(2004))的多肽。

甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶和编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的多核苷酸

在所述重组宿主细胞及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性。在一些方面，所述宿主细胞包含编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸。所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可为任何适于实践本发明的甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶是在其中产生增加量的丙酰CoA的条件下过表达的甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶选自：(a)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其与SEQ ID NO:103的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列杂交，或其全长互补链；和(c)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包含或组成为氨基酸序列，其与SEQ ID NO:103的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:103的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:103的氨基酸序列，SEQ ID NO:103的成熟多肽序列，其等位变体，或前述具有甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性的片段。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包含或组成为SEQ ID NO:103的成熟多肽序列。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由多核苷酸编码，其与SEQID NO:102的成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由SEQ ID NO:102，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由SEQ ID NO:102，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶由SEQ ID NO:102的亚序列或其简并编码序列编码，其中所述亚序列编码具有甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性的多肽。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶是SEQ ID NO:103的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶是SEQ ID NO:103的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一些方面，SEQ ID NO:103或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。

在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶是SEQ ID NO:103或其成熟多肽序列的片段，其中所述片段具有甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:103中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶亦可为的等位变体或人工变体甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶。

所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的多核苷酸的技术描述于上文。

SEQ ID NO:102的多核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO:103的氨基酸序列或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:102或其简并编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:102的成熟多肽序列或其简并编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:103，其成熟多肽序列，或前述的片段。

所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶是大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，如SEQ ID NO:103的大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶。

可用于实践本发明的其它甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶包括但不限于Propionigenium modestum(mmdA亚基，GenBank ID CAA05137；mmdB亚基，GenBank ID CAA05140；mmdC亚基，GenBank ID CAA05139；mmdD亚基，GenBank ID CAA05138；参见Bott等，Eur.J.Biochem.250:590-599(1997)和小韦容氏球菌(Veillonella parvula)(mmdA亚基，GenBank ID CAA80872；mmdB亚基，GenBank ID CAA80876；mmdC亚基，GenBank ID CAA80873；mmdD亚基，GenBank ID CAA80875；mmdE亚基，GenBank ID CAA80874；参见Huder，J.Bioi.Chem.268:24564-24571(1993)。

所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶和编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的多核苷酸

在所述重组宿主细胞及其使用方法的一些方面，所述宿主细胞具有甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性。在一些方面，所述宿主细胞包含编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸。所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶可为任何适于实践本发明的甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是在其中产生增加量的S-甲基丙二酸单酰CoA的培养条件下过表达的甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶选自：(a)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其与SEQ ID NO:75的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。如本领域技术人员可理解，在一些情况下所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶可符合超过一种上示的选择(a)，(b)和(c)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包含或组成为氨基酸序列，其与SEQ ID NO:75的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:75的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如不超过五个氨基酸，不超过四个氨基酸，不超过三个氨基酸，不超过两个氨基酸，或一个氨基酸。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包含或组成为SEQ IDNO:75的氨基酸序列，SEQ ID NO:75的成熟多肽序列，其等位变体，或前述具有甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性的片段。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包含或组成为SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包含或组成为SEQ IDNO:75的成熟多肽序列。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，见上文)。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由SEQ ID NO:73或74，其成熟多肽编码序列，或前述的简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由SEQ ID NO:73或74，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列，或其简并编码序列编码。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶由SEQ ID NO:73或74的亚序列或其简并编码序列编码，其中所述亚序列编码具有甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性的多肽。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是SEQ ID NO:75的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体，如上文所述。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是SEQ ID NO:75的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是SEQ ID NO:75的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。在一些方面，SEQ ID NO:75的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。

在另一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是SEQ ID NO:75的片段，其中所述片段具有甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性。在一个方面，所述片段中的氨基酸残基的数量是SEQ ID NO:75中的氨基酸残基的数量的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。

所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶亦可为甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的等位变体或人工变体。

所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶亦可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。

用于分离或克隆编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的多核苷酸的技术描述于上文。

SEQ ID NO:75的多核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列或其片段；可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的DNA，如上文所述。本发明涵盖此类探针。可就与上述探针杂交并编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，如上文所述。

在一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:73或74，或其简并编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为SEQ ID NO:75的成熟多肽编码序列或其简并编码序列。在另一个方面，所述核酸探针为多核苷酸序列，其编码SEQ IDNO:75，其成熟多肽序列，或前述的片段。

所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶。

在一个方面，所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶是丙酸杆菌属甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，如费氏丙酸杆菌甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，例如SEQ ID NO:75的费氏丙酸杆菌的甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶。

其它可用于实践本发明的甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶包括但不限于枯草芽孢杆菌YqjC(GenBank ID NP_390273；参见Haller，Biochemistry，39:4622-4629(2000))，智人MCEE(GenBank ID Q96PE7.1；参见(Fuller，Biochemistry，1213:643-650(1983))，褐家鼠(Rattus norvegicus)Mcee(GenBank IDNP001099811.1；参见Bobik，Biol Chem.276:37194-37198(2001))，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)AF454511(GenBank ID AAL57846.1；参见Haller，Biochemistry39:4622-9(2000)；McCarthy，Structure9:637-46(2001)和Fuller，Biochemistry，1213:643-650(1983))，秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)mmce(GenBank ID AAT92095.1；参见Kuhnl等，FEBS J272:1465-1477(2005))，和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)AE016877(GenBank ID AAP08811.1)。

所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

正丙醇脱氢酶和编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸

在本发明中，所述正丙醇脱氢酶可为任何适于实践本发明的醇脱氢酶。在一个方面，所述正丙醇脱氢酶是在其中产生增加量的正丙醇的培养条件下过表达的正丙醇脱氢酶。

用于分离或克隆编码正丙醇脱氢酶的多核苷酸的技术描述于上文。

所述正丙醇脱氢酶可获得自任何属的微生物。在一个方面，所述正丙醇脱氢酶可为获得自任何本文中所述的微生物的细菌、酵母或真菌正丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶是谢氏丙酸杆菌正丙醇脱氢酶。在另一个方面，所述正丙醇脱氢酶是酿酒酵母正丙醇脱氢酶。

所述正丙醇脱氢酶亦可从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得，如上文所述。

核酸构建体

本发明亦涉及包含核酸构建体，其包含编码硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种(几种)编码CoA转移酶(如本文中所述的琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)的异源多核苷酸，编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸，编码醛脱氢酶的异源多核苷酸(和任选地，编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸)与一个或多个(几个)调控序列连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。此类核酸构建体可用于本文中所述的任何宿主细胞和方法。

可以用许多方式操作本文中所述的多核苷酸以提供所需多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码任何本文中所述的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

每个本文中所述的多核苷酸可以可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在一个方面，所述编码硫解酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码醛脱氢酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码CoA转移酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码的异源多核苷酸甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。在另一个方面，所述编码的异源多核苷酸正丙醇脱氢酶可操纵地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。

如上文所述，对于由编码第一多肽亚基的异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸编码的蛋白复合物(例如CoA转移酶蛋白复合物)，每个多核苷酸可包含于单个异源多核苷酸(例如单个质粒)中，或者包含于不同的异源多核苷酸中(例如在不同质粒上)。在一个方面，所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸包含于单个异源多核苷酸中，所述异源多核苷酸可操纵地连接于对于所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸二者均是外源的启动子。在一个方面，所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸包含于不同的异源多核苷酸中，其中所述编码第一多肽亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于外源启动子，且所述编码第二多肽亚基的异源多核苷酸可操纵地连接于外源启动子。前述的启动子可为相同或不同的。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等，1988，Gene69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of所述National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(pro酶)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明亦涉及重组表达载体，其包含编码硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种(几种)编码CoA转移酶(本文中所述的如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)的异源多核苷酸，编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸，和/或编码醛脱氢酶的异源多核苷酸(和任选地，编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸，和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸)；以及启动子；和转录和翻译终止信号。此类重组表达载体可用于任何本文中所述的宿主细胞和方法。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

在一个方面，每个本文中所述的编码硫解酶，CoA转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，异丙醇脱氢酶，甲基丙二酸单酰CoA变位酶，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，醛脱氢酶，和/或正丙醇脱氢酶的多核苷酸包含于独立的载体。在一个方面，至少两个所述多核苷酸包含于单个载体。在一个方面，所有编码所述硫解酶，CoA转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，异丙醇脱氢酶，和醛脱氢酶的多核苷酸包含于单个载体。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

载体优选含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

如本文中所述，本发明涉及包含一种或多种(几种)本文中所述的多核苷酸的重组宿主细胞等，所述多核苷酸可以可操作地连接于一个或多个(几个)指导本文中的多肽的表达的调控序列，以供重组地同时产生正丙醇、异丙醇，或以供同时产生正丙醇和异丙醇。本发明亦涵盖使用此类宿主细胞以供产生正丙醇、异丙醇，或同时产生正丙醇和异丙醇两者的方法。

在一个例示性的方面，用于同时产生正丙醇和异丙醇的重组宿主细胞(例如乳杆菌属宿主细胞)包含：

(1)编码硫解酶的异源多核苷酸，所述酶与SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

(2)一种或多种(几种)编码CoA转移酶蛋白复合物的异源多核苷酸，所述蛋白复合物包含第一多肽亚基和第二多肽亚基，其中所述第一多肽亚基与SEQ ID NO:6，12，37，或41的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性，和其中所述第二多肽亚基与SEQ ID NO:9，15，39，或43的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

(3)编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸，所述酶与SEQ ID NO:18，45，118，或120的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

(4)编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸，所述酶与SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；和

(5)编码醛脱氢酶的异源多核苷酸，所述酶与SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

其中所述重组宿主细胞能够产生正丙醇和异丙醇。

在一些方面，所述重组宿主细胞进一步包含编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸，和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

将包含一个或多个(几个)多核苷酸的构建体或载体(或多个构建体或载体)导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而与亲本细胞不同。在一些情况下，宿主细胞的选择会很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。下文中所述的方面适用于宿主细胞本身，以及使用宿主细胞的方法。

所述宿主细胞可为任何能够重组产生本发明的多肽的细胞，例如原核细胞或真核细胞，和/或任何能够重组产生正丙醇、异丙醇或正丙醇和异丙醇二者的细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何乳杆菌属细胞，包括但不限于，耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)，L.acidifarinae，L.acidipiscis，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，敏捷乳杆菌(L.agilis)，L.algidus，消化乳杆菌(L.alimentarius)，L.amylolyticus，嗜淀粉乳杆菌(L.amylophilus)，L.amylotrophicus，噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)，动物乳杆菌(L.animalis)，L.antri，L.apodemi，L.aquaticus，L.arizonensis，鸟乳杆菌(L.aviarius)，巴伐利亚乳杆菌(L.bavaricus)，双发酵乳杆菌(L.bifermentans)，L.bobalius，短乳杆菌(L.brevis)，布氏乳杆菌(L.buchneri)，L.bulgaricus，L.cacaonum，L.camelliae，L.capillatus，L.carni，干酪乳杆菌(L.casei)，链状乳杆菌(L.catenaformis)，纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)，L.ceti，L.coleohominis，丘状菌落乳杆菌(L.collinoides)，L.composti，L.concavus，L.confusus，棒状乳杆菌(L.coryniformis)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，L.crustorum，弯曲乳杆菌(L.curvatus)，L.cypricasei，德氏乳杆菌(L.delbrueckii)，L.dextrinicus，L.diolivorans，L.divergens，L.durianis，L.equi，L.equicursoris，L.equigenerosi，L.fabifermentans，香肠乳杆菌(L.farciminis)，L.farraginis，L.ferintoshensis，发酵乳杆菌(L.fermentum)，L.fornicalis，食果糖乳杆菌(L.fructivorans)，果糖乳杆菌(L.fructosus)，L.frumenti，L.fuchuensis)，鸡乳杆菌(L.gallinarum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，L.gastricus，L.ghanensis，草乳杆菌(L.graminis)，L.halotolerans，L.hammesii，哈氏乳杆菌(L.hamsteri)，L.harbinensis，L.hayakitensis，瑞士乳杆菌(L.helveticus)，异型腐酒乳杆菌(L.heterohiochii)，希氏乳杆菌(L.hilgardii)，同型腐酒乳杆菌(L.homohiochii)，L.hordei，L.iners，L.ingluviei，肠乳杆菌(L.intestinalis)，詹氏乳杆菌(L.jensenii)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，L.kalixensis，L.kandleri，马乳酒样乳杆菌(L.kefiranofaciens)，马乳酒样乳杆(L.kefiranofaciens)，高加索酸奶粒乳杆菌(L.kefirgranum)，L.kefiri，L.kimchii，L.kisonensis，L.kitasatonis，L.kunkeei，L.lactis，L.leichmannii，林氏乳杆菌(L.lindneri)，坏发酵乳杆菌(L.malefermentans)，马里乳杆菌(L.mali)，麦芽香乳杆菌(L.maltaromicus)，L.manihotivorans，L.mindensis，L.minor，L.minutus，L.mucosae，鼠乳杆菌(L.murinus)，L.nagelii，L.namurensis，L.nantensis，L.nodensis，L.oeni，L.oligofermentans，东方乳杆菌(L.oris)，L.otakiensis，面包乳杆菌(L.panis)，L.pantheris，L.parabrevis，类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，L.paracollinoides，L.parafarraginis，类高加索酸奶乳杆菌(L.parakefiri)，L.paralimentarius，L.paraplantarum，戊糖乳杆菌(L.pentosus)，L.perolens，L.piscicola，植物乳杆菌(L.plantarum)，L.pobuzihii，桥乳杆菌(L.pontis)，L.psittaci，L.rapi，L.rennini，路氏乳杆菌(L.reuteri)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，L.rimae，罗氏乳杆菌(L.rogosae)，L.rossiae，瘤胃乳杆菌(L.ruminis)，L.saerimneri，清酒乳杆菌(L.sakei)，唾液乳杆菌(L.salivarius)，旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis)，L.satsumensis，L.secaliphilus，L.senmaizukei，沙氏乳杆菌(L.sharpeae)，L.siliginis，L.similis，L.sobrius，L.spicheri，L.sucicola，猪双臼乳杆菌(L.suebicus)，L.sunkii，L.suntoryeus，L.taiwanensis，L.thailandensis，L.thermotolerans，发状乳杆菌(L.trichodes)，L.tucceti，齿龈乳杆菌(L.uli)，L.ultunensis，L.uvarum，牛痘乳杆菌(L.vaccinostercus)，阴道乳杆菌(L.vaginalis)，L.versmoldensis，L.viridescens，犊乳杆菌(L.vitulinus)，L.xylosus，果汁乳杆菌(L.yamanashiensis)，玉米乳杆菌(L.zeae)，和L.zymae。在一个方面，所述细菌宿主细胞是植物乳杆菌，食果糖乳杆菌或路氏乳杆菌。

在一个方面，所述宿主细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，乳杆菌属(例如植物乳杆菌，食果糖乳杆菌，或罗氏乳杆菌)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii))。在一个优选的方面，所述宿主细胞是乳杆菌属宿主细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

所述宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。

所述真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

所述丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

所述丝状真菌宿主细胞可为棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

在一个方面，所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。在另一个方面，所述宿主细胞是米曲霉。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。

在一些方面，所述宿主细胞包含一种或多种(几种)本文中所述的多核苷酸，其中所述宿主细胞在相同条件下培养时与不含有所述一种或多种(几种)多核苷酸的宿主细胞相比分泌(或能够分泌)增加水平的异丙醇和/或正丙醇。在一些方面，所述宿主细胞在相同条件下培养时与不含有所述一种或多种多核苷酸(例如不含有编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸)的宿主细胞相比，分泌(或能够分泌)增加至少25%，例如至少至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%水平的异丙醇和/或正丙醇。

在任何这些方面，所述宿主细胞以理论值至少10%，例如至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%或至少90%的产率产生(和/或能够产生)正丙醇和/或异丙醇。

在任何这些方面，所述重组宿主具有大于约0.1g/L每小时，例如，大于约0.2g/L每小时，0.5g/L每小时，0.75g/L每小时，1.0g/L每小时，1.25g/L每小时，1.5g/L每小时，1.75g/L每小时，2.0g/L每小时，2.25g/L每小时，2.5g/L每小时，或3.0g/L每小时的正丙醇和/或异丙醇体积产量(volumetricproductivity)(或组合的正丙醇和异丙醇体积产量)。

可将所述重组宿主细胞在适于产生本文中所述的酶的营养培养基中使用本领域中公知的方法进行培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所需多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)，或可从商业上可获得的成分制备。

本文中的酶及其活性，可使用本领域中公知的和/或上述的方法检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体，酶产物的形成，或酶底物的消失。参见，例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)；及Hanai等,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007))。

方法

本发明亦涉及使用本文中所述的重组宿主细胞产生正丙醇，异丙醇，或同时产生正丙醇和异丙醇的方法。

在一个方面，本发明涵盖了产生正丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下，将任何一个本文中所述的重组宿主细胞(例如任何具有甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性，甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶活性，醛脱氢酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性的宿主细胞)在培养基中培养；和(b)回收所述正丙醇。在一个方面，所述重组宿主细胞包含醛脱氢酶活性。在一个方面，本发明涵盖产生正丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下，在培养基中培养任何一种本文中所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码醛脱氢酶的异源多核苷酸(且任选地包含一种或多种编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸；和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸)；和(b)回收所述正丙醇。在一个方面，所述培养基是发酵培养基。

在一个方面，本发明涵盖如本文中所述的、从例如葡萄糖、琥珀酸、琥珀酰CoA或丙酰CoA产生正丙醇的方法。在一个方面，本发明涵盖通过本文中所述的重组宿主细胞，从例如葡萄糖、琥珀酸、琥珀酰CoA或丙酰CoA产生正丙醇的方法。

在一个方面，本发明涵盖产生异丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇的条件下，将任何一个本文中所述的重组宿主细胞(例如任何具有硫解酶活性，琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性，和异丙醇脱氢酶活性的宿主细胞)在培养基中培养；和(b)回收所述正丙醇。在一个方面，本发明涵盖产生异丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生异丙醇的条件下，在培养基中培养任何一种本文中所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸，一种或多种编码琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的异源多核苷酸；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；和/或编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；和(b)回收所述异丙醇。在一个方面，所述培养基是发酵培养基。在另一个方面，所述培养基是包含甘蔗汁(例如未经灭菌的甘蔗汁)的发酵培养基。

在一个方面，本发明涵盖同时产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下，将任何一个本文中所述的重组宿主细胞(例如具有硫解酶活性，CoA转移酶活性，乙酰乙酸脱羧酶活性，异丙醇脱氢酶活性，甲基丙二酸单酰CoA变位酶活性，甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶活性，醛脱氢酶活性，和/或正丙醇脱氢酶活性的任何宿主细胞)在培养基中培养；和(b)回收所述正丙醇和异丙醇。在一个方面，本发明涵盖产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下，在培养基中培养任何一种本文中所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸(例如琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶)；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；编码醛脱氢酶的异源多核苷酸；和/或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；和(b)回收所述正丙醇和异丙醇。在一个方面，所述培养基是发酵培养基。在另一个方面，所述培养基是包含甘蔗汁(例如未经灭菌的甘蔗汁)的发酵培养基。

本发明可在可发酵的培养基中进行，所述培养基包含一种或多种(几种)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。在一些情况下，所述发酵培养基来源于自然来源如甘蔗、淀粉或纤维素，且可为通过酶水解(糖化)预处理所述来源的结果。在一个方面，所述培养基是包含甘蔗汁的发酵培养基(例如未经灭菌的甘蔗汁)。

除了来自一种或多种(几种)糖的合适碳源，所述发酵培养基可含有其它本领域技术人员已知的营养物或刺激剂，如常量营养物(例如氮源)和微量营养物(例如维生素、矿物质盐和金属辅因子)。在一些方面，所述碳源可优选地与至少一种氮源如酵母提取物、N₂或得不到(例如Bacto^TMPeptone)一同供应。维生素的非限定性实例包括多种维生素、生物质、泛酸、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、和维生素A、B、C、D和E。矿物质盐和金属辅因子的实例包括但不限于Na，P，K，Mg，S，Ca，Fe，Zn，Mn，和Cu。

用于产生方法的合适条件可由本领域技术人员根据本文中的教导来确定。在所述方法的一些方面，将宿主细胞培养约12至约216个小时，如约24至约144个小时，约36至约96个小时温度通常为约26℃至约60℃，特别是约34℃或50℃，和约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。

视需要，培养可在厌氧、基本上厌氧(微氧)或需氧条件下进行。简言之，厌氧指排除氧的环境，基本上厌氧(微氧)指其中氧浓度低于空气的环境，而需氧指其中氧浓度大约等于或大于空气的环境。基本上厌氧条件包括例如这样的培养、分批发酵或连续发酵，所述培养基中溶解的氧浓度维持低于10%饱和。基本上厌氧条件亦包括在维持低于1%氧的空气的密封容器内部的液体培养基中或在固体琼脂上生长或静息的细胞。氧的百分比可通过例如用N₂/CO₂混合物或其它合适的非氧气体在所述培养物中鼓泡来维持。在一些实施方案中，培养在厌氧条件或基本上厌氧条件下进行。

本发明的方法可采用任何合适的发酵操作模式。例如，可对于封闭系统使用分批模式的发酵，其中在发酵开始时设定的培养基和宿主微生物除了(例如用于pH控制，泡沫控制，或其它工艺维持所需的)某些试剂之外不具有其它输入。在本发明中所述的工艺亦可在补料分批或连续模式中使用。

本发明的方法亦可在如搅拌釜、鼓泡塔、气升式反应器和其它本领域技术人员已知的数种生物反应器构造中实践。

所述方法视需要可在游离细胞培养或在固定化细胞培养中进行。可使用任何对于固定化细胞培养的支持材料，如海藻酸，纤维床(fibrous bed)或Argyle材料如纤蛇纹石、蒙脱石KSF和蒙脱石K-10。

在所述方法的一个方面，产物(例如正丙醇和/或异丙醇)是以大于约0.01g/L的滴度，例如大于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价产生。在所述方法的一个方面，所述产物(例如正丙醇)以大于约0.01克每克糖，例如大于约0.02，0.05，0.75，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或1.0克每克糖的效价产生。

在所述方法的一个方面，产物(例如异丙醇和/或正丙醇)的量与在相同条件下培养不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比，为至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，至少75%，或至少100%更高。

重组的正丙醇和异丙醇可任选地从发酵培养基使用任何本领域已知方法回收，所述方法包括但不限于层析(例如尺寸排阻层析，吸附层析，离子交换层析)，电泳方法，差示溶解度，渗透，蒸馏，萃取(例如液-液萃取)，渗透蒸发，提取性过滤，膜过滤，膜分离，反向过滤或超滤。在一个实例中，将异丙醇通过常规的蒸馏方法来从其它发酵的材料分离并纯化。相应地，在一个方面，所述方法进一步包括通过蒸馏纯化回收的正丙醇和异丙醇。

重组的正丙醇和异丙醇亦可通过将杂质(污染物)化学转化为更易通过上述方法(例如层析，电泳方法，差示溶解度，蒸馏，或萃取)从异丙醇去除的产物和/或通过将一种或多种(几种)所述杂质直接化学转化为正丙醇或异丙醇来纯化。例如，在一个方面，本方法进一步包括通过将丙酮污染物转化为异丙醇来纯化回收的异丙醇，或进一步包括通过将丙醛污染物转化为正丙醇来纯化回收的正丙醇。将丙酮转化为异丙醇或将丙醛转化为正丙醇可使用任何本领域中已知的合适还原剂(例如氢化锂铝(LiAlH₄)，钠物种(如钠汞齐或硼氢化钠(NaBH₄))，锡物种(如氯化锡(II)，肼，锌汞齐(Zn(Hg))，二异丁基铝氢化物(diisobutylaluminum hydride，DIBAH)，草酸(C₂H₂O₄)，甲酸(HCOOH)，抗坏血酸，铁物种(如硫酸铁(II)等等)来实现。

在所述方法的一些方面，在经任选地纯化之前和/或之后的重组的正丙醇和异丙醇是基本上纯的。对于产生异丙醇的方法，“基本上纯的”意指回收的正丙醇和异丙醇制备物，其含有不超过15%杂质，其中杂质意指除了丙醇以外的化合物，但不包括其它丙醇异构体。在一个变化形式中，提供了基本上纯的异丙醇的制备物，其中所述制备物含有不多于25%杂质，或不多于20%杂质，或不多于10%杂质，或不多于5%杂质，或不多于3%杂质，或不多于1%杂质，或不多于0.5%杂质。

由本文中所述的任何方法产生的正丙醇和异丙醇可转化为丙烯。丙烯可通过使用本领域中已知的酸性催化剂将正丙醇和/或异丙醇化学脱水来产生，所述催化剂如酸性氧化铝和沸石，酸性有机磺酸树脂，无机酸如磷酸和硫酸，和路易斯酸如三氟化硼和铝化合物(March，Jerry.Advanced Organic Chemistry.New York:John Wiley和Sons，1992)。对于将正丙醇和/或异丙醇脱氢为丙烯的合适温度通常范围为约180℃至约600℃，例如300℃至约500℃，或350℃至约450℃。

正丙醇和/或异丙醇的脱氢反应通常在绝热或恒温反应器中进行，所述反应器亦可为固定或流化床反应器，并可使用范围为约0.1至约60秒，例如约1至约30秒的保留时间来优化。可将未转化的纯再循环至脱氢反应器。

在一个方面，本发明涵盖产生丙烯的方法，其包括：(a)在适于产生正丙醇和/或异丙醇的条件下在培养基中培养本文中所述的重组宿主细胞；(b)回收所述正丙醇和异丙醇；(c)在适于产生丙烯的条件下将所述正丙醇和异丙醇脱水；和(d)回收所述丙烯。在一个方面，所述培养基是可发酵的培养基。在另一个方面，所述培养基是包含甘蔗汁(例如未经灭菌的甘蔗汁)的可发酵的培养基。在一个方面，在对所述正丙醇和异丙醇进行脱水之前产生的正丙醇和/或异丙醇的量(或正丙醇和异丙醇的总量)为大于约0.01g/L，例如大于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。在一个方面，在适于产生丙烯的条件下对正丙醇和异丙醇进行脱水包括将正丙醇和异丙醇与酸性催化剂相接触或用酸性催化剂处理，如本领域中已知。

可在脱水过程中产生的污染物可通过使用本领域中已知的技术进行纯化来去除。例如，丙烯可用水或碱性溶液(caustic solution)洗涤以去除酸性化合物如二氧化碳，和/或给料至床以吸收极性化合物如水或去除例如一氧化碳。或者，可使用蒸馏塔来分离高级烃类如丙烷，丁烷，丁烯和更高级的化合物。从污染物如乙烯分离丙烯可通过本领域中已知的方法如低温蒸馏(cryogenicdistillation)进行。

对于本文中所述的产生方法和宿主细胞，测试正丙醇，异丙醇和丙烯的合适测定法可使用本领域中已知的方法进行。例如，最终正丙醇和异丙醇产物，以及中间物(例如丙酮)和其它有机化合物可通过方法如HPLC(高效液相色谱)，GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质谱)或其它合适的分析方法使用本领域中公知的常规方法来进行分析。在发酵液中正丙醇和异丙醇的释放亦可用发酵上清测试。在发酵培养基中的副产物和剩余糖(如葡萄糖)可通过HPLC使用例如针对葡萄糖和醇的折射率检测器，和针对有机酸的UV检测器(Lin等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或使用其它本领域中公知的合适测定法和检测方法来进行定量。

从正丙醇产生的丙烯可通过本领域中已知的聚合工艺进一步转化为聚丙烯或聚丙烯共聚物。合适的温度通常范围对于本体聚合(bulk polymerization)为约105℃至300℃，或对于悬液中聚合为约50℃至约100℃。或者，聚丙烯可在聚合催化剂如Ziegler-Natta或金属茂(metalocene)催化剂存在下在气相反应器中在约60℃至约80℃的范围的温度来产生。

本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为限制本发明的范围。

实施例

用作缓冲剂和底物的化学品为至少试剂级别的商品。

培养基

LB平板包含37g LB琼脂(Sigma目录号L3027)和双蒸水加至1L。

LBPGS平板包含37g LB琼脂(Sigma目录号L3027)，0.5%淀粉(Merck目录号101252)，0.01M K₂PO₄，0.4%葡萄糖，和双蒸水加至1L。

TY肉汤培养基包含20g胰蛋白胨(Difco目录号211699)，5g酵母提取物(Difco目录号212750)，7*10^-3g氯化亚铁(ferrochloride)，1*10^-3g氯化锰(II)，1.5*10^-3g硫酸镁，和双蒸水加至1L。

基本培养基(MM)包含20g葡萄糖，1.1g KH₂PO₄，8.9g K₂HPO₄；1.0g(NH₄)₂SO₄；0.5g柠檬酸钠；5.0g MgSO₄·7H₂O；4.8mg MnSO₄·H₂O；2mg硫胺素；0.4mg/L生物素；0.135g FeCl₃·6H₂O；10mg ZnCl₂·4H₂O；10mgCaCl₂·6H₂O；10mg Na₂MoO₄·2H₂O；9.5mg CuSO₄·5H₂O；2.5mg H₃BO₃；和双蒸水加至1L，pH用HCl调整至7。

MRS培养基获得自Difco^TM，其为Difco^TMLactobacilli MRS琼脂或Difco^TMLactobacilli MRS培养液，具有下述组成—Difco^TMLactobacilli MRS琼脂：蛋白胨No.3(10.0g)，牛肉提取物(10.0g)，酵母提取物(5.0g)，右旋糖(20.0g)，聚山梨酯80(1.0g)，柠檬酸铵(2.0g)，乙酸钠(5.0g)，硫酸镁(0.1g)，硫酸锰(0.05g)，磷酸二钾(2.0g)，琼脂(15.0g)和水加至1L。Difco^TMLactobacilli MRS培养基：由相同成分组成，但不含琼脂。

LC(携带乳杆菌)培养基包含胰蛋白酶解酪蛋白(10g)，胰蛋白胨(3g)，酵母提取物(5g)，KH₂PO₄(3g)，Tween80(1ml)，乙酸钠(1g)，柠檬酸铵(1.5g)，半胱氨酸HCl(0.2g)，MgSO₄.7H₂O(12mg)，FeSO₄.7H₂O(0.68mg)，MnSO₄.2H₂O(25mg)，和双蒸水加至1L，pH调整至7.0。灭菌的葡萄糖在高压灭菌之后添加至1%(5ml的20%葡萄糖储液/100ml培养基)。

宿主株

植物乳杆菌SJ10656(O4ZY1)：

含有质粒pVS2(von Wright，A.，Tynkkynen，S.，Suominen，M.(1987)Cloning of a Streptococcus lactis subsp.Lactis chromosomal fragment associatedwith the ability to grow in milk.Applied和Environmental Microbiology，53，1584-1588)的植物乳杆菌菌株NC8(Aukrust，T.，和Blom，H.(1992)Transformation of Lactobacillus strains used in meat和vegetable fermentations.Food Research International，25，253-261)在含有5微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上获得，并作为SJ10491冻结。基本上如Ruiz-Barba等(Ruiz-Barba,J.L.,Plard,J.C.,Jiménez-Díaz,R.(1991)Plasmid profiles and curing of plasmidsin Lactobacillus plantarum strains isolated from green olive fermentations.Journal of Applied Bacteriology,71,417-421)所述，通过从在含有0.125微克/ml的新生霉素的MRS培养基中繁殖的培养物铺板至但菌落来就pV32拯救(cure)SJ10491。鉴定了红霉素敏感性菌落，pVS2的缺乏通过质粒制备和使用质粒特异性引物和作为SJ10511冻结的不含质粒的衍生物的PCR扩增来确认。

将SJ10511接种入MRS培养基，在37℃无振荡繁殖一日，并铺板于MRS琼脂平板上以获得单菌落。在37℃过夜生长之后，将单菌落重新在MRS琼脂平板上分离以获得单菌落。在37℃生长两日之后，再次在MRS琼脂平板上重新分离单菌落，将平板在37℃温育三日，并将在该平板上的细胞生长物刮下，并作为SJ10656(又名O4ZY1)储藏于菌株收集。

路氏乳杆菌SJ10655(O4ZXV)：

描述为路氏乳杆菌DSM20016的菌株获得自公共菌株收集，并作为NN016599。将该菌株亚培养于MRS培养基，并将等分试样作为SJ10468冻结。将SJ10468接种入MRS培养基，在37℃无振荡繁殖一日，并铺板于MRS琼脂平板以获得单菌落。在37℃生长两日之后，将单菌落重新在MRS琼脂平板上分离。将平板在37℃温育三日，并将该平板上的细胞生长物刮去，并作为SJ10655储藏于菌株收集(又名：O4ZXV)。

将相同的细胞生长物用于接种10ml MRS培养，将其在37℃无振荡接种3日，之后通过离心收获细胞，并制备基因组DNA(使用来自QIAGEN的QIAamp DNA Blood Kit)并送去进行基因组测序。

基因组序列解释分离株SJ1655(O4ZXV)具有基本上与JCM1112相同的基因组，而不同于紧密相关的菌株DSM20016。JCM1112和DSM20016来源于相同的起始分离株路氏乳杆菌F275(Morita，H，Toh，H.，Fukuda，S.，Horikawa，H.，Oshima，K.，Suzuki，T.，Murakami，M.，Hisamatsu，S.，Kato，Y.，Takizawa，T.，Fukuoka，H.，Yoshimura，T.，Itoh，K.，O’Sullivan，D.J.，McKay，L.，Ohno，H.，Kikuchi，J.，Masaoka，T.，Hattori，M.(2008)Comparative genome analysisof Lactobacillus reuteri和Lactobacillus fermentum reveal a genomic island forreuterin和cobalamin production.DNA research，15，151-161)。

路氏乳杆菌SJ11044：

路氏乳杆菌SJ11044通过下述步骤获得自SJ10655(O4ZXV)：

将SJ10655用pSJ10769，一种含有醇脱氢酶表达构建体的基于pVS2的质粒来转化(如下所述)，得到SJ11016(如下所述)。

将SJ11016在含0.25微克/ml新生霉素的MRS培养基中繁殖，以就该质粒拯救菌株，将其铺板于MRS琼脂平板上，并通过复制铺板鉴定出红霉素敏感性菌株。将一个此种菌株作为SJ11044保存。制备菌株SJ11044连同起始菌株SJ10655进行电穿孔，且使用pSJ10600(如下所述)作为测试质粒，观察到电穿孔频率并无差异。

随后将如此制造的SJ11044电感受态细胞在某些实验用作SJ10655的(相同)替代物。

枯草芽孢杆菌DN1885具有已描述于(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,

C.(1990)Cloning of aldB,which encodesalpha-acetolactate decarboxylase,an exoenzyme from Bacillus brevis.Journal ofBacteriology,172,4315-4321)。

枯草芽孢杆菌JA1343是PL1801的孢子形成阴性衍生物。基因SpoIIAC的一部分已缺失以获得该孢子形成阴性表型。

大肠杆菌：

SJ2：(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,

C.(1990)Cloning of aldB,which encodes alpha-acetolactate decarboxylase,anexoenzyme from Bacillus brevis.Journal of Bacteriology,172,4315-4321).

MG1655：(Blattner,F.R.,Plunkett,G.3rd,Bloch,C.A.,Perna,N.T.,Burland,V.,Riley,M.,Collado-Vides,J.,Glasner,J.D.,Rode,C.K.,Mayhew,G.F.,Gregor,J.,Davis,N.W.,Kirkpatrick,H.A.,Goeden,M.A.,Rose,D.J.,Mau,B.,Shao,Y.(1997).The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.Science,277,1453-1462)。

TG1：TG1是常用的克隆菌株，并获得自商业供应商,具有下述基因型：F’[traD36lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+]glnV(supE)thi-1Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-McrB-)thiΔ(lac-proAB)。

实施例1：对于乳杆菌菌株的电穿孔实验方案

将质粒DNA通过电穿孔导入乳杆菌菌株。

植物乳杆菌菌株如下所述制备以供电穿孔：将菌株从冻结的储备培养物接种入含有甘氨酸添加至1%的MRS培养基，并在37℃无振荡温育过夜。然后将其稀释1:100至新鲜的MRS+1%甘氨酸，并在37℃无振荡温育直至OD₆₀₀达到0.6。将细胞通过在30℃在4000rpm离心10分钟来收获。然后将细胞沉淀重悬于原始体积的1mM MgCl₂，并如上所述通过离心沉淀。然后将细胞沉淀重悬于原始体积的30%PEG1500，并如上所述通过离心沉淀。将这些细胞最终重悬于1/100原始体积的30%PEG1500，并将50微升等分试样迅速冻结于醇/干冰浴，并在-80℃保存直至使用。

对于植物乳杆菌的电穿孔，将冻结细胞在冰上解冻，并添加2微升的TE缓冲液中的DNA悬液。将40微升的混合物转移至冰冷的2mm电穿孔小杯，且电穿孔在BioRad Gene Pulser^TM中以1.5kV；25微法拉第；400欧姆的设置来进行。

添加500微升的MRS-蔗糖-MgCl₂混合物(MRS：6.5ml；2M蔗糖：2.5ml；1M MgCl₂：1ml)。并将所述混合物在30℃无振荡温育2小时，然后铺板。

路氏乳杆菌菌株如下所述制备用于电穿孔：将菌株从冻结的储备培养物接种入LCM培养基，并在37℃无振荡温育过夜。将5ml等分试样转移入500ml LCM并在37℃无振荡温育直至OD₆₀₀达到大约0.8。将如上所述通过离心收获，重悬，并在室温在50ml的经离子交换的灭菌水中洗涤2次，并通过离心收获。将这些细胞最终重悬于2.5ml的30%PEG1500，并将50微升等分试样迅速冻结于醇/干冰浴，并在-80℃保存直至使用。

对于路氏乳杆菌的电穿孔，将冻结细胞在冰上解冻，并添加2微升的TE缓冲液中的DNA悬液。将40微升的混合物转移至冰冷的2mm电穿孔小杯，在冰上放置1-3分钟，且电穿孔在BioRad Gene Pulser^TM中以1.5kV；25微法拉第；400欧姆的设置来进行。添加500微升的LCM，并将所述混合物在30℃无振荡温育2小时，然后铺板。将细胞在LCM琼脂平板(用%琼脂固化的LCM培养基)MRS琼脂平板上铺板，补充所需抗生素，并在厌氧室中温育(Oxoid；配置有Anaerogen袋(sachet))。

实施例2：表达载体pTRGU88的构建。

将含有LacI^q抑制子，trc启动子，和多克隆位点(MCS)的2349bp片段从pTrc99A(E.Amann和J.Brosius，1985，Gene40(2-3)，183-190)使用下示的引物pTrcBglIItop和pTrcScaIbot扩增：

引物pTrcBglIItop：

5’-GAAGATCTATGGTGCAAAACCTTTCGCGG-3’(SEQ ID NO:83)

引物pTrcScaIbot：

5’-AAAAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAG-3’(SEQ ID NO:84)

PCR使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，UK)进行，且所述扩增反应程序为：25个循环，每个在95℃进行2分钟；95℃进行30秒，42℃进行30秒，和72℃进行2分钟；然后一个循环在72℃进行3分钟。将所得PCR产物用PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化，并用各5单位的BglII(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)和ScaI(NewEngland Biolabs)(限制性位点在上述引物中以下划线标出)在37℃消化过夜。然后用PCR Purification Kit(Qiagen)根据生产商的指示纯化经消化的片段。

将含有p15A复制起点的质粒pACYC177(Y.K.Mok等，1988，NucleicAcids Res.16(1)，356)在37℃用5单位ScaI(New England Biolabs)和10单位BamHI(New England Biolabs)消化两小时。将10单位的小牛肠磷酸酶(CIP)(New England Biolabs)添加至该消化，并继续温育一个小时，得到3256bp片段和685bp片段。将消化混合物在1%琼脂糖凝胶上运行，并将3256bp片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)根据生产商的指示纯化。

将纯化的2349bp PCR限制性片段使用Rapid Ligation Kit(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)根据生产商的指示连接入所述3256bp限制性片段，得到pMlBa2。将质粒pMlBa2用PstI如New England Biolabs建议使用标准缓冲液3和BSA消化，得到含有第一547bp的blaTEM-1(含有blaTEM-1启动子和RBS)的1078bp PstI片段和含有p15A复制起点，LacI^q抑制子，trc启动子，多克隆位点(MCS)，和氨基葡糖苷3’磷酸转移酶(aminoglycoside3′-phosphotransferase)基因的4524bp片段。

将所述4524bp片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd)中连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样使用电穿孔转化入大肠杆菌SJ2细胞。将转化体铺板于含有20μg/ml卡那霉素的LBPGS平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含200μg/mL氨苄青霉素的LB平板和在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。分离了八个对氨苄青霉素敏感而对卡那霉素抗性的转化体，并将其在含μg/mL卡那霉素的LB平板上划线纯化。将八个菌落的每一个均接种于液体TY肉汤培养基，并在37℃温育过夜。将来自每个菌落的质粒使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离，然后用EcoRI和MluI双重消化。当使用来自Lonza(Basel，Switzerland)的电泳系统“

System”分析时，每个质粒产生1041bp和3483bp的正确限制性样式。将一个称为大肠杆菌TRGU88的液体过夜培养物在-80℃储藏于30%甘油。将相应的质粒pTRGU88(图4)用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)使用生产商的指示从大肠杆菌TRGU88分离，并储藏于-20℃。

实施例3：在HindIII限制性位点中具有静默突变的合成氨基葡糖苷3’-磷酸转移酶基因的设计和载体pTRGU186的构建

上述载体pTRGU88中范围为1524至2494bp的971bp核苷酸序列包括具有HindIII限制性位点的氨基葡糖苷3’-磷酸转移酶基因的编码序列，将该限制性位点使用如下所述的静默突变消除。

具有静默突变的bla基因：5’-CAT AAA CTT TTG-3’

野生型bla基因：5’-CAT AAG CTT TTG-3’

将具有该静默突变的971bp DNA片段人工构建入pTRGU186。然后对所得序列送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，并在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，该DNA片段两侧为StuI限制性位点以方便后续的克隆步骤。

所述氨基葡糖苷3’-磷酸转移酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，含有静默突变的序列，和推导的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:76、77和78。编码序列为816bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为271个氨基酸。

实施例4：载体pTRGU88的氨基葡糖苷3’-磷酸转移酶基因中HindIII位点的去除和载体pTRGU187的构建

将载体pTRGU88和pTRGU186化学转化入来自NEB(目录号C2925H)的dam^-/dcm^-大肠杆菌，并将每个使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)从5x4ml的LB培养基中50ml的过夜培养重新分离。

pTRGU88中的氨基葡糖苷3’-磷酸转移酶基因两侧为StuI限制性位点，其用于切出范围为1336bp至2675bp的DNA片段。该片段包括编码序列的上游284bp和下游243bp。范围为400bp至1376bp的pTRGU186的StuI片段含有不含HindIII位点的编码序列和编码序列的上游99bp和下游65bp。

将pTRGU88和pTRGU186在37℃用StuI(NEB)消化过夜。将酶在65℃热失活20分钟，并将pTRGU88反应混合物用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)在37℃去磷酸30分钟。将消化的pTRGU88和pTRGU186在1%琼脂糖凝胶上运行，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化预期大小(pTRGU88：1340bp；pTRGU186:977bp)的条带。

将分离的DNA片段在16℃使用T4DNA连接酶在含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)中连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样使用电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有20μg/ml卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU187，接种入含10μg/mL卡那霉素的液体TY肉汤培养基并温育过夜将相应的质粒pTRGU187使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离，然后对其进行用BamHI和ClaI的限制性分析，这导致条带BamHI–ClaI：1764bp和ClaI–BamHI：2760bp，这确证了该基因在pTRGU187中的顺时针取向。将来自含有pTRGU187的液体过夜培养物的大肠杆菌TRGU187在-80℃储藏于30%甘油。

实施例5：肽诱导性pSIP表达载体

肽诱导性表达载体pSIP409，pSIP410，和pSIP411(

E.,Mathiesen,G.,Naterstad,K.,Eijsink,V.G.H.,Axelsson,L.(2005).High-level,induciblegene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum usingversatile expression vectors.Microbiology,151,2439-2449.)从Lars Axelsson，Nofima Mat AS，Norway获得。将pSIP409和pSIP410通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2，在37℃在LB琼脂平板上针对红霉素抗性(150微克/ml)进行选择。两个含有pSIP409的转化体作为SJ10517和SJ10518保存，而两个含有pSIP410的转化体作为SJ10519和SJ10520保存。

将pSIP411转化入基本如Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.,Young,F.E.(1975).Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis:Evidencefor selective induction of prophage in competent cells.Journal of Bacteriology,121,296-304所述的天然感受态枯草芽孢杆菌DN1885细胞，在37℃在LBPGS平板上针对红霉素抗性(5微克/ml)进行选择。两个此类转化体作为SJ10513和SJ10514保存。

还将pSIP411通过电穿孔转化入大肠杆菌MG1655，在37℃在LB琼脂平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)，且两个转化体作为SJ10542和SJ10543保存。

为了用于从在乳杆菌属中的这些载体诱导基因表达，本文中命名为M-19-R且具有下述氨基酸序列：Met-Ala-Gly-Asn-Ser-Ser-Asn-Phe-Ile-His-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Phe-Thr-His-Arg的诱导肽，获得自”Polypeptide LaboratoriesFrance，7rue de Boulogne，67100Strasbourg，France”。

实施例6：用于组成型表达的基于pVS2的载体pSJ10600和pSJ10603的构建。

基于质粒pVS2(von Wright,A.,Tynkkynen,S.,Suominen,M.(1987)Cloning of a Streptococcus lactis subsp.Lactis chromosomal fragment associatedwith the ability to grow in milk.Applied and Environmental Microbiology,53,1584-1588)和Rud等(Rud,I.,Jensen,P.R.,Naterstad,K.,Axelsson,L.(2006)Asynthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillusplantarum.Microbiology,152,1011-1019)所述的启动子构建了一组组成型表达载体。含有P11启动子(具有选定的侧翼限制性位点)的DNA片段，和含有P27(具有选定的侧翼限制性位点)的另一个片段通过Geneart AG(Regenburg，Germany)化学合成。

含有具有侧翼限制性位点的P11的DNA片段和含有具有侧翼限制性位点的P27的DNA片段分别示于SEQ ID NO:85和86。两种DNA片段均以DNA制备物的形式获得，其中已将片段插入标准Geneart载体pMA。将含有P11的载体转化入大肠杆菌SJ2细胞，并将转化体作为SJ10560保存，其含有质粒pSJ10560。将含有P27的载体转化入大肠杆菌SJ2，并将转化体作为SJ10561保存，其含有质粒pSJ10561。

将176bp HindIII片段的形式的含启动子的片段从Geneart载体切出并连接至HindIII消化的pUC19。将含P11的片段从制备自SJ10560的载体切出，连接至pUC19，并将大肠杆菌SJ2的正确转化体作为SJ10585和SJ10586保存，其分别含有pSJ10585和pSJ10586。将含P27的片段从制备自SJ10561的载体切出，连接至pUC19，并将大肠杆菌SJ2的正确转化体作为SJ10587和SJ10588保存，其分别含有pSJ10587和pSJ10588。

质粒pVS2在植物乳杆菌NC8(作为SJ10491保存的菌株)中获得，通过本领域中已知的标准质粒制备步骤从该菌株提取，并转化入大肠杆菌MG1655，在37℃在LB琼脂平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个此类转化体作为SJ10583和SJ10584保存。

为了将P11插入pVS2，将含P11的176bp HindIII片段切出从pSJ10585切出并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并连接至HindIII消化的pVS2(其已从SJ10583制备)。将连接混合物通过电穿孔转化入大肠杆菌MG1655，在LB琼脂平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)，并将两个转化体(其均容纳以两种可能的取向的特定一个具有启动子插入物的质粒)作为SJ10600和SJ10601保存，其含有pSJ10600(图5)和pSJ10601。

为了将P27插入pVS2，将含P27的176bp HindIII片段切出从pSJ10588切出并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并连接至HindIII消化的pVS2(其已从SJ10583制备)。将连接混合物通过电穿孔转化入大肠杆菌MG1655，在LB琼脂平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)，并将两个转化体(其均容纳以两种可能的取向的特定一个具有启动子插入物的质粒)作为SJ10603和SJ10604保存，其含有pSJ10603(图6)和pSJ10604。

另一个转化体(其以两种可能的取向的另一个具有启动子插入物)，作为SJ10605保存，其含有pSJ10605。该质粒中的启动子取向与如上所述的pSJ10602中相同。来自SJ10605的质粒制备物显示与来自SJ10603和SJ10604的类似制备物相比，含有更少DNA，且根据进一步研究，pSJ10605显示非常不稳定，在质粒群体中缺失衍生物占主导地位。

实施例7：发酵产物分析

本文中所述的发酵液中的丙酮、1-丙醇和异丙醇可通过GC-FID检测。将样品用甲醇中的0.05%四氢呋喃1+1稀释并进行分析。GC参数列于表1。

表1。

实施例8：异丙醇途径基因的克隆。

丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的克隆和载体pSJ10705的构建

设计了在丙酮丁醇梭菌中鉴定出的硫解酶基因的1176bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中优化表达，并人工构建入pSJ10705。将含有密码子优化编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTTC-3’紧接着起始密码子之前(以添加HindIII位点并将起始区转化为NcoI相容性BspHI位点)，和将序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’紧接在下游(以添加终止密码子，和限制性位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。

然后将所得序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，并在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。将自Geneart递送的DNA制备物通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2，选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml)，并将两个转化体作为SJ10705(SJ2/pSJ10705)和SJ10706(SJ2/pSJ10706)保存。

所述丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、2和3。编码序列为1179bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为392个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有392个氨基酸，具有41.4kDa的预测分子量和7.08的等电点pH。

路氏乳杆菌硫解酶基因的克隆和载体pSJ10694的构建。

使用下示的引物671826和671827从SJ10468(见上文)的染色体DNA扩增来自路氏乳杆菌的1176bp硫解酶编码序列(不含终止密码子)。

引物671826：

5’-AGTCAAGCTTCCATGGAGAAGGTTTACATTGTTGC-3’(SEQ ID NO:87)

引物671827：

5’-ATGCGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGACTAAATTTTCTTAAGCAGAACCG-3’(SEQID NO:88)

所述PCR反应的程序如下：94℃进行2分钟；然后19个循环，每个在95℃进行30秒，59℃进行1分钟，和72℃进行2分钟；然后一个循环在72℃进行5分钟。将大约1.2kb的PCR扩增的片段用NcoI+EcoRI消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后连接至琼脂糖凝胶电泳纯化的质粒pSIP409的EcoRI-NcoI载体片段。将连接混合物转化入大肠杆菌SJ2，选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml)，并将通过限制性消化和DNA测序认为正确的转化体作为SJ10694保存(SJ2/pSJ10694)。

所述路氏乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:34和35。编码序列为1179bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为392个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有392个氨基酸，具有41.0kDa的预测分子量和5.4的等电点pH。

费氏丙酸杆菌硫解酶基因的克隆和载体pSJ10676的构建。

优化了在费氏丙酸杆菌中鉴定出的硫解酶基因的1152bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10676。将含有密码子优化编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTTC-3’紧接着起始密码子之前(以添加HindIII位点并将起始区转化为NcoI相容性BspHI位点)，和将序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’(SEQ ID NO:12)紧接在下游(以添加终止密码子，和限制性位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。

然后将所得序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，并在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。将自Geneart递送的DNA制备物通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2，选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml)，并将两个转化体作为SJ10676(SJ2/pSJ10676)和SJ10677(SJ2/pSJ10677)保存。

所述费氏丙酸杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:113和114。编码序列为1155bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为384个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有384个氨基酸，具有39.8kDa的预测分子量和6.1的等电点pH。

短乳杆菌硫解酶基因的克隆和载体pSJ10699的构建。

优化了在短乳杆菌中鉴定出的硫解酶基因的1167bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10699。将含有密码子优化CDS的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTTC-3’紧接着起始密码子之前(以添加HindIII位点并将起始区转化为NcoI位点)，和将序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’(SEQ ID NO:12)紧接在下游(以添加终止密码子，和限制性位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。

然后将所得序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，并在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。将自Geneart递送的DNA制备物通过电穿孔转化入大肠杆菌SJ2，选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml)，并将两个转化体作为SJ10699(SJ2/pSJ10699)和SJ10700(SJ2/pSJ10700)保存。

所述短乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:115和116。编码序列为1170bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为389个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有389个氨基酸，具有40.4kDa的预测分子量和6.5的等电点pH。

枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的克隆和载体pSJ10695 和pSJ10697的构建。

设计了枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoA亚基的699bp编码序列(不含终止密码子)和枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoB亚基的648bp编码序列以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并分别人工构建入pSJ10695和pSJ10697。

含有密码子优化的scoA编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTCTCG AGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ ID NO:89)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII位点，乳杆菌RBS和在NcoI位点内具有起始密码子)，和将EcoRI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自GeneartAG并如上所述转化，得到SJ10695(SJ2/pSJ10695)和SJ10696(SJ2/pSJ10696)。

所述枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoA亚基的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。编码序列为702bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为233个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有233个氨基酸，具有25.1kDa的预测分子量和6.50的等电点pH。

含有密码子优化的scoB编码序列的DNA片段设计为序列5’-GAATTCACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:90)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII位点，乳杆菌RBS和在NcoI相容性BspHI位点内具有起始密码子)，和将EagI和KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10697(SJ2/pSJ10697)和SJ10698(SJ2/pSJ10698)。

所述枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoB亚基的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。编码序列为651bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为216个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有216个氨基酸，具有23.4kDa的预测分子量和5.07的等电点pH。

莫哈韦芽孢杆菌(B.mojavensis)琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的克隆和载体pSJ10721和pSJ10723的构建。

设计了莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoA亚基的711bp编码序列(不含终止密码子)和莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoB亚基的654bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并分别人工构建入pSJ10721和pSJ10723。

含有密码子优化的scoA编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTCTCG AGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ ID NO:89)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII位点，乳杆菌RBS和在NcoI位点内具有起始密码子)，和将EcoRI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自GeneartAG并如上所述转化，得到SJ10721(SJ2/pSJ10721)和SJ10722(SJ2/pSJ10722)。

所述莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoA亚基的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、12和13。编码序列为714bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为237个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有237个氨基酸，具有25.5kDa的预测分子量和5.80的等电点pH。

含有密码子优化的scoB编码序列的DNA片段设计为序列5’-GAATTCACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:90)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII位点，乳杆菌RBS和在NcoI相容性BspHI位点内具有起始密码子)，和将EagI和KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10723(SJ2/pSJ10723)和SJ10724(SJ2/pSJ10724)。

所述莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶的scoB亚基的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13、14和15。编码序列为657bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为218个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有218个氨基酸，具有23.4kDa的预测分子量和5.40的等电点pH。

大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因的克隆和载体pSJ10715和pSJ10717 的构建。

优化了大肠杆菌乙酰CoA转移酶的atoA亚基(uniprot:P76459)的648bp编码序列(不含终止密码子)和大肠杆菌乙酰CoA转移酶的atoD亚基(uniprot:P76458)的660bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并分别人工构建入pSJ10715和pSJ10717。

含有密码子优化的atoA亚基核苷酸编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCT TCTCG AGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ ID NO:89)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII和XhoI位点，乳杆菌RBS和在NcoI位点内具有起始密码子)，和将EcoRI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10715(SJ2/pSJ10715)和SJ10716(SJ2/pSJ10716)。

所述大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶的atoA亚基的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:36和37。编码序列为651bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为216个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有216个氨基酸，具有23.0kDa的预测分子量和5.9的等电点pH。

含有密码子优化的atoD核苷酸编码序列的DNA片段设计为序列5’-GAATT CACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:90)紧接在起始密码子之前(以添加EcoRI位点，乳杆菌RBS和在NcoI相容性BspHI位点内具有起始密码子)，和将EagI和KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10717(SJ2/pSJ10717)和SJ10718(SJ2/pSJ10718)。

所述大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶的atoD亚基的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:38和39。编码序列为663bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为220个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有220个氨基酸，具有23.5kDa的预测分子量和4.9的等电点pH。

丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因的克隆和载体pSJ10727和 pSJ10731的构建。

优化了丙酮丁醇梭菌乙酰CoA转移酶的ctfA亚基(uniprot:P33752)的654bp编码序列(不含终止密码子)和丙酮丁醇梭菌乙酰CoA转移酶的ctfB亚基(uniprot:P23673)的663bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并分别人工构建入pSJ10727和pSJ10731。

含有密码子优化的ctfA亚基编码序列的DNA片段设计为序列5’-AAGCTTCTCG AGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGTC-3’(SEQ ID NO:91)紧接在起始密码子之前(以添加HindIII和XhoI位点，乳杆菌RBS和在NcoI相容性BspHI位点内具有起始密码子)，和将EcoRI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10727(SJ2/pSJ10727)和SJ10728(SJ2/pSJ10728)。

所述丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶的ctfA亚基的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:40和41。编码序列为657bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为218个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有218个氨基酸，具有23.6kDa的预测分子量和9.3的等电点pH。

含有密码子优化的ctfB亚基编码序列的DNA片段设计为序列5’-GAATTCACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:90)紧接在起始密码子之前(以添加EcoRI位点，乳杆菌RBS和在NcoI相容性BspHI位点内具有起始密码子)，和将EagI和KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自GeneartAG并如上所述转化，得到SJ10731(SJ2/pSJ10731)和SJ10732(SJ2/pSJ10732)。

所述丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶的ctfB亚基的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:42和43。编码序列为666bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为221个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有221个氨基酸，具有23.6kDa的预测分子量和8.5的等电点pH。

丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的克隆和载体pSJ10711的构建。

优化了来自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶(uniprot:P23670)的777bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10711。

将含有密码子优化的乙酰乙酸脱羧酶编码序列(adc)的DNA片段设计为序列5’-AAGCT TCGGC CGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ IDNO:92)紧接着起始密码子之前(以添加HindIII I和EagI位点和乳杆菌RBS)，和将KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10711(SJ2/pSJ10711)和SJ10712(SJ2/pSJ10712)。

所述丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:44和45。编码序列为780bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为259个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有259个氨基酸，具有27.5kDa的预测分子量和6.2的等电点pH。

拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的克隆和载体pSJ10713的构建。

优化了来自拜氏梭菌的乙酰乙酸脱羧酶(uniprot:Q716S5)的738bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10713。

将含有密码子优化的乙酰乙酸脱羧酶编码序列(adc Cb)的DNA片段设计为序列5’-AAGCT TCGGC CGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQID NO:92)紧接着起始密码子之前(以添加HindIII I和EagI位点和乳杆菌RBS)，和将KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10713(SJ2/pSJ10713)和SJ10714(SJ2/pSJ10714)。

所述拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:16、17和18。编码序列为741bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为246个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有246个氨基酸，具有27.5kDa的预测分子量和6.8的等电点pH。

唾液乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的克隆和载体pSJ10707的构建。

优化了来自唾液乳杆菌的乙酰乙酸脱羧酶(SWISSPROT:Q1WVG5)的831bp CDS(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10707。

将含有密码子优化的乙酰乙酸脱羧酶CDS(adc Ls)的DNA片段设计为序列5’-AAGCT TCGGC CGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ IDNO:92)紧接着起始密码子之前(以添加HindIII I和EagI位点和乳杆菌RBS)，和将KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10707(SJ2/pSJ10707)和SJ10708(SJ2/pSJ10708)。

所述唾液乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:117和118。编码序列为834bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为277个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有277个氨基酸，具有30.9kDa的预测分子量和4.6的等电点pH。

植物乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的克隆和载体pSJ10701的构建。

优化了来自植物乳杆菌的乙酰乙酸脱羧酶(SWISSPROT:Q890G0)的843bp CDS(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10701。

将含有密码子优化的乙酰乙酸脱羧酶CDS(adc Lp)的DNA片段设计为序列5’-AAGCT TCGGC CGACT ATTAC AAGGA GATTT TAGCC-3’(SEQ IDNO:92)紧接着起始密码子之前(以添加HindIII I和EagI位点和乳杆菌RBS)，和将KpnI限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10701(SJ2/pSJ10701)和SJ10702(SJ2/pSJ10702)。

所述植物乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:119和120。编码序列为846bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为281个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有281个氨基酸，具有30.8kDa的预测分子量和4.7的等电点pH。

产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pSJ10719的构建。

优化了来自产乙醇热厌氧杆菌的异丙醇脱氢酶(uniprot:Q2MJT8)的1056bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10719。

将含有密码子优化的异丙醇脱氢酶编码序列(adh Te)的DNA片段设计为序列5’-GGTAC CACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:95)紧接着起始密码子之前(以添加KpnI位点，乳杆菌RBS，和在NcoI相容性BspHI位点内的起始密码子)，和将XmaI和HindIII限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10719(SJ2/pSJ10719)和SJ10720(SJ2/pSJ10720)。

所述产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22、23和24。编码序列为1059bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为352个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有352个氨基酸，具有37.7kDa的预测分子量和6.23的等电点pH。

拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pSJ10725的构建。

优化了来自拜氏梭菌的异丙醇脱氢酶(uniprot:P25984)的1056bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10725。

将含有密码子优化的异丙醇脱氢酶编码序列(adh Cb)的DNA片段设计为序列5’-GGTAC CACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:95)紧接着起始密码子之前(以添加KpnI位点，乳杆菌RBS，和在NcoI相容性BspHI位点内的起始密码子)，和将XmaI和HindIII限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10725(SJ2/pSJ10725)和SJ10726(SJ2/pSJ10726)。

所述拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:19、20和21。编码序列为1059bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为351个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有351个氨基酸，具有37.8kDa的预测分子量和6.64的等电点pH。

Lactobacillus antri异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pSJ10709的构建。

优化了来自L.antri的异丙醇脱氢酶(SWISSPROT:C8P9V7)的1068bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10709。

将含有密码子优化的异丙醇脱氢酶编码序列(sadh La)的DNA片段设计为序列5’-GGTAC CACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:95)紧接着起始密码子之前(以添加KpnI位点和乳杆菌RBS)，和将XmaI和HindIII限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10709(SJ2/pSJ10709)和SJ10710(SJ2/pSJ10710)。

所述L.antri异丙醇脱氢酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:46和47。编码序列为1071bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为356个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有356个氨基酸，具有38.0kDa的预测分子量和4.9的等电点pH。

发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因的克隆和载体pSJ10703的构建。

优化了来自发酵乳杆菌的异丙醇脱氢酶(SWISSPROT:B2GDH6)的1068bp编码序列(不含终止密码子)以供在三种生物：大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中表达，并人工构建入pSJ10703。

将含有密码子优化的异丙醇脱氢酶CDS(sadh Lf)的DNA片段设计为序列5’-GGTAC CACTA TTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:95)紧接着起始密码子之前(以添加KpnI位点和乳杆菌RBS)，和将XmaI和HindIII限制性位点紧接在下游。设计的构建体获得自Geneart AG并如上所述转化，得到SJ10703(SJ2/pSJ10703)和SJ10704(SJ2/pSJ10704)。

所述发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:121和122。编码序列为1071bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为356个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，见上文)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有356个氨基酸，具有37.9kDa的预测分子量和5.2的等电点pH。

实施例9：对于大肠杆菌中异丙醇产生的途径构建体的构建和转化

含有拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的pSJ10843 的构建。

将质粒pSJ10725和pSJ10713各自用KpnI+AlwNI消化。将质粒pSJ10725进一步用PvuI消化以减少不希望的片段的大小。将所得的pSJ10725的1689bp片段和pSJ10713的2557bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。将连接混合物的等分试样用于转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于100个转化体中挑出的四个菌落均通过使用HindIII的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10843(SJ2/pSJ10843)和SJ10844(SJ2/pSJ10844)。

含有丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的 pSJ10841的构建。

将质粒pSJ10725和pSJ10711各自用KpnI+AlwNI消化；此外，将质粒pSJ10725用PvuI消化以减少不希望的片段的大小。将所得的pSJ10725的1689bp片段和pSJ10711的2596bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。将连接混合物的等分试样用于转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于100个转化体中挑出的4个菌落均通过使用BsgI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10841(SJ2/pSJ10841)和SJ10842(SJ2/pSJ10842)。

含有枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的pSJ10748的构建。

将质粒pSJ10697和pSJ10695各自用EcoRI和KpnI消化。将所得的pSJ10697的690bp片段和pSJ10695的3106bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。

将连接混合物的等分试样用于通过电穿孔转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于50个转化体中挑出的3个菌落均通过使用PvuI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10748(SJ2/pSJ10748)和SJ10749(SJ2/pSJ10749)。

含有莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的pSJ10777的构建。

将质粒pSJ10723和pSJ10721各自用EcoRI+KpnI消化。将所得的pSJ10723的696bp片段和pSJ10721的3118bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。

将连接混合物的等分试样用于转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于500个转化体中分析了挑出的4个菌落，且保存了通过使用PvuI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒的一个，得到SJ10777(SJ2/pSJ10777)。

含有大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因的pSJ10750的构建。

将质粒pSJ10717和pSJ10715各自用EcoRI+KpnI消化。将所得的pSJ10717的702bp片段和pSJ10715的3051bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。

将连接混合物的等分试样用于通过电穿孔转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于50个转化体中挑出的3个菌落均通过使用ApaLI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10750(SJ2/pSJ10750)和SJ10751(SJ2/pSJ10751)。

含有丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因的pSJ10752的构建。

将质粒pSJ10731和pSJ10727各自用EcoRI+KpnI消化。将所得的pSJ10731的705bp片段和pSJ10727的3061bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。

将连接混合物的等分试样用于通过电穿孔转化大肠杆菌SJ2化学感受态细胞，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。在多于50个转化体中挑出的3个菌落均通过使用PvuI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10752(SJ2/pSJ10752)和SJ10753(SJ2/pSJ10753)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的表达载体pSJ10798的构建。

将质粒pSJ10705用BspHI和EcoRI消化，而将pSJ10600用NcoI和EcoRI消化。将所得的pSJ10705的1193bp片段和pSJ10600的5147bp片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述进行连接。

将连接混合物的等分试样用于通过电穿孔转化大肠杆菌TG1，并在含200微克/ml氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。4个菌落中的3个均通过使用NsiI的限制性分析以及DNA测序而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10798(TG1/pSJ10798)和SJ10799(TG1/pSJ10799)。

含有路氏乳杆菌硫解酶基因的表达载体pSJ10796的构建。

将质粒pSJ10694用NcoI和EcoRI消化，将所得的1.19kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和EcoRI消化，并将所得的5.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用NsiI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，

并保存了其中进一步通过DNA测序验证的两个，得到SJ10796(TG1/pSJ10796)和SJ10797(TG1/pSJ10797)。

含有费氏丙酸杆菌硫解酶基因的表达载体pSJ10795的构建。

将质粒pSJ10676用BspHI和EcoRI消化，将所得的1.17kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和EcoRI消化，并将所得的5.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用NsiI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中进一步通过DNA测序验证的一个，得到SJ10795(TG1/pSJ10795)。

含有短乳杆菌硫解酶基因的表达载体pSJ10743的构建。

将质粒pSJ10699用NcoI和EcoRI消化，将所得的1.18kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和EcoRI消化，并将所得的5.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了16个所得菌落，且其中两个通过使用ClaI的限制性分析和进一步通过DNA测序验证而被认为含有所需的重组质粒，并保存，得到SJ10743(TG1/pSJ10743)和SJ10757(TG1/pSJ10757)。

含有枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因的表达载体 pSJ10886的构建。

将质粒pSJ10748用NcoI和KpnI消化，将所得的1.4kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用HindIII的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中进一步通过DNA测序验证的两个，得到SJ10886(TG1/pSJ10886)和SJ10887(TG1/pSJ10887)。

含有大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因的表达载体pSJ10888的构建。

将质粒pSJ10750用NcoI和KpnI消化，将所得的1.35kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用HindIII的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中进一步通过DNA测序验证的两个，得到SJ10888(TG1/pSJ10888)和SJ10889(TG1/pSJ10889)。

含有拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的表达载体pSJ10756的构建。

将质粒pSJ10713用EagI和KpnI消化，将所得的0.77kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用EagI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中一个通过使用ClaI的限制性分析和通过DNA测序验证而被认为含有所需的重组质粒，将其作为SJ10756(TG1/pSJ10756)保存。

含有丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因的表达载体pSJ10754的构建。

将质粒pSJ10711用EagI和KpnI消化，将所得的0.81kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用EagI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中三个通过使用ClaI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中通过DNA测序验证的两个，即SJ10754(MG1655/pSJ10754)和SJ10755(MG1655/pSJ10755)。

含有唾液乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的表达载体pSJ10780的构建。

将质粒pSJ10707用PciI和KpnI消化，将所得的0.84kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，所有均通过使用ClaI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中通过DNA测序验证的两个，即SJ10754(MG1655/pSJ10754)和SJ10755(MG1655/pSJ10755)。

含有植物乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶基因的表达载体pSJ10778的构建。

将质粒pSJ10701用NcoI和KpnI消化，将所得的0.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，所有均通过使用ClaI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并保存了其中通过DNA测序验证的两个，即SJ10778(MG1655/pSJ10778)和SJ10779(MG1655/pSJ10779)。

含有Lactobacillus antri异丙醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10768的构建。

将质粒pSJ10709用KpnI和XmaI消化，将所得的1.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用XmaI和KpnI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中两个通过使用ClaI的限制性分析和通过DNA测序的验证而被认为含有所需的重组质粒，将其作为(TG1/pSJ10768)和SJ10769(TG1/pSJ10769)保存。

含有产乙醇热厌氧杆菌异丙醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10745， pSJ10763，pSJ10764，和pSJ10767的构建。

将质粒pSJ10719用BspHI和XmaI消化，将所得的1.06kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和XmaI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，并将一个所得的菌落(通过使用ClaI的限制性分析和通过DNA测序的验证而被认为含有所需的重组质粒)作为SJ10745(MG1655/pSJ10745)保存。亦将所述连接混合物转化入电感受态大肠杆菌JM103，其中四个菌落中的两个通过使用ClaI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，并将它们作为SJ10763(JM103/pSJ10763)和SJ10764(JM103/pSJ10764)保存。

最后，将所述连接混合物转化入电感受态TG1，其中四个菌落中的三个通过使用ClaI的限制性分析而被认为含有所需的重组质粒，其中一个，SJ10767(JM103/pSJ10767)，通过DNA测序验证。

含有拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10782的构建。

将质粒pSJ10725用BspHI和XmaI消化，将所得的1.06kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用NcoI和XmaI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中两个通过使用ClaI的限制性分析和通过DNA测序的验证而被认为含有所需的重组质粒，将其作为SJ10782(TG1/pSJ10782)和SJ10783(TG1/pSJ10783)保存。

含有发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10762的构建。

将质粒pSJ10703用BspHI和XmaI消化，将所得的1.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用XmaI和NcoI消化，并将所得的5.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入JM103以及TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了转化体，且其中两个(每个来自一种宿主菌株)通过使用ClaI的限制性分析和通过DNA测序的验证而被认为含有所需的重组质粒，将其作为SJ10762(JM103/pSJ10762)和SJ10765(TG1/pSJ10765)保存。转化体SJ10766(JM103/pSJ10766)亦验证为含有发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10954的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10777用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10954(TG1/pSJ10954)和SJ10955(TG1/pSJ10955)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10956的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10777用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10956(TG1/pSJ10956)和SJ10957(TG1/pSJ10957)。

从独立的构建过程(消化，片段纯化，连接，通过电穿孔转化)，将一个转化体通过使用XbaI的限制性分析而认为含有所需的重组质粒，将其作为SJ10926(TG1pSJ10926)保存。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10942的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10748用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10942(TG1/pSJ10942)和SJ10943(TG1/pSJ10943)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10944的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10748用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10944(TG1/pSJ10944)和SJ10945(TG1/pSJ10945)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10946的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10750用XhoI和EagI消化，并将所得的1.37kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10946(TG1/pSJ10946)和SJ10947(TG1/pSJ10947)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因(两个亚基)，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10948的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10750用XhoI和EagI消化，并将所得的1.37kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10948(TG1/pSJ10948)和SJ10949(TG1/pSJ10949)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因 (两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10950的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10752用XhoI和EagI消化，并将所得的1.38kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10950(TG1/pSJ10950)和SJ10951(TG1/pSJ10951)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因 (两个亚基)，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10952的构建。

将质粒pSJ10798用XhoI和XmaI消化，将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10752用XhoI和EagI消化，并将所得的1.38kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中两个，得到SJ10952(TG1/pSJ10952)和SJ10953(TG1/pSJ10953)。

含有在P11启动子调控下的丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10790的构建。

将质粒pTRGU00178(参见美国临时专利申请号61/408,138，2010年10月29日提交)用NcoI和BamHI消化，并将所得的1.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将pTRGU00178亦用BamHI和SalI消化，并将所得的2.1kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSIP409用NcoI和XhoI消化，将所得的5.7kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入SJ2电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用EcoRI，BglII，和HindIII的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10562(SJ2/pSJ10562)和SJ10563(SJ2/pSJ10563)保存。

将质粒pSJ10562用XbaI和NotI消化，并将所得的7.57kb片段使用凝胶电泳纯化。将pTRGU00200(见上文)用XbaI和NotI消化，并将所得的2.52kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用NotI+XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10593(MG1655/pSJ10593)和SJ10594(MG1655/pSJ10594)保存。

将质粒pTRGU00200用EcoRI和BamHI消化，并将所得的1.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10600用EcoRI和BamHI消化，并将所得的5.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用EcoRI+BamHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10690(MG1655/pSJ10690)和SJ10691(MG1655/pSJ10691)保存。

将质粒pSJ10593用BamHI和XbaI消化，并将所得的3.25kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10690用BamHI和XbaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用NsiI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10790(TG1/pSJ10790)和SJ10791(TG1/pSJ10791)保存。

含有在P27启动子调控下的丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的pSJ10792的构建。

将质粒pTRGU00200用EcoRI和BamHI消化，并将所得的1.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10603用EcoRI和BamHI消化，并将所得的5.2kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入MG1655电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用EcoRI+BamHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10692(MG1655/pSJ10692)和SJ10693(MG1655/pSJ10693)保存。

将质粒pSJ10593用BamHI和XbaI消化，并将所得的3.25kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10692用BamHI和XbaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个转化体通过使用NsiI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其作为SJ10792(TG1/pSJ10792)和SJ10793(TG1/pSJ10793)保存。

含有路氏乳杆菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ11208的构建。

将质粒pSJ10796(如下所述)用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10954用XhoI和XmaI消化，并将所得的3.28kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了三个所得克隆并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中的两个，得到了SJ11208(TG1/pSJ11208)和SJ11209(TG1/pSJ11209)。

含有路氏乳杆菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ11204的构建。

将质粒pSJ10796(如下所述)用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10942用XhoI和XmaI消化，并将所得的3.26kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得克隆并通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中的两个，得到了SJ11204(TG1/pSJ11204)和SJ11205(TG1/pSJ11205)。

含有路氏乳杆菌硫解酶基因，大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体 pSJ11230的构建。

将质粒pSJ10796(如下所述)用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10946用XhoI和XmaI消化，并将所得的3.23kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了七个所得克隆，且其中5个通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，并保存了其中的两个，得到了SJ11230(TG1/pSJ11230)和SJ11231(TG1/pSJ11231)。

含有路氏乳杆菌硫解酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因(两个亚基)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ11206的构建。

将质粒pSJ10796(如下所述)用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.3kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10951用XhoI和XmaI消化，并将所得的3.23kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1电感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得克隆，且其中两个个通过使用XbaI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将它们作为SJ11206(TG1/pSJ11206)和SJ11207(TG1/pSJ11207)保存。

实施例10：在大肠杆菌的小规模分批繁殖过程中丙酮和异丙醇的产生

将实施例9中所述的大肠杆菌菌株直接从-80℃储备培养接种，并在补充1%葡萄糖和100微克/ml红霉素的LB培养基中，在37℃以300rpm下振荡生长过夜。

在24小时之后从每份培养基移取1.5mL样品。将每个样品使用桌上离心机(table centrifuge)以15000xg离心，并使用气相色谱分析上清。发酵液中的丙酮和异丙醇如上所述通过GC-FID检测。结果示于表2，其中基因构建体以下述缩写表示：

作为对照菌株，将大肠杆菌SJ10766(其含有相同的表达载体骨架，但仅携带SEQ ID NO:121的发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因(sadh_Lf))和和大肠杆菌SJ10799(其含有相同的表达载体骨架，但仅携带SEQ ID NO:2的丙酮丁醇梭菌硫解酶基因)以相同方式接种。

表2.

^*nd意指未检测出。

在无振荡下温育了类似的培养物；在所有这些中，2-丙醇水平为0.001%至0.009%，两个对照菌株SJ10766和SJ10799除外，其中未检测出异丙醇。

实施例11：在变化的葡萄糖浓度下在大肠杆菌的小规模分批繁殖过程中丙酮和异丙醇的产生

将发酵培养基(含100微克/ml红霉素的LB，和1、2、5或10%葡萄糖加至10ml的总体积)用直接来自冻结的储备培养物的菌株接种，并在振荡下在37℃温育。在1、2和3日之后取上清样品，并如上所述分析其丙酮和异丙醇含量。包括了菌株SJ10766(其包含相同的表达载体骨架，但进携带醇脱氢酶基因sadh_Lf)作为阴性对照。

结果示于表3，其中基因构建体表示为实施例3中所示的缩写。所有异丙醇操纵子菌株能够产生多于1g/l的异丙醇，其中该实验中的最高产生菌株SJ10946产生了0.208%异丙醇。

表3

^*nd意指未检测出。

实施例12：在大肠杆菌的小规模分批繁殖过程中丙酮和异丙醇的产生

将如上所述选定的大肠杆菌菌株一式两份直接从-80℃储备培养物接种，并在补充1%葡萄糖和100毫克/ml红霉素的LB培养基中，在10ml试管中在37℃以300rpm振荡下生长过夜。在24小时之后从每份培养基移取1.5mL样品。将每个样品以15000x g离心，并如上所述将上清用于丙酮和异丙醇含量测定。

结果示于表4，其中基因构建体表示为实施例3中所示的缩写，且thl_Lr表示路氏乳杆菌硫解酶基因构建体。

表4.

该实验说明携带基于pSJ10600、包含路氏乳杆菌硫解酶基因的大肠杆菌TG1能够产生显著量的异丙醇。

实施例13：用于在植物乳杆菌中产生异丙醇的肽可诱导途径构建体的构建和转化

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因的表达载体pSJ10776的构建。

将质粒pSJ10705用BspHI和EcoRI消化，和将pSIP409用NcoI和EcoRI消化。将所得的pSJ10705的1.19kb片段和pSIP409的5.6kb片段各自使用凝胶电泳纯化，并随后如本文中概述连接。

将连接混合物的等分试样用于如本文中所述转化大肠杆菌MG1655化学感受态细胞，并在37℃在含200微克/ml红霉素的LB平板上选择转化体。一个转化体通过使用PstI+NsiI的限制性分析以及DNA测序被认为含有所需的重组质粒，将其作为SJ10776(MG1655/pSJ10776)保存。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10903的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10748用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中2个菌株通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其保存，得到SJ10903(TG1/pSJ10903)和SJ10904(TG1/pSJ10904)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因(s)，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10905的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10748用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中三个通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其中两个保存，得到SJ10905(TG1/pSJ10905)和SJ10906(TG1/pSJ10906)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10907 的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10750用XhoI和EagI消化，并将所得的1.37kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中三个通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其中两个保存，得到SJ10907(TG1/pSJ10907)和SJ10908(TG1/pSJ10908)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，大肠杆菌乙酰乙酰CoA转移酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体 pSJ10909的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10750用XhoI和EagI消化，并将所得的1.37kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中三个通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其中两个保存，得到SJ10909(TG1/pSJ10909)和SJ10910(TG1/pSJ10910)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10911的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10777用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了四个所得菌落，且其中两个通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其保存，得到SJ10911(TG1/pSJ10911)和SJ10912(TG1/pSJ10912)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体pSJ10940的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10777用XhoI和EagI消化，并将所得的1.43kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了数个所得菌落，且其中两个通过使用BspHI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其保存，得到SJ10940(TG1/pSJ10940)和SJ10941(TG1/pSJ10941)。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体 pSJ10973的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10752用XhoI和EagI消化，并将所得的1.38kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10843用EagI和XmaI消化，将所得的1.85kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了数个所得菌落，且其中两个通过使用PstI以及ApaLI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其保存作为SJ10973(TG1/pSJ10973)和SJ10974(TG1/pSJ10974)保存。

含有丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰CoA转移酶基因，丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌醇脱氢酶基因的表达载体 pSJ10975的构建。

将质粒pSJ10776用XhoI和XmaI消化，并将所得的6.8kb片段使用凝胶电泳纯化。将pSJ10752用XhoI和EagI消化，并将所得的1.38kb片段使用凝胶电泳纯化。将质粒pSJ10841用EagI和XmaI消化，将所得的1.89kb片段使用凝胶电泳纯化。将经纯化的三个片段混合，连接，并将连接混合物转化入TG1化学感受态细胞，在37℃在LB平板上选择红霉素抗性(200微克/ml)。分析了数个所得菌落，且其中三个通过使用PstI以及ApaLI的限制性分析而认为其含有所需的重组质粒，将其中两个作为SJ10975(TG1/pSJ10975)和SJ10976(TG1/pSJ10976)保存。

用含有肽诱导性异丙醇操纵子构建体的表达载体转化植物乳杆菌 SJ10656

将植物乳杆菌SJ10656如本文中所述用质粒通过电穿孔转化，并获得和保存了用每种质粒所得的转化体(参见表5)。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表5

实施例14：在含转化菌株的子集的植物乳杆菌中的异丙醇和丙酮产生

将MRS培养基(2ml总体积，含有10μg/ml红霉素)用来自保存在-80℃的储备小瓶的重组植物乳杆菌菌株接种入2ml Eppendorf试管，并在无振荡下在37℃温育过夜。翌日，对于每个菌株，使用来自这些培养的50微升体积的培养液，以用MRS+10微克/ml红霉素接种两个10ml小瓶中的每一个，其中一个以大约50ng/ml的浓度含有对于pSIP载体系统的诱导肽(M-19-R)。将小瓶封闭，并在无振荡下在37℃温育。在1和2日温育之后收获上清样品，并如本文中所述分析其丙酮和异丙醇含量。结果示于表6。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表6.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

实施例14：在植物乳杆菌中的异丙醇和丙酮产生，和丙酮添加的效果

将重组植物乳杆菌菌株在含10微克/ml红霉素静止的MRS培养基中在37℃生长3日。培养物含有诱导M-19-R多肽(50ng/ml)和/或和/或丙酮(5ml/l)，如表7中所示。对上清如本文中所述分析其丙酮和异丙醇含量。对照菌株SJ10678含有“空”pSJ10600表达载体。结果示于表7。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表7

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

如表7中所示，在诱导后在所有含异丙醇操纵子的菌株中检测出异丙醇。未补充和未诱导的培养物未产生可检测的异丙醇。添加丙酮时，对于未诱导的异丙醇操纵子培养物中以少量检测出异丙醇(但在对照中未检测出)，且在用诱导肽诱导之后异丙醇显著增加。

实施例15：在具有表达载体(其含有具有路氏乳杆菌硫解酶的构建体)的植物乳杆菌中的异丙醇和丙酮产生

将上述选定的重组植物乳杆菌菌株(以及来自制备的其它转化体菌落，示为-B，-C，-D等)接种入含有MRS培养基(含有10微克/ml红霉素)的2mlEppendorf试管中，并在无振荡下在37℃储藏过夜。对每次接种的0.5ml上清样品如本文中所述分析其丙酮和异丙醇含量。结果示于表8。构建体表示为上文实施例中所示的缩写。

表8.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

实施例16：异丙醇途径酶表达。

在植物乳杆菌中的硫解酶表达和活性。

将质粒pSJ10796和pSJ10798如前所述通过电穿孔接种入植物乳杆菌SJ10656，在MRS琼脂平板上选择红霉素抗性(10微克/ml)。在30℃温育3日之后，将来自每个转化的两个菌落接种入含红霉素(10微克/ml)的MRS培养基，并在37℃过夜温育之后通过离心收获细胞等分试样。

DNA用”Extract-Amp^TM Plant Kit”(Sigma)提取，并将用引物663783和663784(见下)的PCR扩增用于验证在所述质粒上携带的红霉素抗性基因的存在。

引物663783：5’-CTGATAAGTGAGCTATTC-3’(SEQ ID NO:123)

引物663784：5’-CAGCACAGTTCATTATC-3’(SEQ ID NO:124)

具有pSJ10796或pSJ10798的转化体，其分别作为SJ10858和SJ10859保存。

使用下述四种植物乳杆菌的菌株以验证硫解酶表达：

SJ10857：其含有编码SEQ ID NO:114的费氏丙酸杆菌硫解酶的基因，其具有不希望的缺失。

SJ10858：其含有编码SEQ ID NO:35的路氏乳杆菌硫解酶的pSJ10796。

SJ10859：其含有编码SEQ ID NO:3的丙酮丁醇梭菌硫解酶的pSJ10798。

SJ10870：其含有编码SEQ ID NO:116的短乳杆菌硫解酶的基因。

将所述菌株在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养中繁殖1日。然后汇集培养物，并通过离心收获细胞。

将细胞沉淀通过用玻璃球处理来机械破坏，所述处理为在1.5Eppendorf试管中的500微升的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中进行3个循环，每个40秒，在循环之间在冰上冷却。细胞碎片通过离心去除，并将上清用于分析。

混合样品中的硫解酶酶活性如下所述进行确认：

硫解酶活性通过在微滴定板的孔中混合50μl200μM乙酰乙酰CoA(Sigma A1625)，50μl200μM辅酶A(Sigma C3144)，50μl缓冲液(100mMTris，60mM MgCl₂，pH8.0)和50μl来自细胞裂解的上清(用MilliQ水稀释20-80x)混合来测量。随后在读板器(Molecular Devices，SpectraMax Plus)中在310nm以分光光度法测量(每20秒进行测量，持续20分钟)由于连接酶催化的乙酰CoA的形成所致的乙酰乙酰CoA与镁的复合物消失的动理学(kinetics)。包括了不含辅酶A添加的空白样品，并将其减去。硫解酶活性根据起始吸光度斜率使用下述方程计算：活性=-(斜率样品-斜率空白)*稀释因子。发现混合的细胞裂解液中的活性为400±70mOD/min。

对混合样品通过质谱法如下述实施例中所述进行蛋白分析，将肽谱图与由从基因组序列推导的植物乳杆菌WCFS1蛋白组成的数据库(加上根据导入的重组质粒推导的四个硫解酶蛋白序列)相比较。

在鉴定出的279个蛋白中，丙酮丁醇梭菌硫解酶鉴定为具有4.02的emPAI值，而路氏乳杆菌硫解酶鉴定为具有1.53的emPAI值。

在不同实验中，将菌株SJ10857，SJ10858，SJ10859，SJ10870，和SJ10927(含有正确的费氏丙酸杆菌硫解酶基因)在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养中繁殖1日，并通过离心收获来自1ml培养体积的细胞。

将单个细胞沉淀通过用玻璃球处理来机械破坏，所述处理为在1.5Eppendorf试管中的50微升的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中进行4个循环，每个40秒，在循环之间在冰上冷却。添加450微升该缓冲液，细胞碎片通过离心去除，并将上清用于分析。

在来自SJ10858和SJ10859(即含有具有路氏乳杆菌和丙酮丁醇梭菌硫解酶的构建体的菌株)的裂解液中使用如上所述的测定法检测出显著的硫解酶酶活性。在SJ10858和SJ10859中分别发现220mOD/min和19mOD/min的活性。

在路氏乳杆菌中的硫解酶表达和活性。

制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述用包含编码选定的硫解酶的多核苷酸的质粒进行转化。下述质粒导致所示的转化体，将其在含10微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上选择，在厌氧室中在37℃温育。

pSJ10795(含有thl_Pf；SEQ ID NO:113)：SJ11175

pSJ10798(含有thl_Ca；SEQ ID NO:2)：SJ11177

pSJ10743(含有thl_Lb；SEQ ID NO:115)：SJ11179

pSJ10796(含有thl_Lr；SEQ ID NO:34)：SJ11181

将这些菌株在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养中繁殖1日，并通过离心收获来自4ml培养体积的细胞。

将细胞在500微升的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)中洗涤一次，重悬于50微升的该缓冲液，并通过用玻璃球的处理来机械破坏，所述处理为在1.5ml Eppendorf试管中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中以4.0m/s的设置进行4个循环，每循环40秒，其中在循环之间在冰上冷却。添加450微升缓冲液，并通过离心去除细胞碎片，并使用上清进行酶活性分析。

类似地，将1ml的每种培养物混合，如上所述洗涤并破坏混合的样品，并使用该混合样品通过如他处所述的质谱法进行蛋白分析。

丙酮丁醇梭菌硫解酶检测为具有8.16的相对emPAI值，路氏乳杆菌硫解酶检测为具有1.2的相对emPAI值，而短乳杆菌硫解酶检测为具有0.46的相对emPAI值。

将单个样品用于酶活性分析，其中获得了下述相对活性水平：

A.pSJ10795(含有thl_Pf；SEQ ID NO:113)：SJ11175=36

B.pSJ10798(含有thl_Ca；SEQ ID NO:2)：SJ11177=22000

C.pSJ10743(含有thl_Lb；SEQ ID NO:115)：SJ11179=2100

D.pSJ10796(含有thl_Lr；SEQ ID NO:34)：SJ11181=3000

在植物乳杆菌中的CoA转移酶表达和活性

如前所述通过电穿孔将质粒pSJ10886和pSJ10887导入植物乳杆菌SJ10656，且载体的红霉素抗性基因的存在通过用引物663783和663784(见上文)的PCR扩增来确认。

将具有pSJ10886的转化体作为SJ10922保存，并将具有pSJ10887的转化体作为SJ10923保存。

同样，将pSJ10888导入SJ10656，得到SJ10988，并将pSJ10889导入SJ10656，得到SJ10929。

将菌株SJ10922和SJ10923(含有所述枯草芽孢杆菌scoAB基因对)和菌株SJ10929和SJ10988(含有所述大肠杆菌atoAD基因对)在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止2ml培养中繁殖1日，并通过离心收获细胞。

将单个细胞沉淀通过用玻璃球处理来机械破坏，所述处理为在1.5Eppendorf试管中的50微升的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中进行5个循环，每个40秒，在循环之间在冰上冷却。添加450微升的该缓冲液，细胞碎片通过离心去除，并将上清用于分析。

将来自SJ10929和SJ10923的裂解液汇集并通过质谱法分析。在鉴定出的461个蛋白中，AtoD亚基鉴定为具有3.9的emPAI值，ScoB亚基鉴定为具有0.14的emPAI值。

类似地，将来自SJ10922的裂解液与来自含有表达质粒(其携带来自莫哈韦芽孢杆菌的scoAB基因)的植物乳杆菌菌株的以类似方式获得的裂解液汇集，并进行分析。在鉴定出的472个蛋白中，枯草芽孢杆菌ScoA亚基鉴定为具有0.65的emPAI值，而枯草芽孢杆菌ScoB亚基鉴定为具有0.14的emPAI值。

使用下述实验方案在细胞裂解液中测量琥珀酰CoA乙酰乙酸转移酶活性。在微滴定板的孔中，混合50μl80mM乙酰乙酸锂(Sigma A8509)，50μl400μM琥珀酰CoA(Sigma S1129)，50μl缓冲液(200mM Tris，60mM MgCl2，pH9.1)和50μl细胞裂解液(用MilliQ水稀释5-20x)。在酶反应中形成的乙酰乙酰CoA与镁复合，并在读板器中以分光光度法通过在310nm以每20秒进行测量吸光度持续20分钟来检测。包括了不含细胞裂解液的空白样品。转移酶活性根据吸光度增加的起始斜率使用下述方程来计算：活性=(斜率样品-斜率空白)*稀释系数。在来自SJ10922的细胞裂解液中，发现了5.6±0.5mOD/min的活性。

在路氏乳杆菌中的CoA转移酶表达和活性。

制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述用包含编码选定的CoA转移酶的多核苷酸的质粒来转化。下述质粒导致所示的转化体，将其在含10微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上选择，在厌氧室中在37℃温育。

pSJ10887(含有scoAB_Bs；SEQ ID NO：5+8)：SJ11197

pSJ10888(含有atoAD_Ec；SEQ ID NO：36+38)：SJ11199

pSJ10990(含有ctfAB_Ca；SEQ ID NO：40+42)：SJ11221

来自枯草芽孢杆菌的ScoA亚基检测为具有0.33的相对emPAI值，来自枯草芽孢杆菌的ScoB亚基检测为具有0.08的相对emPAI值，而来自大肠杆菌的AtoA亚基检测为具有0.06的相对emPAI值。

A.pSJ10887(含有scoAB_Bs；SEQ ID NO：5+8)：SJ11197

AtoAD活性=80±30；ScoAB活性=320±40

B.pSJ10888(含有atoAD_Ec；SEQ ID NO：36+38)：SJ11199

AtoAD活性=6±4；ScoAB活性=1±2

C.pSJ10990(含有ctfAB_Ca；SEQ ID NO：40+42)：SJ11221

AtoAD活性=1±1；ScoAB活性=1±3

在植物乳杆菌中的乙酰乙酸脱羧酶表达和活性。

如前所述通过电穿孔将质粒pSJ10756导入植物乳杆菌SJ10511(与SJ10656相同)，且载体的红霉素抗性基因的存在通过用引物663783和663784(见上文)的PCR扩增来确认。将两个转化体作为SJ10788和SJ10789保存。

同样，将质粒pSJ10754和pSJ10755转化入SJ10511，得到SJ10786和SJ10787，将质粒pSJ10778和pSJ10779转化入SJ10656，得到SJ10849和SJ10850，和将质粒pSJ10780和pSJ10781转化入SJ10656，得到SJ10851和SJ10852。

使用下述8个菌株验证乙酰乙酸脱羧酶表达：

SJ10786和SJ10787，两者均含有编码SEQ ID NO:45的丙酮丁醇梭菌乙酰乙酸脱羧酶的基因。

SJ10788和SJ10789，两者均含有编码SEQ ID NO:18的拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶的pSJ10756。

SJ10851和SJ10852，两者均含有编码SEQ ID NO:118的唾液乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶的基因。

SJ10849和SJ10850，两者均含有编码SEQ ID NO:120的植物乳杆菌乙酰乙酸脱羧酶的基因。

将这些菌株在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养中繁殖1日，并将培养物汇集，并通过离心收获细胞。将细胞悬于1/3初始体积的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)，并通过用玻璃球的处理来机械破坏，所述处理为以500微升等分试样在1.5ml Eppendorf试管中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中以4.0m/s的设置进行5个循环，每循环40秒，其中在循环之间在冰上冷却。通过离心去除细胞碎片，并使用上清进行酶活性分析。

将汇集的样品用于如前所述通过质谱法进行蛋白分析，且在鉴定出的245个蛋白中，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶鉴定为具有0.26的emPAI值。

在路氏乳杆菌中的乙酰乙酸脱羧酶表达和活性。

制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述用包含编码选定的乙酰乙酸脱羧酶的多核苷酸的质粒来转化。下述质粒导致所示的转化体，将其在含10微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上选择，在厌氧室中在37℃温育。

pSJ10754(含有adc_Ca；SEQ ID NO:44)：SJ11183

pSJ10756(含有adc_Cb；SEQ ID NO:17)：SJ11185

pSJ10780(含有adc_Ls；SEQ ID NO:117)：SJ11187

pSJ10778(含有adc_Lp；SEQ ID NO:119)：SJ11189

来自植物乳杆菌的乙酰乙酸脱羧酶检测为具有0.08的相对emPAI值，而来自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶检测为具有0.08的相对emPAI值。

A.pSJ10754(含有adc_Ca；SEQ ID NO:44)：SJ11183=6±13

B.pSJ10756(含有adc_Cb；SEQ ID NO:17)：SJ11185=-1±16

C.pSJ10780(含有adc_Ls；SEQ ID NO:117)：SJ11187=7±12

D.pSJ10778(含有adc_Lp；SEQ ID NO:119)：SJ11189=5±9

在植物乳杆菌中的醇脱氢酶表达和活性。

如前所述通过电穿孔将质粒pSJ10745导入植物乳杆菌SJ10511(与SJ10656相同)，且载体的红霉素抗性基因的存在通过用引物663783和663784(见上文)的PCR扩增来确认。将两个转化体作为SJ10784和SJ10785保存。

同样，将质粒pSJ10768和pSJ10769导入SJ10656，分别得到SJ10883和SJ10898，将质粒pSJ10782和pSJ10783导入SJ10656，分别得到SJ10884和SJ10885，和将质粒pSJ10762和pSJ10765导入SJ10656，分别得到SJ10896和SJ10897。在所有情况下，红霉素抗性基因的存在通过PCR扩增确认。

使用下述8个菌株验证醇脱氢酶表达：

SJ10883和SJ10898,两者均含有编码SEQ ID NO:47的Lactobacillusantri醇脱氢酶的基因。

SJ10896和SJ10897,两者均含有编码SEQ ID NO:122的发酵乳杆菌醇脱氢酶的pSJ10756。

SJ10784和SJ10785,两者均含有编码SEQ ID NO:24的产乙醇热厌氧杆菌醇脱氢酶的基因。

SJ10884和SJ10885,两者均含有编码SEQ ID NO:21的拜氏梭菌醇脱氢酶的基因。

将这些菌株在含有10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养中繁殖1日(2ml Eppendorf试管中的1.5ml培养体积)，并将培养物汇集，并通过离心收获细胞。将细胞悬于1/3初始体积的缓冲液(0.1M Tris pH7.5，2mM DTT)，并通过用玻璃球的处理来机械破坏，所述处理为以500微升等分试样在1.5ml Eppendorf试管中，在”Bead Beater”(FastPrep FP120，BIO101Savant)中以4.0m/s的设置进行5个循环，每循环40秒，其中在循环之间在冰上冷却。通过离心去除细胞碎片，并使用上清进行酶活性分析。

将汇集的样品用于如前所述通过质谱法进行蛋白分析，且在鉴定出的160个蛋白中，拜氏梭菌乙酰乙酸醇脱氢酶鉴定为具有0.09的emPAI值。

如下所述对相同的汇集样品分析其异丙醇脱氢酶活性：

异丙醇脱氢酶活性通过在微滴定板的孔中混合50μl200mM丙酮，50μl400μM NADPH(Sigma N1630)，50μl缓冲液(100mM磷酸钾，pH7.2)和50μl汇集的细胞裂解液(用MilliQ水稀释1-20x)来测量。NADPH的小时通过在读板器(Molecular Devices,SpectraMax Plus)中在340nm每20秒进行测量吸光度持续20分钟来监控。异丙醇脱氢酶活性根据起始斜率使用下述方程来计算：活性=斜率样品*稀释系数。在所述样品中，发现了10.4±0.8的活性。

在路氏乳杆菌中的醇脱氢酶表达和活性。

制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述用包含编码选定的醇脱氢酶的多核苷酸的质粒来转化。下述质粒导致所示的转化体，将其在含10微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上选择，在厌氧室中在37℃温育。

pSJ10768(含有sadh_La；SEQ ID NO:46)：SJ11191

pSJ10762(含有sadh_Lf)：SEQ ID NO:121：SJ11201

pSJ10766(含有sadh_Lf；SEQ ID NO:121)：SJ11193

pSJ10782(含有adh_Cb；SEQ ID NO:20)：SJ11195

来自拜氏梭菌的脱氢酶检测为具有0.12的相对emPAI值，来自发酵乳杆菌的醇脱氢酶检测为具有0.04的相对emPAI值，而来自Lactobacillus antri的醇脱氢酶检测为具有0.04的相对emPAI值。

A.pSJ10768(含有sadh_La；SEQ ID NO:46)：SJ11191=5±2

B.pSJ10762(含有sadh_Lf)：SEQ ID NO:121：SJ11201=1±1

C.pSJ10766(含有sadh_Lf；SEQ ID NO:121)：SJ11193=1900

D.pSJ10782(含有adh_Cb；SEQ ID NO:20)：SJ11195=3±4

实施例17：用植物乳杆菌醇脱氢酶表达菌株从丙酮产生异丙醇

将携带含有醇脱氢酶基因的表达载体的菌株，以及携带“空“表达载体的菌株(SJ10678)在含10微克/ml红霉素的MRS培养基中，在37℃在静止培养(2ml Eppendorf试管中的1.5ml培养体积)繁殖一式两次，其中在一组培养中的培养基已补充丙酮(大约100微升丙酮/升)。在温育1日之后，通过离心收获了100微升的上清。在总共温育4日之后，又收获了100微升上清，并如本文中所述对样品分析其丙酮和异丙醇含量。结果示于表9.构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表9.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

丙酮添加增加了对于表达来自Lactobacillus antri、来自残余物和来自拜氏梭菌的醇脱氢酶的菌株测得的异丙醇浓度。在所有发酵中，检测出少量丙酮。在这些测试条件下对照菌株SJ10678，以及含有发酵乳杆菌构建体的菌株不产生异丙醇。

实施例18：在植物乳杆菌醇脱氢酶表达菌株中不同丙酮浓度对异丙醇产生的作用

将菌株SJ10898，SJ10785和SJ10885与对照菌株SJ10678一同在具有不同水平的补充的丙酮的培养基中进行发酵。将菌株从冻结的菌株收集小瓶接种入在2ml Eppendorf试管中的含有10微克/ml红霉素的1.8ml MRS，并将其在无振荡下在37℃温育过夜。使用来自这些培养物的50微升以接种含有10微克/ml红霉素和所示的丙酮水平的1.8ml MRS培养基。在如上所述发酵1和4日之后，收获了100微升上清以供分析丙酮和2-丙醇含量。结果示于表10。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表10

“nd”意指未检测出。

对于三种醇脱氢酶表达菌株观察到显著的丙酮至异丙醇的转化，而用对照菌株SJ10678未检测出异丙醇。

实施例19：在来自乳杆菌诱导性异丙醇操纵子构建体的大肠杆菌中的异丙醇产生

由肽诱导性乳杆菌属启动子系统调控的异丙醇操纵子如上所述，其中质粒构建于大肠杆菌中。对于这些大肠杆菌菌株通过如上所述在LB+100微克/ml红霉素+1%葡萄糖(含或不含添加的诱导肽)中，在37℃以300rpm振荡下发酵1日来测试异丙醇产生。将菌株从冻结的储备培养物直接接种如发酵培养基(在试管中10ml)。结果示于表11A。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表11A.

“nd”意指未检测出。

在来自所有测试的异丙醇操纵子的构建体的大肠杆菌中观察到显著的异丙醇产生。

实施例20：来自补充丙酮和/或1,2丙二醇的路氏乳杆菌醇脱氢酶表达菌株的异丙醇产生。

制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述将其用包含编码选定的醇脱氢酶的多核苷酸的质粒来转化。下述质粒导致所示的转化体，对其通过提取的质粒的限制性分析来验证。

pSJ10600：SJ11011和SJ11012

pSJ10765：SJ11013和SJ11014

pSJ10769：SJ11015和SJ11016

pSJ10783：SJ11024

pSJ10745：SJ11053和SJ11054

转化体在含10微克/ml红霉素的LCM琼脂平板上选择，其在37℃在厌氧室中温育。

在另一个实验中，制备了路氏乳杆菌SJ10655的电感受态细胞，并如前所述进行转化。下述质粒得到所示的转化体，对其通过提取的质粒的限制性分析来验证。

保存了下述菌株：

pSJ10768：SJ11191和SJ11192：

pSJ10766：SJ11193和SJ11194

pSJ10782：SJ11195和SJ11196

pSJ10762：SJ11201和SJ11202

将选定的路氏乳杆菌转化体从冻结的储备培养物直接接种入补充红霉素(10微克/ml)和丙酮(5ml/l)的2ml MRS培养基，并将试管在37℃在无振荡下温育3日。收获了上清，并如上所述分析其1-丙醇、2-丙醇和丙酮含量。结果示于表11B。

表11B.

在另一个实验中，将菌株SJ11024，SJ11053和SJ11054接种于含有10微克/ml红霉素的MRS培养基，并在37℃温育过夜。使用这些培养物以接种含有含10微克/ml红霉素，如下表所示补充丙酮和/或1,2-丙二醇的MRS培养基的2ml Eppendorf试管，并在37℃在无振荡下温育两日。然后如本文中所述分析1ml上清样品，结果示于表11C，11D，11E和11F，其分别针对正丙醇，异丙醇，丙酮和1,2-丙二醇含量。

表11C

“nd”意指未检测出。

表11D

“nd”意指未检测出。

表11E

表11F

“nd”意指未检测出。

实施例21：用路氏乳杆菌表达菌株的异丙醇产生。

将路氏乳杆菌SJ11044用选定的重组质粒通过电穿孔使用如前所述的实验方案来转化。将选定的转化菌株(以及来自制备物的其它转化菌落，示为-B，-C，-D等)接种(从平板上的菌落)如含有含10微克/ml红霉素的MRS培养基的2ml Eppendorf试管，并在37℃在无振荡下温育过夜。然后对0.5ml上清如本文中所述分析其丙酮和异丙醇含量。结果示于表12A。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表12A

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

将四种不同的路氏乳杆菌菌株，以及未接种的培养基的对照样品，在37℃在2ml静止培养中在多种不同培养基中温育2日。然后对样品如本文中所述分析其丙酮，正丙醇和异丙醇含量。结果示于表12B。构建体表示为上述实施例中所示的缩写。

表12B

实施例22：在甘蔗汁中用路氏乳杆菌表达菌株的异丙醇产生

将菌株SJ11278在含有酵母提取物(10g/l)，Tween80(1g/l)，MnSO4·H2O(50mg/l)和红霉素的甘蔗汁培养基(BRIX=5)中繁殖。将培养物在37℃温育一日。

将50mL的上述培养物用于接种含有具有下述组成的1950mL培养基的发酵罐：甘蔗汁(调整至BRIX10)；Pluronic/Dowfax63N，1mL/L；Bacto酵母提取物，10g/L；Tween80，1g/L；MnSO₄，H₂O，25mg/L；植酸，650mg/L；红霉素，4mL的乙醇中的5mg/mL溶液。

将发酵用氮(0.1L/min)鼓泡，并以400rpm的速率搅拌。将温度和pH分别维持恒定在37℃和pH6.5。

在发酵三日之后，发现异丙醇浓度为0.3mL/L。未在用生长在相同条件下(但不添加红霉素)的未转化的宿主菌株进行的对照实验(发酵ID：GPP099)中检测出异丙醇。在相同时点的正丙醇浓度对于用SJ11278和对照菌株的发酵分别测量为0.07mL/L和0.08mL/L。

对在发酵3日之后获得的SJ11278培养物分析其污染，并发现用SJ11278的发酵受植物乳杆菌污染。随后重新测试了接种物并发现其为路氏乳杆菌，菌株SJ1127。若该培养物未经污染，则可想到会获得更高效价的异丙醇。

实施例23：路氏乳杆菌中的正丙醇耐受

在下文中所述的条件下显示路氏乳杆菌对正丙醇具有抗性。

为了制备用于罐发酵的接种物，如上所述进行了路氏乳杆菌的菌株的预培养。使用50mL的该培养物以接种含有如下所述制备的培养基的发酵罐：

培养基组成：将用自来水调整至最终BRIX为5的浓缩的甘蔗汁(BRIX53)用作基本组分。向该稀释的甘蔗汁以10g/L的量添加酵母提取物(Bacto)，并以1mL/L的量添加抑泡剂(Pluronic/Dowfax63N)。将该混合物转移至实验室尺度的发酵罐(3升容器)并在121-123℃高压灭菌30分钟。在高压灭菌之后，将温度调整至37℃，并将80mL(对应于40ml/L)正丙醇通过灭菌过滤添加至罐。

在接种之后，将温度保持在约37℃，并将pH维持在pH6.5或pH3.8(例如通过添加10%(w/w)NH₄OH)。小的N₂流入(0.1升每分钟)确保在以400rpm搅拌过程中培养物为厌氧的。在整个发酵过程中进行OD₆₅₀测量以监控细胞生长。

路氏乳杆菌能够在4%正丙醇中在pH6.5和pH3.8两者下生长。在pH3.8，生长速率有些延迟，但在约40小时的发酵之后取得了相同的最大OD。对于在发酵112小时之后所取的发酵样品的基于气相色谱-质谱法(GCMS)的分析显示对于正丙醇的起始量，pH6.5和pH3.8分别含有79.8%和93.1%。确定了用于该实验的正丙醇起初除了96%正丙醇之外还含有4%异丙醇。

实施例24：在野生型(wt)路氏乳杆菌中产生的正丙醇

显示野生型路氏乳杆菌O4ZXV在下文所述条件下产生正丙醇。

将对于罐发酵的野生型路氏乳杆菌O4ZXV的预培养物在无通气或振荡下在MRS培养基中在37℃生长两日。使用50mL的该培养物的样品接种含有1950mL的下述培养基的发酵罐：

培养基组成：将用自来水调整至最终BRIX为5的浓缩的甘蔗汁(BRIX53)用作基本组分。向该稀释的甘蔗汁以10g/L的量添加酵母提取物(Bacto)，并以1mL/L的量添加抑泡剂(Pluronic/Dowfax63N)。将该混合物转移至实验室尺度的发酵罐(3升容器)并在121-123℃高压灭菌30分钟。

在接种之后，将pH通过添加10%(w/w)NH₄OH保持恒定在6.5，并将温度保持在37℃。将培养物通过小的泵入N₂(0.1升每分钟)流保持为厌氧，且搅拌速率为400rpm。

在对发酵48小时之后所取的发酵样品进行的基于气相色谱-质谱法(GCMS)的分析表明培养物含有大约40μL/L正丙醇。

在用如上所述的相同菌株和在相同条件(但pH维持恒定在pH3.8而非pH6.5)下进行的另一个实验中，在发酵48小时之后所取的样品显示培养物含有大约40μL/L正丙醇。

实施例25：正丙醇醛脱氢酶基因的克隆。

费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP P syn2)的克隆和载体pTRGU30的构建。

优化了在费氏丙酸杆菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1500bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU30。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为NotI–BamHI–RBS–CDS–XbaI–HindIII，得到了pTRGU30。

所述费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:25、26和27。编码序列为1503bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为500个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于该程序，预测的成熟蛋白含有500个氨基酸，具有53.7kDa的预测分子量和6.39的等电点pH。

丘状菌落乳杆菌醛脱氢酶基因(pduP Lc)的克隆和pTRGU31的构建载体。

优化了在丘状菌落乳杆菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1443bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU31。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为PacI-NotI–RBS–CDS–HindIII-AscI，得到了pTRGU31。

所述丘状菌落乳杆菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:28、29和30。编码序列为1446bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为481个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有481个氨基酸，具有51.2kDa的预测分子量和5.24的等电点pH。

拜氏梭菌醛脱氢酶基因(pduP Cb)的克隆和载体pTRGU85的构建。

优化了在拜氏梭菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1404bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU85。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

所述费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:31、32和33。编码序列为1407bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为468个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有468个氨基酸，具有51.3kDa的预测分子量和5.88的等电点pH。

费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP_Pf_syn2a)的克隆和载体pTRGU300的构建。

在pduP_Pf_syn2中检测出两个潜在的起始密码子：一个施于pduP_Pf_syn2核苷酸序列的末端，而第二个位于最初的起始密码子下游93bp。应用该第二个起始密码子得到在费氏丙酸杆菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1407bp编码序列。除了最初93bp之外，该序列与上述应用的序列相同，并因此进行优化以供在大肠杆菌中表达。将该序列人工构建入pTRGU300。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为PacI-NotI–BamHI–RBS–CDS–XbaI–HindIII-AscI，得到了pTRGU300。

所述费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:48、49和51。编码序列为1410bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为469个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有469个氨基酸，具有50.1kDa的预测分子量和5.69的等电点pH。

费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP_Pf_syn2b)的克隆和pTRGU399的构建载体。

如上所述的pduP_Pf_syn2a的克隆表明该基因潜在地具有可降低体内转录效率的第二结构。因此，重新优化了在费氏丙酸杆菌中鉴定出的相同醛脱氢酶基因的1407bp编码序列以供在大肠杆菌中表达以改变DNA序列而维持该蛋白的氨基酸序列。将重新优化的序列人工构建入pTRGU399。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为PacI–NotI–BamHI–RBS–CDS–XbaI–HindIII–AscI，得到了pTRGU399。

所述费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因的第二密码子优化的核苷酸序列(CO)列为SEQ ID NO:50。编码序列为1410bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白与上述序列相同(SEQ ID NO:51)。

R.palustris醛脱氢酶基因(pduP Rp)的克隆和载体pTRGU344的构建。

优化了在R.palustris中鉴定出的醛脱氢酶基因的1392bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU344。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为EcoRI–PacI–RBS–CDS–SbfI–HindIII–XbaI，得到了pTRGU85。

所述R.palustris醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:52、53和54。编码序列为1395bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为464个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有464个氨基酸，具有49.3kDa的预测分子量和5.98的等电点pH。

荚膜红细菌醛脱氢酶基因(pduP Rc)的克隆和载体pTRGU346的构建。

优化了在荚膜红细菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1599bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU346。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为EcoRI–PacI–RBS–CDS–SbfI–HindIII–XbaI，得到了pTRGU346。

所述荚膜红细菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:55、56和57。编码序列为1602bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为533个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有533个氨基酸，具有55.9kDa的预测分子量和6.32的等电点pH。

深红红螺菌醛脱氢酶基因(pduP Rr)的克隆和载体pTRGU348的构建。

优化了在深红红螺菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1590bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU348。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为EcoRI–PacI–RBS–CDS–SbfI–HindIII–XbaI，得到了pTRGU348。

所述深红红螺菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:58、59和60。编码序列为1593bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为530个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有498个氨基酸，具有52.3kDa的预测分子量和6.06的等电点pH。

霍氏真杆菌醛脱氢酶基因(pduP Eh)的克隆和载体pTRGU361的构建。

优化了在霍氏真杆菌中鉴定出的醛脱氢酶基因的1404bp编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU360。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

所述霍氏真杆菌醛脱氢酶基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列分别列为SEQ ID NO:61、62和63。编码序列为1407bp，包含终止密码子，且编码的预测蛋白为468个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，未在该序列中预测出信号肽。基于Vector NTI(Invitrogen，Paisley，UK)分析，预测的成熟蛋白含有533个氨基酸，具有50.9kDa的预测分子量和5.79的等电点pH。

实施例26：含有用于正丙醇产生的醛脱氢酶的途径构建体的构建和转化。

表达费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP Pf syn2)的pTRGU44的构建和转化。

含有所述醛脱氢酶基因的1536bp片段从pTRGU30(实施例15)使用下示的引物P0017和P0021扩增。

引物P0017：

5’-ATCCTCTAGAGAAGGAGATATACCATGCGT-3’(SEQ ID NO:96)

引物P0021：

5’-TGCAAGCTTTTAGCGGATATTCAGGCCAC-3’(SEQ ID NO:97)

对于该PCR反应，使用PhusionHot Start DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)，且扩增反应程序为：29个循环，每循环在95℃进行2分钟；95℃进行30秒，55℃进行1分钟，72℃进行1分钟；然后一个循环在72℃进行5分钟。将所得的PCR产物用PCR Purification Kit(Qiagen)根据生产商的指示纯化。接着，将PCR产物和pTrc99A(E.Amann和J.Brosius，1985，Gene40(2-3)，183-190)用XbaI(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA，USA)和HindIII(NEB)在37℃消化过夜(限制性位点在上述引物中以下划线标出)。将酶在65℃热灭活20分钟，并将pTrc99A反应混合物在37℃用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)去磷酸30分钟。将消化的pTrc99A和PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化。

将消化的PCR产物在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)与pTrc99A的4152bp片段连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU44接种于含200μg/mL青霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU44使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受DNA测序以确认所述醛脱氢酶基因整合入载体。来自液体过夜培养、含有pTRGU44的大肠杆菌TRGU44在-80℃储藏于30%甘油。

表达丘状菌落乳杆菌醛脱氢酶基因(pduP Lc)的pTRGU42的构建和转化。

含有所述醛脱氢酶基因的1479bp片段从pTRGU31使用下示的引物P0013和P0019扩增。

引物P0013：

5’-ATCCTCTAGAGAAGGAGATATACCATGGCC-3’(SEQ ID NO:98)

引物P0019：

5’-TGCAAGCTTTTAGACCTCCCAGGAACGCA-3’(SEQ ID NO:99)

对于该PCR反应，使用Phusion

Hot Start DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)，且扩增反应程序为：29个循环，每循环在95℃进行2分钟；95℃进行30秒，55℃进行1分钟，72℃进行1分钟；然后一个循环在72℃进行5分钟。将所得的PCR产物用PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化。接着，将PCR产物和pTrc99A(E.Amann和J.Brosius，1985，Gene40(2-3)，183-190)用XbaI(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA，USA)和HindIII(NEB)在37℃消化过夜(限制性位点在上述引物中以下划线标出)。将酶在65℃热灭活20分钟，并将pTrc99A反应混合物在37℃用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)去磷酸30分钟。将消化的pTrc99A和PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化。

将消化的PCR产物在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)与pTrc99A的4152bp片段连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU42接种于含200μg/mL青霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU42使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受DNA测序以确认所述醛脱氢酶基因整合入载体。来自液体过夜培养、含有pTRGU42的大肠杆菌TRGU42在-80℃储藏于30%甘油。

表达拜氏梭菌醛脱氢酶基因(pduP Cb)的pTRGU91的构建和转化。

含有所述醛脱氢酶基因的1440bp片段从pTRGU85使用下示的引物P0015和P0020扩增。

引物P0015：

5’-ATCCTCTAGAGAAGGAGATATACCATGAAT-3’(SEQ ID NO:100)

引物P0020：

5’-TGCAAGCTTTTAGCCCGCCAGCACGCAAC-3’(SEQ ID NO:101)

对于该PCR反应，使用Phusion

将消化的PCR产物在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)与pTrc99A的4152bp片段连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含200μg/mL氨苄青霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU91接种于含200μg/mL青霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU91使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受DNA测序以确认所述醛脱氢酶基因整合入载体。来自液体过夜培养、含有pTRGU91的大肠杆菌TRGU91在-80℃储藏于30%甘油。

表达费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP Pf syn2a)的pTRGU531的构建和转化。

将基因pduP_Pf_syn2a使用pTRGU300中的侧翼位点BamHI和XbaI克隆入载体pTRGU88。将pTRGU88和pTRGU300两者使用20μl载体，5μl NEB2缓冲液，2μl XbaI，2μl BamHI，0.5μl BSA和20μl H₂O进行消化。将pTRGU88和pTRGU300两者在37℃消化过夜。将酶在65℃热灭活20分钟，并将pTRGU88反应混合物在37℃用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)去磷酸30分钟。将经消化的pTRGU88和pTRGU300在1%琼脂糖凝胶上运行，接着使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化预期大小(pTRGU88：4518bp；pTRGU300：1430bp)的条带

将分离的DNA片段在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU304接种于含10μg/mL卡那霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU304使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受用BamHI和XbaI的限制性分析，得到条带BamHI–XbaI：1430bp和XbaI–BamHI：4518bp，其确认了该基因在pTRGU88中的正确插入。来自液体过夜培养、含有pTRGU304的大肠杆菌TRGU304在-80℃储藏于30%甘油。

将质粒pTRGU304使用标准的电穿孔技术转化入大肠杆菌MG1655。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU531接种于含10μg/mL卡那霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU531使用Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受用BamHI和XbaI的限制性分析，得到条带BamHI–XbaI：1430bp和XbaI–BamHI：4518bp，其确认了该基因在pTRGU88中的正确插入。来自液体过夜培养、含有pTRGU304的大肠杆菌TRGU304在-80℃储藏于30%甘油。

表达费氏丙酸杆菌醛脱氢酶基因(pduP Pf syn2b)的pTRGU551的构建和转化。

将基因pduP_Pf_syn2b使用pTRGU399中的侧翼位点EcoRI和XbaI克隆入载体pTRGU88。将pTRGU88和pTRGU399两者使用20μl载体，5μl NEB2缓冲液，2μl XbaI，2μl EcoRI，0.5μl BSA和20μl H₂O进行消化。将pTRGU88和pTRGU399两者在37℃消化过夜。将酶在65℃热灭活20分钟，并将pTRGU88反应混合物在37℃用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)去磷酸30分钟。将经消化的pTRGU88和pTRGU399在1%琼脂糖凝胶上运行，接着使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化预期大小(pTRGU88：4497bp；pTRGU399：1452bp)的条带

将分离的DNA片段在16℃使用含有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel Switzerland)连接过夜。将该连接混合物的1μL等分试样通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU541接种于含20μg/mL氨苄青霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU541使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受用EcoRI和XbaI的限制性分析，得到条带EcoRI–XbaI：1452bp和XbaI–EcoRI：4497bp，其确认了该基因在pTRGU88中的正确插入。来自液体过夜培养、含有pTRGU541的大肠杆菌TRGU541在-80℃储藏于30%甘油。

将质粒pTRGU541使用标准的电穿孔技术转化入大肠杆菌MG1655。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU551接种于含10μg/mL卡那霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU551使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离并接受用EcoRI和XbaI的限制性分析，得到条带EcoRI–XbaI：1452bp和XbaI–EcoRI：4497bp，其确认了该基因在pTRGU88中的正确插入。来自液体过夜培养、含有pTRGU551的大肠杆菌TRGU551在-80℃储藏于30%甘油。

表达R.palustris醛脱氢酶基因(pduP Rp)的pTRGU543的构建和转化。

基本上如上所述将基因pduP_Rp克隆入pTRGU88。含有基因的EcoRI–XbaI片段从载体pTRGU344切出，并通过分离1437bp DNA条带从琼脂糖凝胶纯化。将大肠杆菌TOP10用pTRGU88和pduP_Rp的连接混合物成功转化，且一个菌落，TRGU533，含有正确插入pTRGU88的基因。分离相应质粒pTRGU533，并将其转化入大肠杆菌MG1655。一个转化体，TRGU543，如通过限制性分析验证含有正确质粒，并在-80℃储藏于30%甘油。

表达荚膜红细菌醛脱氢酶基因(pduP Rc)的pTRGU545的构建和转化。

基本上如上所述将基因pduP_Rc克隆入pTRGU88。含有基因的EcoRI–XbaI片段从载体pTRGU346切出，并通过分离1644bp DNA条带从琼脂糖凝胶纯化。将大肠杆菌TOP10用pTRGU88和pduP_Rc的连接混合物成功转化，且一个菌落，TRGU535，含有正确插入pTRGU88的基因。分离相应质粒pTRGU535，并将其转化入大肠杆菌MG1655。一个转化体，TRGU545，如通过限制性分析验证含有正确质粒，并在-80℃储藏于30%甘油。

表达深红红螺菌醛脱氢酶基因(pduP Rr)的pTRGU547的构建和转化。

基本上如上所述将基因pduP_Rr克隆入pTRGU88。含有基因的EcoRI–XbaI片段从载体pTRGU348切出，并通过分离1635bp DNA条带从琼脂糖凝胶纯化。将大肠杆菌TOP10用pTRGU88和pduP_Rr的连接混合物成功转化，且一个菌落，TRGU537，含有正确插入pTRGU88的基因。分离相应质粒pTRGU537，并将其转化入大肠杆菌MG1655。一个转化体，TRGU547，如通过限制性分析验证含有正确质粒，并在-80℃储藏于30%甘油。

表达霍氏真杆菌醛脱氢酶基因(pduP Eh)的pTRGU549的构建和转化。

基本上如上所述将基因pduP_Eh克隆入pTRGU88。含有基因的EcoRI–XbaI片段从载体pTRGU361切出，并通过分离1449bp DNA条带从琼脂糖凝胶纯化。将大肠杆菌TOP10用pTRGU88和pduP_Eh的连接混合物成功转化，且一个菌落，TRGU539，含有正确插入pTRGU88的基因。分离相应质粒pTRGU539，并将其转化入大肠杆菌MG1655。一个转化体，TRGU549，如通过限制性分析验证含有正确质粒，并在-80℃储藏于30%甘油。

实施例27：在含有异源醛脱氢酶的重组大肠杆菌TOP10中正丙醇的产生

将大肠杆菌菌株Trc99A(阴性对照)和TRGU44，TRGU42和TRGU91在含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-beta-thio galactopyranoside，IPTG)的10mL LB培养基中在振荡下(250rpm)生长过夜。在过夜温育之后移取每种菌株的0.5mL样品。将每个样品使用桌上离心机以15000x g离心1分钟，并弃去上清。将大肠杆菌Trc99A和大肠杆菌TRGU44，TRGU42，和TRGU91的细胞重悬于补充亮氨酸(1mM)的0.5mL基本培养基(MM)，将其用于接种对于每个样品的一个新的10mL培养物。将培养物在37℃在振荡下(250rpm)温育72小时。在温育终止时移取2mL样品，并接着如本文中所述用对于丙酮、正丙醇和异丙醇的标样通过气相色谱进行分析。

如表13中所示，正丙醇由大肠杆菌TRGU44但非Trc99A(阴性对照)、TRGU42和TRGU91以显著量产生。

表13.

“nd”意指未检测出

实施例28：在含有异源醛脱氢酶的重组大肠杆菌MG1655中的正丙醇产生

将大肠杆菌菌株TRGU269(阴性对照)，TRGU531，TRGU551，TRGU543，TRGU545，TRGU547，TRGU549在振荡下(250rpm)在含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的10mL LB培养基中生长过夜。在过夜温育之后，测量了OD，并移取了对应于2ml的OD(600nm)=1的体积(均在1.39ml至2.95ml)。将每个样品使用桌上离心机以5000x g离心5分钟，并弃去上清。将TRGU269(阴性对照)，TRGU531，TRGU551，TRGU543，TRGU545，TRGU547，TRGU549的细胞重悬于补充1μM腺苷基钴胺素(维生素B12)的0.5mL基本培养基(MM)，将其用于接种对于每个样品的一个新的10mL培养物。将培养物在37℃在振荡下(250rpm)温育116小时。在温育20小时、44小时和116小时之后移取2mL样品，并接着如本文中所述用对于正丙醇和丙二醛的标样通过气相色谱进行分析。发酵液中的丙酮，1-丙醇和异丙醇可通过GC-FID检测。样品用甲醇中的0.05%四氢呋喃1+1稀释，并如上所述进行分析。

如表14中所示，正丙醇由大肠杆菌TRGU551，TRGU543，TRGU545，TRGU547，和TRGU549但非TRGU269(阴性对照)或大肠杆菌TRGU531以显著量产生。由于pduP_Pf_syn2a和pduP_Pf_syn2b编码相同的酶但核苷酸序列不同，在这里检测出针对正丙醇产生的差异看来是由这两个基因的转录概貌(profile)中的差异导致的。

表14

“nd”意指未检测出.”0.000”意指检测出该化合物。

实施例29：费氏丙酸杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶小亚基基因(mutA)和大亚基基因(mutB)，激酶ArgK基因(argK)，和甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶基因(mme)的克隆和载体pTRGU320(mutA)，pTRGU322(mutB)，pTRGU324(argK)，和pTRGU350(mme)的构建。

优化了mutA，mutB，argK，和mme的野生型序列的编码序列以供在大肠杆菌中表达，并人工构建入pTRGU320(mutA)，pTRGU322(mutB)，pTRGU324(argK)，和pTRGU350(mme)。含有密码子优化的编码序列的DNA片段设计为核糖体结合位点(RBS，序列5’-GAAGGAGATATACC-3’)紧接在起始密码子之前。

然后将所得的序列发送至Geneart AG(Regenburg，Germany)并由其合成，且在含有β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体中递送。当合成时，所述编码序列和RBS序列两侧为限制性位点以便于后续的克隆步骤。克隆入pMA载体的整个人工片段为如表15中列出的EcoRI–RBS–CDS1–BamHI–HindIII–XbaI for mutA，得到了pTRGU320。类似地，mutB两侧为EcoRI，BamHI和NotI，HindIII，XbaI，其允许将mutA和mutB连续克隆入一个操纵子，其中编码序列由BamHI限制性位点和所述RBS分隔。所有剩余人工优化的基因的野生型核苷酸序列(WT)，密码子优化的核苷酸序列(CO)，和推导的氨基酸序列的SED IQ编号亦列于表15。

表15.

实施例30：大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶基因(sbm)，大肠杆菌蛋白激酶基因(ygfD)，大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶基因(ydgG)的克隆，和多种正丙醇途径基因组合的构建

将大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA变位酶(sbm)基因，大肠杆菌蛋白激酶基因(ygfD)，和大肠杆菌甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶基因(ydgG)从大肠杆菌基因组扩增，并用PCR组入用如表16中列出的限制性位点，RBS和终止密码子。此外，pTRGU300(见上文)中的基因pduP_Pf_syn2a合成为不具有必需的限制性位点，并因此从pTRGU300扩增为具有如下所述的正确限制性位点。

表17.

下述引物用于PCR反应：

sbm的克隆

EcoRI–RBS–sbm–BamHI–NotI–HindIII–XbaI

引物P217(SEQ ID NO:104)：

5’-CACCgaattcAAGAAGGAGATATACCatgtctaacgtgcaggagtggcaac-3’

引物P218(SEQ ID NO:105)：

5’-CTAGtctagaaagcttgcggccgcggatccTTAATCATGATGCTGGCTTATCAGA-3’

ygfD的克隆

EcoRI–NotI–RBS–CDS3–AscI-FseI–HindIII–XbaI

引物P219(SEQ ID NO:106)：

5’-CACCg aattc gcggc cgcAA GAAGG AGATA TACCa tgatt aatga agccacgctg gcag-3’

引物P220(SEQ ID NO:107)：

5’-CTAGtctagaaagcttggccggccggcgcgccTTAATCAAAATATTGCGTCTGGATA-3’

ygfG的克隆

EcoRI–AscI–FseI–RBS–CDS5–PacI–HindIII–XbaI

当克隆入不含mme的途径时为AscI和XbaI；当克隆入含mme的途径时为FseI和XbaI。

引物P229(SEQ ID NO:108)

5’-CACCg aattc GGCGC GCCgg ccggc cAAGA AGGAG ATATA CCatgtctta tcagt atgtt aacgt tg-3’

引物P222(SEQ ID NO:109)：

5’-CTAGtctagaaagcttttaattaaCTAATGACCAACGAAATTAGGTTTA-3’

pduP_syn2a的克隆

EcoRI–PacI–RBS–CDS6–SbfI–HindIII–XbaI

引物P223(SEQ ID NO:110)：

5’-CACCgaattcttaattaaAAGGAGATATACCatgaccatca-3’

引物P224(SEQ ID NO:111)：

5’-CTAGtctagaaagcttcctgcaggTTAGCGGATATTCAGGCCACTCTTT-3’

PCR反应使用Phusion

Hot Start DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)进行，所得的PCR产物用PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化。接着，将每个PCR产物和克隆载体在37℃用表18中列出的限制性酶消化过夜。将酶在65℃热灭活20分钟，并将克隆载体反应混合物在37℃用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NEB)去磷酸30分钟。将消化的载体和PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的指示纯化。

通过3片段连接将sbm和ygfD或argK插入pTRGU187。扩增sbm，即30个循环，酶循环在96℃进行2分钟；96℃进行30秒，58℃进行30秒，72℃进行1分钟10秒；然后一个循环在72℃进行5分钟。扩增ygfD，即30个循环，每循环在96℃进行2分钟；96℃进行30秒，55℃进行30秒，72℃进行40秒；然后一个循环在72℃进行5分钟。PCR纯化，对于sbm用EcoRI和NotI的消化和对于ygfD用NotI和XbaI的消化基本上如本文中所述进行。用EcoRI和XbaI消化的pTRGU187，用EcoRI和NotI消化的sbm，和用NotI和XbaI消化的ygfD的3片段连接基本上如本文中所述进行，在该反应中存在一个其它DNA片段。将连接混合物的1μL等分试样通过化学转化转化入大肠杆菌TOP10。将转化体铺板于含有20μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃温育过夜。然后将选定的菌落在含20μg/mL卡那霉素的LB平板上划线。将一个菌落，大肠杆菌TRGU367接种于含10μg/mL卡那霉素的液体TY肉汤培养基并在37℃温育过夜。对应的质粒pTRGU367使用

Spin MiniprepKit(Qiagen)分离并接受DNA测序以确认sbm和ygfD基因正确地整合入载体。将来自液体过夜培养、含有pTRGU367的大肠杆菌TRGU367在-80℃储藏于30%甘油。所有正丙醇生物合成途径的克隆遵循基本上相同的步骤。对于克隆整个正丙醇生物合成基因途径应用的限制性酶和DNA片段概述于下表18。

表18

正丙醇生物合成基因的转化体TRGU362-517列于表19。对应的质粒pTRGU362-517使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离和并接受DNA测序以在PCR产物已克隆的情况下确认克隆的基因没有错误地整合入载体。来自液体过夜培养、含有pTRGU362-517的大肠杆菌TRGU362-517在-80℃储藏于30%甘油。

表19

实施例31：在含有多种异源正丙醇途径基因组合的重组大肠杆菌TOP10中的正丙醇的产生

将携带列于表19(见上文)中的质粒的大肠杆菌TOP10菌株在37℃在振荡下(250rpm)在含有10μg/ml卡那霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷的10ml MM中各自生长过夜。开始，培养来自表19的TRGU409–TRGU468，接着将剩余菌株在基本上相同的条件下在另一个实验中培养。

在第一个培养实验中,在17和41小时之后取来自每份培养基的2ml样品，且选定的菌株亦在65小时之后取样。如上所述使用气相色谱分析每个样品。由每个菌株产生的丙醇效价列于表20。

表20

表20中获得的结果显示如期待，携带孔载体的TRGU187不产生丙醇。此外，当正丙醇生物合成途径的最初3个基因在大肠杆菌中表达时，检测出少量1-丙醇。这表明大肠杆菌能够缓慢地用天然的醛脱氢酶和醇脱氢酶将丙酰CoA还原为正丙醇。然而，醛脱氢酶pduP_Rp，pduP_Rc，pduP_Rr和pduP_Eh的表达使丙醇产生增加数倍。

来自表19(见上文)的剩余菌株的培养如上所述进行，且结果列于表21。

表21

所有在大肠杆菌TOP10表达正丙醇生物合成基因的构建体(表21)导致正丙醇的产生。

实施例32：使用对分离自实施例31的样品的凝胶内消化(in-gel digest)和LC-MS/MS分析的半定量分析

在每个所示时间点对来自实施例31的培养物进行取样。将样品以5000xg离心5min，弃去上清，并将细胞冻结于-20℃。使用质谱法分析选定的样品，并根据下述步骤确定鉴定出的蛋白的相对水平：

A.还原和烷基化

将每个50μL样品与20μl NuPage LDS样品缓冲液(产品号NP0007)，4μl1M DTT混合，并在95℃温育10min。然后允许样品冷却，接着添加6μl0.5M Tris-HCl pH9.2中的1M碘乙酰胺。将样品在室温避光温育20min。

B.电泳

对每个样品在NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶(产品号NP0321)中使用NuPAGE MES SDS Running缓冲液(产品号NP0002)根据生产商的推荐进行SDS-PAGE。将凝胶使用expedeon InstantBlue^TM(产品号ISB01L)根据生产商的推荐染色。

C.凝胶内消化和肽提取

将来自每条泳道的6-8条条带切出，并将每个切片转移至96孔板的不同位置。将凝胶切片用150μl50%乙醇/50mM NH₄HCO₃洗涤x230分钟，接着通过添加100μl丙腈使其收缩。在15min之后去除溶剂，并将凝胶切片在SpeedVac中干燥10分钟。将凝胶切片在15μl含有25mg每ml胰蛋白酶(Roche，产品号11418475001)的25mM NH₄HCO₃中重新泡胀。在10-15min之后将25μl25mM NH₄HCO₃添加至每个孔。然后将96孔板在37℃温育过夜。胰蛋白酶肽通过添加50μl70%丙腈/0.1%TFA并在室温温育样品15分钟来提取。将上清转移至HPLC小瓶，并重复提取。将合并的提取物在SpeedVac中干燥，并在50μl5%甲酸中重构(reconstitute)。

D.质谱法

将释放的胰蛋白酶肽使用配置有Nano LC层析系统(Easy nLC II，ThermoScientific)的Orbitrap Velos装置(Thermo Scientific)进行分析。将层析系统与2cm，ID100μm，5μm C18-A1保护柱(Proxeon，产品号SC001)和10cm，ID75μm，3μm C18-A2分离柱(Proxeon，产品号SC200)一同加载，并使用表22中所示的条件进行操作。将1μL各样品注入进行分析。

表22.

时间	持续时间	流速	水中的%0.1甲酸	丙腈中的%0.1甲酸
					(min)	(min)	nl/min	-	-
0.00	-	300	95	5
					10.00	10.00	300	65	35
12.00	2.00	300	0	100
					20.00	8.00	300	0	100

MS实验作为使用HCD活化以对最高的10个峰进行MS/MS分析的n级双重运行(double play)进行。MS扫描在Orbitrap中使用7500的分辨率，350-1750m/z的扫描范围来进行。MS/MS扫描在Orbitrap中使用表23中所示的设定进行(仅列出了选中的(enabled)设定)。

表23

E.数据库检索

将原始文件发送至使用Mascot和Mascot deamon版本2.3.0和内部基因组数据库(其包括相关异源蛋白的序列)进行序列检索。合并来自每个泳道的原始文件。emPAI值提取自Mascot检索结果，且mol%根据Ishihama，Y等(YasushiIshihama等(2005)Molecular&Cellular Proteomics，4，1265-1272)计算。使用表24中所示的设定进行Mascot检索。

表24.

参数	设置
		酶	胰蛋白酶
最大错误切割数(Max.missed cleavage)	3
		肽容忍(Peptide tolerance)	10ppm
MS/MS容忍(MS/MS tolerance)	0.02Da
		固定的修饰(Fixed modifications)	氨基甲酰基甲基(Carbamidomethyl)(C)
可变的修饰(Variable modifications)	氧化(Oxidation)(M)
		显著性阈值(Significance threshold)	p<0.05

选定样品的MS结果

对选定的样品分析两次以确认结果，如MS1和MS7。获得的结果列于表25。

表25

表25中的结果表明pduP_Pf_syn2a的表达在大肠杆菌TOP10中来自TRGU302中的高拷贝数质粒pTrc99A的比来自低拷贝数质粒pTRGU304的更高(表21)。在除了TRGU462和TRGU422的所有情况下，产生的蛋白通过MS检测。

实施例33：含有多种异源正丙醇途径基因组合的重组大肠杆菌MG1655中的正丙醇的产生

将携带表19中列出的质粒pTRGU409至pTRGU517的大肠杆菌MG1655在37℃在含有10μg/ml卡那霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷的10ml MM中在振荡下(250rpm)分别生长。在17、44和116小时之后从每个培养基取2ml样品。每个样品使用如本文中概述的气相色谱进行分析。培养实验的结果列于表26。

表26.

表26中的结果显示大肠杆菌MG1655在用含有测试的PduP基因之一的pTRGU88表达载体转化时，能够产生少量正丙醇。鉴定的正丙醇生物合成途径的剩余基因的插入在多数情况下增加产生的丙醇的量。亦显示了其中丙醇产生相对于pduP基因表达增加的基因组合的数个实例，如编号11-15，17-20，22，37，39，43，45，和47。在这些之中，多数基因组合含有Sbm基因而非MutAB基因，尽管具有MutAB与YgfD，Mme，YgfG，和PduP_syn2a的组合的编号46确实在116小时之后与仅pduP_Pf_syn2a的表达相比导致增加的丙醇含量。

实施例34：在重组大肠杆菌TOP10中的异丙醇和正丙醇的产生

将表达载体pTrc99A和pTRGU88如上所述通过电穿孔同时转化入大肠杆菌TOP10。将转化体在含有200μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上进行选择。然后将选定的菌落在含有200μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的LB培养基琼脂平板上划线，并在37℃温育过夜。挑取两个菌落，并用于接种含有100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的10mL TY肉汤培养基的试管，然后在振荡下(250rpm)在37℃温育过夜。然后通过离心收获培养物，并使用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离质粒。质粒用XbaI消化，且在每个转化体中两个质粒的存在通过当热身赛用凝胶电泳进行分析时在4176bp和4524bp的两个条带的存在来确认。将构建的大肠杆菌菌株TRGU284在-80℃储藏于30%甘油。

将表达载体pTRGU44(见上文)和pTRGU196(表达丙酮丁醇梭菌硫解酶基因，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶基因，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶基因，和拜氏梭菌异丙醇脱氢酶基因；参见2010年10月29日提交的美国临时专利申请号61/408,138)如上所述通过电穿孔同时转化入大肠杆菌TOP10。将转化体在含有200μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择。然后将选定的菌落在含有200μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的LB培养基琼脂平板上划线，然后在37℃温育过夜。挑取两个菌落，并用于接种含有100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡那霉素的10mL TY肉汤培养基的试管，然后在振荡下(250rpm)在37℃温育过夜。然后通过离心收获培养物，并使用Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离质粒。质粒用XbaI消化，且在每个转化体中两个质粒的存在通过当用凝胶电泳进行分析时对于pTRGU44和pTRGU196在5676bp和8930bp的两个条带的存在来确认。将构建的大肠杆菌菌株TRGU261在-80℃储藏于30%甘油。

将大肠杆菌菌株Trc99A，TRGU44，TRGU196，和TRGU261在含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的10mLLB培养基中在37℃在振荡下(250rpm)温育过夜，取每个菌株的0.5mL样品，并使用桌上离心机在15000xg离心1分钟，并弃去上清。然后将每个菌株重悬于不含任何补充物的0.5mL基本培养基(MM)中。将所述样品接着用于接种对于每个菌株的新的10mL培养。将培养物在37℃在振荡下温育119小时。在培养结束时取2mL样品，对其离心，并将每个样品的上清通过气相色谱进行分析。发酵液中的丙酮，1-丙醇和异丙醇可通过GC-FID使用本文中所述的步骤检测。将样品用甲醇中的0.05%四氢呋喃1+1稀释并进行分析。

表27

如表28中所示，正丙醇由大肠杆菌TRGU44以20mg/L产生，且在阳性对照菌株大肠杆菌Trc99A中仅可检测出痕量。异丙醇由大肠杆菌TRGU196以10mg/L产生。令人惊讶的是，在大肠杆菌TOP10中异源pduP和异源异丙醇途径基因的共表达导致以20mg/L产生正丙醇和异丙醇的27倍上调。

表28

实施例35：在重组大肠杆菌中异丙醇和1-丙醇的产生。

将质粒pSJ10942和pTRGu668同时转化入大肠杆菌TG1化学感受态细胞，在LB琼脂平板上选择红霉素(100微克/ml)和卡那霉素(50微克/ml)抗性，并进一步在含红霉素(100微克/ml)和卡那霉素(20微克/ml)的TY培养基中繁殖，并将通过使用HindIII的限制性分析判断认为含有所述两个质粒的菌株作为SJ11046保存。

将质粒pSJ10942和pTRGu671如上所述同时转化入大肠杆菌TG1，并将通过使用HindIII的限制性分析判断的菌株认为含有所述两个质粒的两个菌株作为SJ11047和SJ11048保存。

将菌株SJ10942用100微克/ml红霉素繁殖，并如前所述制备用于电穿孔。该菌株用质粒pTRGu507转化，在LB琼脂平板上选择红霉素(200微克/ml)和卡那霉素(30微克/ml)。并将通过使用HindIII的限制性分析判断的菌株认为含有所述两个质粒的两个转化体作为SJ11047和SJ11048保存。

将菌株SJ10942用100微克/ml红霉素繁殖，并如前所述制备用于电穿孔。该菌株用质粒pTRGu507转化，在LB琼脂平板上选择红霉素(200微克/ml)和卡那霉素(30微克/ml)。并将通过使用HindIII的限制性分析判断的菌株认为含有所述两个质粒的两个转化体作为SJ11051和SJ11052保存。

将如本文中所述构建的菌株，以及仅含有异丙醇操纵子的SJ10942从菌株收集中的冻结的小瓶直接接种入具有补充葡萄糖(1%)和B12维生素(10微升的5mM(7.9mg/ml)储备溶液)的LB培养基的10ml试管中。在发酵2日之后重复B12维生素添加。将抗生素对于红霉素添加至100微克/ml(所有菌株)和对于卡那霉素添加至20微克/ml(菌株SJ11046，-47，-48，-51和-52)。

将培养物在26℃，30℃或37℃振荡，如表29、30和31中分别所示。1-丙醇，2-丙醇和丙酮水平在发酵1、2和4日之后测量，如前所述。

表29.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

表30.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

表31.

“nd”意指未检测出；”0.000”意指检测出该化合物。

异丙醇和正丙醇两者均从携带两种途径的菌株产生，其中通过仅携带异丙醇途径的菌株未产生正丙醇。

实施例36：在重组路氏乳杆菌中从代谢中间物产生异丙醇和正丙醇

将菌株SJ11011，SJ11012，SJ11015，SJ11016，和SJ11024(见上文)在37℃在无振荡下温育过夜。然后使用50微升等分试样接种含10微克/ml红霉素的2mlMRS试管，其如下表中所示以多种浓度补充了丙酮和1,2-丙二醇。将培养物在37℃温育2日，并如上所述对上清样品分析正丙醇、异丙醇、丙酮和1,2-丙二醇。所得的正丙醇、异丙醇、丙酮和1,2-丙二醇水平分别示于表32、33、34和35。MRS-10erm表示未用任何菌株接种，而仅是经历温育和分析的培养基。

将菌株SJ11011，SJ11012，SJ11015，SJ11016，和SJ11024(见上文)接种入Eppendorf试管中含10微克/ml红霉素的2ml MRS，并在37℃在无振荡下温育过夜。然后使用50微升等分试样接种含10微克/ml红霉素的2ml MRS试管，其如下表中所示以多种浓度补充丙酮和1,2-丙二醇。将培养物在37℃温育两日，并如上所述对上清样品分析正丙醇、异丙醇、丙酮和1,2-丙二醇。所得的正丙醇、异丙醇、丙酮和1,2-丙二醇水平分别示于表32、33、34和35。MRS-10erm表示未用任何菌株接种，而仅是经历温育和分析的培养基。

表32

“nd”意指未检测出。

表33.

“nd”意指未检测出。

表34.

“nd”意指未检测出。

表35.

“nd”意指未检测出。

所述实施例说明重组路氏乳杆菌能够在小规模分批培养中从代谢中间物以超过1g/l的效价产生异丙醇和1-丙醇两者。

实施例37：在重组枯草芽孢杆菌中异丙醇的产生。

将编码丙酮丁醇梭菌硫解酶(SEQ ID NO:3)，枯草芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(SEQ ID NO：6和9)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶(SEQ ID NO:18)，和拜氏梭菌醇脱氢酶(SEQ ID NO:21)的基因通过PCR从质粒pTRGU196扩增。所述引物(见下文)将amyL核糖体结合位点组入紧接在硫解酶基因之前。以下划线标出的序列与硫解酶(P265)和醇脱氢酶(P266)基因的编码序列互补。

引物P265：5’-CCACA TTGAA AGGGG AGGAG AATCA TGAAG GAAGT TGTGA TTGCT TCT-3’(SEQ ID NO:125)

引物P266：5’-AGTCG ACGCG GCCGC TAGCA CGCGT TATAA GATGA CAACG GCTTT GAT-3’(SEQ ID NO:126)

将所得片段修饰以包括合适的启动子，并使用标准步骤靶向pel座将其转化入天然感受态枯草芽孢杆菌JA1343细胞。在补充0.01M KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7)，0.4%葡萄糖，和180μg/ml壮观霉素的LB培养基平板上选择转化体。在所得转化体中，对其中五个测试异丙醇产生。其中，三个转化体使用如上所述的步骤导致可检测出的异丙醇产生，其中一个导致20mg/l异丙醇。

使用类似于上文的方法，将编码丙酮丁醇梭菌硫解酶(SEQ ID NO:3)，莫哈韦芽孢杆菌琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶(SEQ ID NO：12和15)，拜氏梭菌乙酰乙酸脱羧酶(SEQ ID NO:18)，和拜氏梭菌醇脱氢酶(SEQ ID NO:21)的基因通过PCR使用SEQ ID NO:125和126中所示的引物从质粒pTRGU200扩增。

修饰所得片段，并如上所述使用标准步骤靶向pel座将其转化入天然感受态枯草芽孢杆菌JA1343细胞。对三个转化体测试了异丙醇产生，且所有均导致10mg/l异丙醇的产生。测试了阴性对照，并确认在这些条件下不含重组基因序列则不产生异丙醇。

生物材料的保藏

下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于德意志微生物和细胞培养保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSM)),Mascheroder Weg1B,D-38124Braunschweig,Germany，并给予下述的登录号：

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

本发明可通过下述编号段落进一步描述：

[A1]重组宿主细胞，其包含编码醛脱氢酶的异源多核苷酸，其中所述重组宿主细胞能够产生正丙醇。

[A2]段A1所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

[A3]段A2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

[A4]段A3所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是乳杆菌属(例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，或路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))或丙酸杆菌属(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii))的成员。

[A5]段A1-A4任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶选自：

(a)醛脱氢酶，其与SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[A6]段A1-A5任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶与SEQID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

[A7]段A1-A6任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

[A8]段A1-A7任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

[A9]段A1-A8任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的氨基酸序列。

[A10]段A1-A9任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的氨基酸序列。

[A11]段A1-A10任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码的异源多核苷酸醛脱氢酶可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[A12]段A1-A11任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞进一步包含一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸；或编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

[A13]段A12所述的重组宿主细胞，其中所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶选自：

(a)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其与SEQ ID NO:93的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:79或80的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)甲基丙二酸单酰CoA变位酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:79或80的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[A14]段A13所述的重组宿主细胞，其中所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶是蛋白复合物，和其中所述一种或多种编码所述甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸。

[A15]段A14所述的重组宿主细胞，其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与成熟多肽SEQ ID NO:66具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:64或65的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:64或65的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

[A16]段A12-A15任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶或其亚基的异源多核苷酸可操作地连接于外源启动子。

[A17]段A12-A16任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞进一步包含异源多核苷酸编码多肽，其与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合。

[A18]段A17所述的重组宿主细胞，其中所述与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽选自：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:72或94的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ IDNO:70，71，81，或82的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:70，71，81，或82的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[A19]段A17或A18所述的重组宿主细胞，其中所述编码与甲基丙二酸单酰CoA变位酶缔合或复合的多肽的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[A20]段A12所述的重组宿主细胞，其中所述甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶选自：

(a)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其与SEQ ID NO:103的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:102的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[A21]段A20所述的重组宿主细胞，其中所述编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[A22]段A12所述的重组宿主细胞，其中所述甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶选自：

(a)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其与SEQ ID NO:75的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:73或74的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[A23]段A22所述的重组宿主细胞，其中所述编码基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸甲可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[A24]段A22所述的重组宿主细胞，其中所述编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[A25]段A1-A24任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸和编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸。

[A26]段A25所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含和编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

[A27]段A25或A26所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸。

[A28]组合物，其包含段A1-A27任一项所述的重组宿主细胞。

[A29]段A28所述的组合物，其中所述培养基包含可发酵底物。

[A30]段A29所述的组合物，其中所述可发酵底物是甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[A31]段A28-A30任一项所述的组合物，进一步包含正丙醇。

[A32]段A31所述的组合物，其中所述正丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[A33]产生正丙醇的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生正丙醇的条件下培养段A1-A33所述的重组宿主细胞；和

(b)回收所述正丙醇。

[A34]段A33所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[A35]段A34所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[A36]段A33-A35任一项所述的方法，其中产生的正丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[A37]段A33-A36任一项所述的方法，进一步包括通过蒸馏纯化回收的正丙醇。

[A38]段A33-A37任一项所述的方法，进一步包括通过在还原剂存在下将丙二醛污染物转化为正丙醇来纯化所述回收的正丙醇。

[A39]段A33-A37任一项所述的方法，其中所得的正丙醇是基本上纯的。

[A40]产生丙烯的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生正丙醇的条件下培养段A1-A27所述的任一项重组宿主细胞；

(b)回收所述正丙醇；

(c)在适于产生丙烯的条件下使所述正丙醇脱水；和

(d)回收所述丙烯。

[A41]段A40所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[A42]段A41所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[A43]段A40-A42任一项所述的方法，其中产生的正丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[A44]段A40-A43任一项所述的方法，其中使所述正丙醇脱水包括用酸性催化剂处理所述正丙醇。

[B1]重组宿主细胞，其包含：

硫解酶活性；

琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性；

乙酰乙酸脱羧酶活性；和

异丙醇脱氢酶活性；

其中所述重组宿主细胞能够产生异丙醇。

[B2]重组宿主细胞，其包含编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；和/或编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸，其中所述重组宿主细胞能够产生异丙醇。

[B3]段B1或B2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

[B4]段B3所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自下组的属的成员：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

[B5]段B4所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是乳杆菌属(例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，或路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))或丙酸杆菌属(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii))的成员。

[B6]段B1-B5任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸。

[B7]段B1-B6任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸。

[B8]段B1-B7任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸。

[B9]段B1-B8任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

[B10]段B1-B9任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含编码硫解酶的异源多核苷酸；一种或多种(几种)编码CoA转移酶的多核苷酸；编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；和编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

[B11]段B7-B10任一项所述的重组宿主细胞，其中所述硫解酶选自：

(a)硫解酶，其与SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)硫解酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)硫解酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B12]段B7-B10任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码硫解酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[B13]段B7-B12任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。

[B14]段B7-B12任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA转移酶。

[B15]段B7-B14任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B16]段B7-B14任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B17]段B7-B14任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:37的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:39的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B18]段B7-B14任一项所述的重组宿主细胞，其中

所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:43的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B18]段B7-B14任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸可操作地连接于外源启动子。

[B19]段B8-B18任一项所述的重组宿主细胞，其中所述乙酰乙酸脱羧酶选自：

(a)乙酰乙酸脱羧酶，其与SEQ ID NO:18，45，118，或120的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B20]段B8-B19任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码乙酰乙酸脱羧酶可的异源多核苷酸操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[B21]段B9-B20任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丙醇脱氢酶选自下组：

(a)异丙醇脱氢酶，其与SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性。

[B22]段B9-B21任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[B23]组合物，其包含段B1-B22任一项所述的重组宿主细胞。

[B24]段B23所述的组合物，其中所述培养基包含可发酵底物。

[B25]段B24所述的组合物，其中所述可发酵底物是甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[B26]段B23-B25任一项所述的组合物，进一步包含异丙醇。

[B27]段B26所述的组合物，其中所述异丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[B28]产生异丙醇的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生异丙醇的条件下培养段B1-B22所述的重组宿主细胞；和

(b)回收所述异丙醇。

[B29]段B28所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[B30]段B29所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[B31]段B28-B30任一项所述的方法，其中产生的异丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[B32]段B28-B31任一项所述的方法，进一步包括通过蒸馏纯化回收的异丙醇。

[B33]段B28-B32任一项所述的方法，进一步包括通过在还原剂存在下将丙酮污染物转化为异丙醇来纯化回收的异丙醇。

[B34]段B28-B33任一项所述的方法，其中所得的异丙醇是基本上纯的。

[B35]产生丙烯的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生异丙醇的条件下培养段B1-B22任一项所述的重组宿主细胞；

(b)回收所述异丙醇；

(c)在适于产生丙烯的条件下使所述异丙醇脱水；和

(d)回收所述丙烯。

[B36]段B35所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[B37]段B36所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[B38]段B35-B37任一项所述的方法，其中产生的异丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[B39]段B35-B38任一项所述的方法，其中使所述异丙醇脱水包括用酸性催化剂处理所述异丙醇。

[C1]重组宿主细胞，其能够产生正丙醇和异丙醇。

[C2]段C1所述的重组宿主细胞，其包含：

硫解酶活性；

CoA转移酶活性；

乙酰乙酸脱羧酶活性；

异丙醇脱氢酶活性；和

醛脱氢酶活性；

其中所述宿主细胞能够产生正丙醇和异丙醇。

[C3]段C1或C2所述的重组宿主细胞，其包含：

编码硫解酶的异源多核苷酸；

一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸；

编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；

编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；和

编码醛脱氢酶的异源多核苷酸；

其中所述宿主细胞能够产生正丙醇和异丙醇。

[C4]段C3所述的重组宿主细胞，其进一步包含：

一种或多种(几种)编码甲基丙二酸单酰CoA变位酶的异源多核苷酸；

编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；

编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸；和/或

编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

[C5]段C1-C4任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

[C6]段C5所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自下组的属的成员：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

[C7]段C6所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是乳杆菌属(例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，或路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))或丙酸杆菌属(例如费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii))的成员。

[C8]段C3-C7任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶选自：

[C9]段C3-C8任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶与SEQ IDNO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

[C10]段C3-C9任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交。

[C11]段C3-C10任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶由多核苷酸编码，其与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。

[C12]段C3-C11任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的氨基酸序列。

[C13]段C3-C12任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽的氨基酸序列。

[C14]段C3-C13任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码醛脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[C15]段C3-C14任一项所述的重组宿主细胞，其中所述硫解酶选自：

[C16]段C3-C15任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码硫解酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[C17]段C3-C16任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。

[C18]段C3-C16任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA转移酶。

[C19]段C3-C18任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

[C20]段C3-C18任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

[C21]段C3-C18任一项所述的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

[C22]段C3-C18任一项所述的重组宿主细胞，其中

[C23]段C3-C22任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种(几种)编码CoA转移酶的异源多核苷酸可操作地连接于外源启动子。

[C24]段C3-C23任一项所述的重组宿主细胞，其中所述乙酰乙酸脱羧酶选自：

[C25]段C3-C24任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[C26]段C3-C25任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丙醇脱氢酶选自下组：

[C27]段C3-C26任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸外源的启动子。

[C28]段C1-C27任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞能够以高于约0.1g/L每小时，例如高于约0.2g/L每小时，0.5g/L每小时，0.75g/L每小时，1.0g/L每小时，1.25g/L每小时，1.5g/L每小时，1.75g/L每小时，2.0g/L每小时，2.25g/L每小时，2.5g/L每小时，或3.0g/L每小时的体积产量产生异丙醇和/或正丙醇。

[C29]组合物，其包含段C1-C28任一项所述的重组宿主细胞。

[C30]段C29所述的组合物，其中所述培养基包含可发酵底物。

[C31]段C30所述的组合物，其中所述可发酵底物是甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[C32]段C29-C31任一项所述的组合物，进一步包含异丙醇和/或正丙醇。

[C33]段C32所述的组合物，其中所述异丙醇和/或正丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[C34]产生正丙醇和异丙醇的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下培养段C1-C28所述的重组宿主细胞；和

(b)回收所述正丙醇和异丙醇。

[C35]段C34所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[C36]段C35所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[C37]段C34-C36任一项所述的方法，其中产生的正丙醇和/或异丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[C38]段C34-C37任一项所述的方法，进一步包括通过蒸馏纯化所述回收的正丙醇和异丙醇。

[C39]段C34-C38任一项所述的方法，进一步包括通过在还原剂的存在下将丙二醛污染物转化为正丙醇和/或将丙酮污染物转化为异丙醇来纯化所述回收的正丙醇和异丙醇。

[C40]段C34-C39任一项所述的方法，其中所得的正丙醇和异丙醇是基本上纯的。

[C41]产生丙烯的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生正丙醇和异丙醇的条件下培养段C1-C28任一项所述的重组宿主细胞；

(b)回收所述正丙醇和异丙醇；

(c)在适于产生丙烯的条件下使所述正丙醇和异丙醇脱水；和

(d)回收所述丙烯。

[C42]段C41所述的方法，其中所述培养基是可发酵培养基。

[C43]段C42所述的方法，其中所述可发酵培养基包含甘蔗汁(例如未灭菌的甘蔗汁)。

[C44]段C41-C43任一项所述的方法，其中产生的正丙醇和/或异丙醇为高于约0.01g/L，例如高于约0.02g/L，0.05g/L，0.075g/L，0.1g/L，0.5g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，100g/L，125g/L，150g/L，200g/L，或250g/L的效价。

[C45]段C41-C43任一项所述的方法，其中使所述正丙醇和异丙醇脱水包括用酸性催化剂处理所述正丙醇和异丙醇。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims

1.一种重组的乳杆菌属宿主细胞，其包含：

a.编码硫解酶的异源多核苷酸；

b.一种或多种编码CoA转移酶的异源多核苷酸；

c.编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸；和

d.编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸；

其中所述重组宿主细胞能够产生异丙醇。

2.权利要求1的重组宿主细胞，其中所述细胞是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，或路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)细胞。

3.权利要求1或2的重组宿主细胞，其中所述连接酶选自：

(a)硫解酶，其与SEQ ID NO:3，35，114，或116的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)硫解酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)硫解酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1，2，34，113，或115的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

4.权利要求1-3任一项的重组宿主细胞，其中编码硫解酶的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸是外源的启动子。

5.权利要求1-4任一项的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶。

6.权利要求5的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:4或5的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性；和

其中所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:7或8的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

7.权利要求5的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有琥珀酰CoA:乙酰乙酸转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:10或11的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:13或14的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

8.权利要求1-4任一项的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是乙酰乙酰CoA转移酶。

9.权利要求8的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:37的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:36的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:39的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:38的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

10.权利要求8任一项的重组宿主细胞，其中所述CoA转移酶是具有乙酰乙酰CoA转移酶活性的蛋白复合物，其包含编码第一多肽亚基的异源多核苷酸，和编码第二多肽亚基的异源多核苷酸，

其中所述第一多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性；

且所述第二多肽亚基选自：(a)多肽，其与SEQ ID NO:43的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:42的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

11.权利要求1-10任一项的重组宿主细胞，其中所述一种或多种编码CoA转移酶的异源多核苷酸可操作地连接于外源启动子。

12.权利要求1-11任一项的重组宿主细胞，其中所述乙酰乙酸脱羧酶选自：

(a)乙酰乙酸脱羧酶，其与SEQ ID NO:18，45，118，或120的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)乙酰乙酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:16，17，44，117，或119的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

13.权利要求1-12任一项的重组宿主细胞，其中编码乙酰乙酸脱羧酶的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸是外源的启动子。

14.权利要求1-13任一项的重组宿主细胞，其中所述异丙醇脱氢酶选自下组：

(a)异丙醇脱氢酶，其与SEQ ID NO:21，24，47，或122的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)异丙醇脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:19，20，22，23，46，或121的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

15.权利要求1-14任一项的重组宿主细胞，所述编码异丙醇脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。

16.权利要求1-15任一项的重组宿主细胞，其进一步包含编码醛脱氢酶的异源多核苷酸，且其中所述重组宿主细胞能够产生正丙醇。

17.权利要求16的重组宿主细胞，其中所述醛脱氢酶选自：

(a)醛脱氢酶，其与SEQ ID NO:27，30，33，51，54，57，60，或63的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列，或其全长互补链杂交；和

(c)醛脱氢酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:25，26，28，29，31，32，48，49，50，52，53，55，56，58，59，61，或62的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性。

18.权利要求16或17的重组宿主细胞，其中所述编码醛脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸是外源的启动子。

19.权利要求16-18任一项的重组宿主细胞，其进一步包含：

编码甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶的异源多核苷酸；

编码甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶的异源多核苷酸；和/或

编码正丙醇脱氢酶的异源多核苷酸。

20.一种产生异丙醇的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生异丙醇的条件下培养权利要求1-15任一项所述的重组宿主细胞；和

(b)回收所述异丙醇。

21.一种产生异丙醇和正丙醇的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生异丙醇和正丙醇的条件下培养权利要求16-19任一项所述的重组宿主细胞；和

(b)回收所述异丙醇和正丙醇。

22.一种产生丙烯的方法，其包括：

(a)在培养基中在适于产生异丙醇和/或正丙醇的条件下培养权利要求1-19任一项所述的重组宿主细胞；

(b)回收所述异丙醇和/或正丙醇；

(c)在适于产生丙烯的条件下使所述异丙醇和/或正丙醇脱水；和

(d)回收所述丙烯。

23.权利要求20-22任一项的方法，其中所述培养基是包含甘蔗汁的可发酵培养基。