CN103923871A - 导入异源代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物生产1-丙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及导入异源代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物生产1-丙醇的方法。所述产1-丙醇微生物中导入了1-丙醇生产的代谢途径并抑制了副产物乳酸的生成。更确切的说，是在大肠杆菌中高效表达了乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2的基因mhpF。这些基因是被构建于带有T1启动子，含有抗生素抗性的表达质粒上。将构建好的质粒转入大肠杆菌微生物中，结果得到了可以利用葡萄糖生产1-丙醇的生产菌株，但是同时得到了大量的副产物乳酸，通过抑制副产物的产生，使本发明的1-丙醇生产方法更为有效。
Description
技术领域
本发明涉及导入1-丙醇代谢途径的产1-丙醇微生物及使用所述微生物有效生产1-丙醇的方法，更确切的说，本发明涉及导入1-丙醇代谢途径和抑制其副产物乳酸生产的微生物，以及使其高效生产1-丙醇的方法。
背景技术
1-丙醇在医药工业中常用于生产丙磺舒(Probenecid)，红霉素(Erythrocin)，丙基戊酸钠(Sodium valproate)，2,5－吡啶二甲酸二丙酯(2,5-Pyridinedicarboxylic acid dipropylphthalate)等药物，由于其具有淡淡的香味，也可用于制造洗发水，润肤乳，和指甲油等化妆品和护肤品，1-丙醇还可用作植物油天然橡胶和树脂，某些合成树脂，聚乙烯缩丁醛，乙基纤维素等的溶剂，在工业上，还常在苯胺印刷术中用于制造油墨的溶剂。工业上主要用来合成乙酸丙酯(Propyl acetate)，正丙胺(Propylamine)等化工产品的原料，也可用于生产醋酸纤维，或者作为增塑剂，金属脱垢剂使用。1-丙醇还可以在喷气燃料中用来控制胶凝体生成，某些特定情况下可以用来代替沸点较低的乙醇作为反应溶剂。
由于1-丙醇的广泛用途及高价值，1-丙醇的生产得到了广泛的关注，目前，研究的热点集中在化学合成法上。在石油化学工业上，1-丙醇主要是以乙烯(Ethene)为原料，经过一氧化碳和氢气合成反应产生丙醛(Propionaldehyde)，然后再由丙醛加氢制得。所用催化剂有：钴或铑的羰基化合物，骨架催化剂(如镍、铜)，钌络合物等，这些催化剂中，在工业上最常使用骨架催化剂，但是在液相加氢反应中，大多采用镍系催化剂进行催化反应，而气相加氢反应中，大多使用了铜系催化剂。此外，1-丙醇也可利用低级烷烃的氧化液生产，在工业生产中，利用马铃薯或者谷物发酵生产乙醇时，1-丙醇也是常见的副产物。由于化学合成法合成1-丙醇必须使用高温，高压及贵重金属催化剂，且副产物较多，给下游分离纯化带来困难，合成成本较高，限制了化学合成法的发展。所以人们已经积极开始研究生物法来生产1-丙醇。
自然界中很多微生物可以合成1-丙醇，如克雷伯氏菌属(Klebsiella)和梭状芽胞杆菌属(Clostridium)等，这些细菌利用碳源的种类各不相同，并且这些菌生产1-丙醇时产生较多的副产物，如：乙醇(Ethanol)，乳酸(Lactate)，醋酸(Acetate)，甲酸(Formate)等，这些底物均能在不同程度上抑制细菌的生长与目的产物的产生，并且这些菌株并不是成熟的模式生物，有些有一定的致病性，存在遗传背景不清楚，基因操作方法不成熟等问题。大肠杆菌具有生物量较大，发酵周期短，生物背景明确，并且产生较少或者不产乙醇，丁酸等副产物，因此，我们使用了模式生物大肠杆菌作为生产菌株，引入人工合成途径，达到利用葡萄糖生产1-丙醇的目的。
2008年，Atsumi等人在大肠杆菌中构建了利用葡萄糖生产1-丙醇的代谢途径，该途径依赖于酮酸的代谢途径，引入了两个中间代谢产物的关键酶来生产1-丙醇，经过一系列代谢网络的优化，1-丙醇的最终达到产量1g/L。另外一种1-丙醇代谢途径是通过1,2-丙二醇在二元醇脱水酶(Diol dehydratase)的作用下生产1-丙醛，再由乙醇脱氢酶(Primaryalcohol dehydrogenase)催化脱氢转化为目的产物，Rachit等人在大肠杆菌中构建了这一合成途径，最终得到的约0.8g/L的1-丙醇(见图1)。这两种方法，都经过大肠杆菌中的碳代谢流量较少的代谢途径，导致了下游产物无法大量合成，限制了目的产物产量。
本发明设计了一条新的途径，葡萄糖通过糖酵解途径，进入三羧酸循环，由琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的催化下生成L-甲基丙二酰辅酶A，再由甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)异构化为D-甲基丙二酰辅酶A，D-甲基丙二酰辅酶A经ygfG编码的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)催化生成丙醇辅酶A，然后再adhE2编码的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)或mhpF编码的乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)催化下生成1-丙醇。该途径的优势在于利用了生物体内最重要也是碳通量最大的糖酵解途径和三羧酸循环中的中间代谢物来生产1-丙醇，具有很好地工业潜力和应用前景。结果，本发明人敲除了代谢副产物乳酸的生产支路，导入带有上述基因编码的不同拷贝数的质粒，证实了通过抑制乳酸的生成和外源基因的导入，大肠杆菌可以高效的生产1-丙醇，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供产1-丙醇微生物，所述产1-丙醇微生物通过转入异源的5个基因来组成新的合成途径，并通过抑制副产物乳酸的生成来提高1-丙醇的产率。
本发明的另一个目的是提供所述产1-丙醇的微生物的生产方法。
本发明的又一目的是使用所述敲除乳酸代谢支路产1-丙醇微生物在葡萄糖的培养基上高效的生产1-丙醇的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了乳酸代谢被抑制的产1-丙醇的微生物，通过向大肠杆菌中导入含有1-丙醇代谢途径相关基因的质粒制备所述产1-丙醇的微生物。
本发明还提供了乳酸代谢途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，通过向大肠杆菌中转导噬菌体制备所述产1-丙醇的微生物。
本发明还提供了大量生产1-丙醇的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在含有葡萄糖和GL、M9培养基中培养如权利要求1中所述的产1-丙醇微生物；
2)由所培养的微生物生产1-丙醇。
如上文所解释的那样，本发明涉及1-丙醇的有效生产方法，所述方法的特征在于：使用抑制乳酸代谢途径并导入异源代谢途径的产1-丙醇的微生物，在培养基中生长并达到生产1-丙醇的目的。
附图说明
图1大肠杆菌利用葡萄糖合成1-丙醇的代谢网络示意图
图2新构建的大肠杆菌利用葡萄糖合成1-丙醇的代谢途径示意图
图3葡萄糖生产1-丙醇的质粒方式之一
图4葡萄糖生产1-丙醇的质粒方式之二
图5培养基与质粒选取发酵结果
具体实施方式
具体实施例1
产1-丙醇微生物的构建
提取丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum ATCC824)的基因组，设计引物，进行PCR，得到编码乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)的基因adhE2。提取谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)的基因组，设计引物，进行PCR，得到编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase)的基因epi。提取大肠杆菌(E.coli)的基因组，设计引物，进行PCR，得到编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF。将这五个基因(分两组)分别与酶切好的pZE12连接，得到连接液备用。
热击法感受态的制备：将大肠杆菌BW25113，BL21*(DE3)，XLBlue平板挑取单菌落，在3mL LB培养基的试管中37℃，250rpm培养过夜，第二天早上取1％接种于50mLLB培养基的三角瓶中，培养至OD600到达0.2-0.4之间(约2hrs-2.5hrs)，取出培养液，置于冰上15min，5000rpm，4℃离心，弃上清，加入10mL CCB1溶液，重新混悬，置于冰上10min，5000rpm，4℃离心，弃上清，重复一次，加入1mLCCB1溶液，重悬菌体，置于冰上，放入4℃冰箱，12hrs后取出，加入1mL CCB2溶液，充分混匀，分装成50μL小管，-80℃保存待用。
CCB1溶液配制：5.15g CaCl2溶于200mL超纯水中，灭菌40min，冷却后加入2.5mL的1M MgSO4溶液。
CCB2溶液配制：2.06g CaCl2溶于128mL超纯水中，加入72mL甘油，灭菌40min，冷却后加入1mL的1M MgSO4溶液。
电转化法：将制备好的感受态细胞50μL置于冰上，加入2μL质粒，轻轻吸打混匀，放入预冷的电击杯中，1800V电击，用500μL LB培养基洗出菌体，置于1.5mL离心管中，37℃复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37℃过夜培养。
热击法：将制备好的感受态细胞50μL置于冰上，加入20μL上述步骤连接液，轻轻吸打混匀，冰浴30min。将混悬液置于42℃热水中90sec，拿出放于冰上2min。37℃复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37℃过夜培养。提取质粒待用。
电转化法感受态的制备：将大肠杆菌BW25113平板挑取单菌落，在3mL LB培养基的试管中37℃，250rpm培养过夜，第二天早上取1％接种于50mL LB培养基的三角瓶中，培养至OD600到达0.2-0.4之间(约2hrs-2.5hrs)，5000rpm，4℃离心，弃上清，加入10mL10％甘油，重新混悬；5000rpm，4℃离心，弃上清，加入2mL10％甘油，重新混悬；重复此步骤一次；最后加入200μL10％甘油混悬，置于冰上，待用。
取构建好的质粒2μL加入50μL，通过1800V电压电击转化。37℃复苏30min。将培养液涂于加入抗生素筛选标记的平板上，37℃过夜培养。
表1实验所使用菌种和质粒
表2本实验中使用的引物序列
*：序列中小写字母为酶切位点，下划线部分为RBS序列，加粗部分是起始密码子，斜体部分是终止密码子
具体实施例2：
产1-丙醇微生物的发酵生产
在大肠杆菌基因工程菌的平板上挑取单菌落，在装有3mL LB培养基的试管中37℃，250rpm培养过夜，第二天早上取1％菌悬液，接种于装有10mL M9培养基的125mL输液瓶中，培养7hrs，加入4μL50mM的IPTG诱导，然后培养48hrs，抽净氧气，厌氧发酵，在诱导后的24hrs，48hrs取样。
初步发酵结果显示，在野生型大肠杆菌BW25113中，两个质粒SXL66和SXL67在M9培养基中发酵并得到极少量的1-丙醇，在此基础上，我们进行了后续发酵试验。文献报道中，GL培养基常用于发酵生产1-丙醇，这是因为，前人构建的代谢途径常利用酮酸或1,2-丙二醇途径生产1-丙醇，而M9培养基富含PO4 3-离子，影响酮酸和1,2-丙二醇的生产。而对于我们新构建的代谢途径来说，PO4 3-离子的存在是否影响，并不确定，因此，实验选取了两种培养基M9培养基和GL培养基分别进行微好氧和厌氧发酵。得到结果如图5所示。
选择合适的质粒，培养基及培养方式，实验结果显示，微好氧发酵过程中，菌株不积累1-丙醇，在厌氧发酵过程中，质粒SXL67：pZE12-sbm-mdhP-epi-ygfG在生产了较多的1-丙醇，采用的方式是使用M9培养基进行厌氧发酵，得到了0.17g/L的1-丙醇。而厌氧发酵中主要的副产物乳酸的产量则高达1.8g/L。
具体实施例3：
产1-丙醇微生物的乳酸代谢途径的敲除
对目标微生物进行P1转导，方式如下：1，准备P1溶菌溶液：(1)在大肠杆菌基的平板上挑取单菌落，在3mL LB培养基的试管中37℃，250rpm培养过夜；(2)准备5mL的LB培养基，其中包括100μL50％(质量体积比)的葡萄糖，125μL1M CaCl2；加入1％过夜培养的菌液，37℃，250rpm培养90min；(3)将培养液分为两个试管，一个试管中加入3μL的噬菌体(Phage)，另一个试管为空白对照；(4)37℃，250rpm培养约1小时；(5)加入20μL氯仿剧烈快速混匀；(6)4000rpm，4℃离心10min；(6)将上清移至干净的1.5mL离心管中，再加入25μL氯仿混匀，放入4℃保存待用。2，转导：(1)将待转导的菌株挑取单菌落，在3mL LB培养基的试管中37℃，250rpm培养过夜；(2)6000rpm，2min离心，收集菌体，并用LB培养基混合液(LB培养基，5μL1M CaCl2,100μL1M MgSO4)重悬细胞；(3)分两个1.5mL离心管，其中一个加入30μL步骤1中制备好的P1溶菌溶液，另一个为空白对照，37℃培养30min；(4)加入200μL1M的柠檬酸钠(PH5.5)，再加入1mL LB培养基，37℃，250rpm培养1hr；(5)6000rpm，离心3min，用90μL LB培养基和10μL1M柠檬酸钠溶液重悬细胞；(6)涂在带有抗生素的平板上培养过夜；(7)长出的菌落即为阳性菌落。
得到阳性克隆即可用于后续发酵试验，导入构建好的质粒，发酵生产1-丙醇。
Claims (8)
1.乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，通过向大肠杆菌菌株中导入含有1-丙醇代谢途径相关基因的基因表达元件制备所述产1-丙醇的微生物。
2.如权利要求1所述的乳酸生产被抑制的产1-丙醇微生物，其中，所述基因表达元件为下述1)-3)的质粒中的一种：
1)由T1启动子、氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的100-150个拷贝数的质粒；
2)由T1启动子、卡那霉素(Kanamycin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的30-50个拷贝数的质粒；以及
3)由T1启动子、氯霉素(Chloramphenicol)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的5-10个拷贝数的质粒。
3.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，其中所述大肠杆菌选自于大肠杆菌BW25113、JM109或MG1655。
4.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物，其中所述大肠杆菌为乳酸代谢途径单敲除菌株或多敲除菌株。
5.如权利要求1所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇的微生物生产方法，通过向大肠杆菌中转入含有1-丙醇代谢途径相关基因的质粒制备的所述产1-丙醇微生物。
6.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇的微生物生产方法，所述生产方法包括将下述1)-3)质粒中的一种转入大肠杆菌中的步骤：
1)由T1启动子、氨苄青霉素(Ampicillin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的100-150个拷贝数的质粒；
2)由T1启动子、卡那霉素(Kanamycin)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的30-50个拷贝数的质粒；以及
3)由T1启动子、氯霉素(Chloramphenicol)抗性、编码乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)的基因adhE2，编码甲基丙二酰辅酶A异构酶(Methylmalonyl-CoAepimerase)的基因epi，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶(Methylmalonyl CoA mutase)的基因Sbm，编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(Methylmalonyl-CoA decarboxylase)的基因ygfG和编码乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase2)的基因mhpF组成的5-10个拷贝数的质粒。
7.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，其中所述大肠杆菌选自于大肠杆菌BW25113、JM109或MG1655。
8.如权利要求5所述的乳酸生产途径被抑制的产1-丙醇微生物的生产方法，，所述方法包括以下步骤；
1)在含有葡萄糖、GL或M9培养基中培养如权利要求1中所述的产1-丙醇微生物；
2)由所培养的微生物生产1-丙醇。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140716 |