CN101307336A - 构建基因工程菌发酵联产pdo、bdo和php的方法 - Google Patents

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Abstract

一种构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法，属于生物化工技术领域。工艺包括：在产生PDO的野生菌里敲除D型乳酸脱氢酶基因、引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，构建发酵联产PDO、BDO和PHP的基因工程菌；采用有氧发酵并将甘油和碱溶液进行混合流加的发酵调控方式；以及将发酵液经膜过滤，电渗析、浓缩、精馏步骤分离出产品PDO、BDO和PHP的产品提取流程。其优点在于，所构建的基因工程菌可同时生产PDO，BDO和PHP，提高了原料利用率，降低了生产成本；降低了副产物乳酸的合成，简化了后提取工艺，降低了提取成本；在引入PHP的同时增加了菌体的NADH2的合成。

Description

构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别提供了一种构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法；所述的PDO为1，3-丙二醇简称，BDO为2，3-丁二醇简称，PHP为由单体是β-羟基丙酸聚合生产的聚合物(聚β-羟基丙酸)。
背景技术
1，3-丙二醇(简称PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业。PDO最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，显示了比以1，2-丙二醇、丁二醇、乙二醇为单体合成的聚合物更优良的性能。目前全球每年消费数千万吨聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，而PTT的化学稳定性、生物可降解性等与PET相当，但耐污染性、韧性和回弹性及抗紫外性能等更优越。此外PTT纤维还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点，可在地毯领域与尼龙竞争。它还可用于具有优良性能的无纺布、工程塑料、服装、家庭装饰、垫衬料、织物等方面。PTT被评为美国98年六大石化新产品之一，被认为将是PET的升级产品。
PTT的优越性能及市场潜力早在50年前就被人们所认识，只因原料PDO生产技术难度大、成本高而导致PTT很难大规模工业化生产，迄今为止，只有Dupont和Shell两家跨国公司采用传统的化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产仅供它们合成PTT自用的PDO。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源，且环氧乙烷和另一路线的中间产物丙烯醛分别是易燃易爆或剧毒的危险品。由于发酵法生产PDO选择性高，操作条件温和，因此近年来受到特别的重视。
生物合成法生产PDO是利用微生物歧化甘油产生。自然界中可将甘油转化为PDO的微生物主要是厌氧或兼性厌氧菌，其中克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridium butyricum)及弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)具有较高的PDO转化率，而且对甘油和产物PDO具有较高的耐受力，因此具有较高的开发价值与应用前景。
2，3-丁二醇(2，3-butanediol，简称BDO)作为发酵法生产PDO的一种副产物也是一种重要的化工原料。它是一种无色无味液体，可作为燃料，可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药以及药物的手性载体等。BDO还可作为一个很有价值的化工原料来合成其他化学品，如BDO脱水可产生甲乙酮，甲乙酮的应用相当广泛，再进一步脱水可形成1，3-丁二烯。BDO可通过Diels-Alder反应聚合生成苯乙烯。BDO与甲乙酮缩合并进行加氢反应生成辛烷，辛烷可用来产生高质量的飞行原料。BDO与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可添加到奶油中改善风味。但由于其在PDO发酵中产量较低，一般不作为产物进行分离、提纯。
聚β-羟基脂肪酸，英文名称Polyhydroxyalkanoates，简称PHAs，泛指由单体β-羟基脂肪酸之间的羟基和羧基脱水酯化而得到的一种生物高分子材料。目前已经发现PHA聚酯有至少125种不同的单体结构，并且新的单体被不断地发现出来。由微生物合成的PHA有一些特殊的性能，包括生物可降解性、生物相容性、压电性和光学活性等。PHA能够满足多种人体组织器官的需求，如：心血管系统、角膜胰腺、胃肠系统、肾脏、泌尿生殖系统、肌肉骨骼系统、神经系统、牙齿与口腔、皮肤等等。目前已经商品化的PHA产品主要有PHB、PHBV和PHBHHx。另外，根据单体结构或含量的不同，PHA的性能可从坚硬到柔软到弹性变化。PHA有许多潜在的应用前景，国内外都对其进行大量的基础和应用开发研究。
PHAs的最简单单体是β-羟基丙酸(β-hydroxypropionic acid)，由它聚合生产的聚合物简称PHP(Polyhydroxypropionic acid)。最近研究表明PHP相对其他种类的PHAs具有更高的强度，在某些行业就有良好的潜在应用前景。PHA生物合成时候的直接单体是β-羟基脂酰辅酶A，这种形式的单体含有高能化学键。PHP在微生物细胞里面可以通过甘油代谢中间产物转化生产(见图1)。
目前，已经实现工业化生产的PHA只有PHB以及羟基丁酸与羟基戊酸的共聚物PHBV，分别由奥地利林茨化学公司(Chemie Linz AG)和英国帝国化学工业公司(ICI，现在称为Zeneca)在八十年代实现。从1998年以来，清华大学微生物实验室与广东江门生物技术开发中心合作，在国内外首次开发成功了羟基丁酸与羟基己酸的共聚物PHBHHx的工业化生产技术，为这种新型材料的应用开发打下了物质基础。
在PDO发酵过程中，常常存在发酵后期细胞生长停滞，PDO增加缓慢，乳酸积累迅速增加的现象，产生大量的乳酸使得PDO后提取变得困难。另外，由于甘油脱水酶活力在发酵后期降低，胞内辅酶NADH2供给不足等原因也造成了PDO浓度在后期增长缓慢，为得到相对高浓度的PDO延长发酵时间，势必造成生产成本的增加，这些因素也严重制约了PDO产业化的发展。针对这些问题，目前采用基因工程改造菌种性能，提高PDO发酵水平或联产其他高附加值的产品，可大大降低PDO的生产成本。
目前对对野生菌株的基因工程改造主要集中在以下几个方面：
(1)通过基因工程方法强化表达还原途径中限速酶(如甘油脱水酶，PDO氧化还原酶)
Zeng等[Sun JB.，Heuvel J.，Soucaille P.，Qu Y.，and Zeng A.P.ComparativeGenomic Analysis of dha Regulon and Related Genes for Anaerobic Glycerol Metabolismin Bacteria.Biotechnol.Prog.200319：263-272]构建了含有编码甘油脱水酶和PDO氧化还原酶基因的质粒，将其插入野生菌种中，结果证明这两个酶的活性得到了大幅度提高.但是在实际的发酵过程中，该工程菌并未产出高浓度的PDO。黄日波等采用一种全新的甘油脱水酶基因的克隆方法，并将其表达在大肠杆菌里，最终可得到30-35g/lPDO，PDO对甘油得率约为40％。[黄日波等，产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因及其PDO的生产方法中国专利申请号：200610019452.X]
(2)敲除无益副产物编码基因，阻断副产物代谢途径；
张延平[张延平，刘铭，曹竹安.醛脱氢酶基因敲除的K.pneumoniae重组菌的构建.中国生物工程杂志，2005，25(12)：34～38]等利用同源重组技术对K.pneumoniae M5al中产乙醇途径的乙醛脱氢酶基因进行了敲除，获得两株工程菌。在厌氧条件下进行批次发酵实验，结果表明乙醇的生成浓度降低了43％～53％，PDO合成浓度提高了27％～42％，但PDO的最终浓度只有16g/L。杨光分别构建了K.pneumoniae M5al乙酸、乙醇和乳酸代谢途径缺失的基因工程菌，甘油转化率有所提高，但PDO终浓度和生产强度反而有所下降[杨光.1，3-丙二醇产生菌肺炎克氏杆菌的分子育种[D].北京：中国农业大学，2003]。
(3)在PDO生产菌中构建辅酶再生系统；
黄志华等[黄志华，张延平，曹竹安等.甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析.微生物学报，2007，47(1)：64～68]从C.boidinii基因组中获取了具有还原型辅酶I(NADH2)再生功能的甲酸脱氢酶基因，构建了甲酸脱氢酶重组质粒，首次在PDO生产菌株K.pneumoniae中构建了NADH2再生系统，重组质粒转入K.pneumoniae后菌株的1，3-PDO合成浓度达到78.6g/L，比出发菌株YMU2提高了12.5％。黄志华[16黄志华，张延平，曹竹安.在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH2再生系统.中国生物工程杂志，2006，26(12)：75～80]等将甲酸脱氢酶重组质粒转入醛脱氢酶失活菌Klebsiella pneumoniae DA 21HB后，重组菌合成PDO的浓度达到75.06g/L，比出发菌株DA 21HB提高了19.2％。
(4)在E.coli中构建利用葡萄糖合成PDO的基因工程菌
杜邦公司和Genencor国际有限公司在构建以葡萄糖为底物的生物催化剂方面申请了多项专利保护[Bulthuis B A，Gatenby A A，Haynie S L，et al.Method forthe Production of Glycerol by Recombinant Organisms[P].United States Patent：6 358 716，2002-05-19.Diaz-Torres M，Dunn-Coleman N S，Chase M W，et al.Methodfor the Recombinant Production of 1，3-Propanediol[P].United States Patent：6 136 576，2000-10-24.Emptage M，Haynie S L，Laffend L A，et al.Process forthe Biological Production of 1，3-Propanediol with High Titer.United StatesPatent：6514733，2003-08-21.]，他们以E.coli K12为出发菌株，成功构建了1株产量高、生产过程为好氧的工程菌.利用此基因工程菌株进行发酵，在补料批式发酵实验中得到1，3-PD浓度135g/L，但其缺点是该菌发酵需依赖辅酶B12，因此，生产成本较高。
(5)在甘油产生菌中构建合成PDO的基因工程菌
Cameron等[Cameron DC，Altaras NE，Hoffman ML et.al.Metabolic Engineeringof Propanediol Pathways.Biotechnol.Prog.1998，14：116-125]在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)中表达来自克雷伯氏肺炎杆菌中的这两个酶的基因。在厌氧条件下以5g/L的葡萄糖为碳源，同样添加维生素B12的培养基进行发酵，但是经过48小时培养在发酵液中没有检测到PDO。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建基因工程菌发酵联合生产PDO、BDO和PHP的方法，在PDO产生菌中，敲除了D型乳酸脱氢酶，引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，增加了细胞的NADH2的合成，降低了无益副产物乳酸的产量，同时增加了有益副产物BDO的产量。目前，还未有构建基因工程菌联产PDO，BDO和PHP的报导。
本发明中所采用的构建基因工程菌发酵联合发酵生产PDO、BDO和PHP的方法(如图2所示)，工艺包括：在产生PDO的野生菌里敲除D型乳酸脱氢酶基因、引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，构建发酵联合生产PDO、BDO和PHP的基因工程菌；采用有氧发酵并将甘油和碱溶液进行混合流加的发酵调控方式；以及将发酵液经膜过滤，电渗析、浓缩、精馏等步骤分离出产品PDO和BDO和PHP的产品提取流程。其具体内容如下：
1.基因工程菌的构建
(1)D型乳酸脱氢酶基因的敲除
A.克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属等可产生PDO的野生型菌株基因组DNA的提取并纯化。
B.以A步骤中纯化的基因组样品为模板，根据D型乳酸脱氢酶基因设计引物，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增实验。
C.把PCR产物D型乳酸脱氢酶基因片段纯化后与克隆载体(如：pMD18-T-vector)连接。
D.筛选阳性克隆载体并进行酶切，回收、连接自杀载体(如pGPKm或pGP704)，然后转入大肠杆菌(如SM10)感受态细胞。
E.含有重组质粒大肠杆菌与野生型宿主菌株进行双亲交换实验，使用自杀载体(如pGPKm)上面的卡那霉素抗性基因作为筛选标记，筛选出D型乳酸脱氢酶基因缺失的菌株。
(2)PHP重组质粒的构建
A.以克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属可产生PDO的野生型菌株基因组为模板克隆辅酶A依赖性的醛脱氢酶(CoA-Dependent Proionaldehyde Dehydrogenase，PAD)，经酶切、连接表达载体pDK6构建重组表达载体PAD_pDK6。
B.把来源于罗尔斯顿氏菌属(Ralstonia)或贪铜菌属(Cupriavidus)的聚羟基脂肪酸合酶(PHA synthase，PhaC)基因片段与PAD_pDK6连接构建重组载体PAD_PhaC_pDK6(如图3)。
C.把PAD_PhaC_pDK6重组载体转化到步骤(1)中所构建的敲除了D型乳酸脱氢酶基因的工程菌感受态细胞里，鉴定并分离出阳性克隆，即为目的菌株。
2.利用所构建的基因工程菌发酵联产PDO，BDO，PHP
将所构建的基因工程菌在固体培养基上培养16～24h，接入种子培养基30～37℃有氧培养，以1％～5％的接种量接入以甘油为发酵底物的发酵培养基。发酵温度30～37℃。发酵过程中根据所构建基因工程菌的特点，采用将甘油和碱溶液(1∶0.05～1.0)进行耦合流加的调控方式进行发酵，pH值控制在5.0～8.0，40～60h后停止流加至发酵结束。
3.产品提取
发酵液经过微滤和超滤，滤液经电渗析脱盐，脱盐后富含PDO，BDO的淡室液经浓缩、精馏等步骤分离出产品PDO和BDO。过滤所得菌体用于提取PHP。另外来自电渗析的富含盐的浓室液经浓缩结晶得到丁二酸钠等有机酸盐，也可作为产品之一，结晶母液又回到电渗析前。
本发明所述的用于构建基因工程菌的野生菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸梭菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属等能产生PDO的菌株。所构建的基因工程菌发酵底物为甘油、甘油发酵液、生物柴油副产物粗甘油或肥皂行业的副产物粗。
步骤2中发酵是采用有氧发酵，并采用将甘油和碱溶液进行混合流加发酵的方式。本发明的有益效果：
所构建基因工程菌可同时发酵生产PDO，BDO和PHP，一方面发酵过程D型乳酸显著减少或不产生，产品后提取工艺因此变得简单，降低了能耗和后提取的成本；另一方面BDO和PHP作为产品提取出来，增加了产品的附加值，提高了原料利用率，降低了生产成本；其次，PHP的引入，显著增加了菌体NADH2含量，有利于PDO的合成。本发明还可用于PDO，BDO和PHP的联产。
附图说明
图1为PHP在微生物细胞里的甘油代谢路径。其中，HOCH2CH2CH2OH为甘油，HOCH2CH2CHO为3-羟基丙醛，HOCH2CH2CO-CoA为3-羟基丙酰辅酶A，Poly(3-Hydroxy-Propionic acid)为聚3-羟基丙酸，CoA为辅酶A，NAD/NADH为辅酶I。
图2为甘油发酵联产PHP、PDO和BDO示意图。其中Glycerol为甘油，3-Hydroxypropionaldehyde为3-羟基丙醛，3-Hydroxy-propionyl-CoA为3-羟基丙酰辅酶A，Poly(3-Hydroxy-propionic acid)为聚3-羟基丙酸，1，3-Propanediol为1，3-丙二醇，Pyruvate为丙酮酸，Lactate为乳酸，Acetolactate为乙酰乳酸，Acetoin为3-羟基丁酮，2，3-Butanediol为2，3-丁二醇。
图3为重组质粒PAD_PhaC_pDK6。
图4为PDO，BDO，PHP产品提取流程图。
具体实施方式
所述构建基因工程菌发酵联合生产PDO、BDO和聚β-羟基丙酸的方法，包括在产生PDO的野生菌里敲除D型乳酸脱氢酶基因、引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，构建发酵联合生产PDO、BDO和PHP的基因工程菌；采用将甘油和碱溶液进行混合流加补料的发酵调控方式发酵；以及将发酵液经膜过滤，电渗析、浓缩、精馏等步骤分离出产品PDO和BDO和PHP的产品提取流程。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。
实例1：
(1)D型乳酸脱氢酶基因的敲除
以克雷伯氏菌HR526为出发菌株，提取基因组DNA，并以一对引物GGAATTCACGGTTGCGAACGGTATGTA和GCTCTAGAAGTGGTCTCCGAAATGCTGA进行PCR扩增实验，引物5’端分别含有EcoRI和XbaI核酸内切酶位点。把PCR产物D型乳酸脱氢酶基因片段纯化后测序，结果如下：
GAATTCACGGTTGCGAACGGTATGTATCTTCGTCAATGACGACGGCTGCCGCCC
GGTGCTGGAAGAGCTGAAGGCCCACGGGGTGAAATATATCGCCCTGCGCTGCG
CCGGGTTTAACAACGTCGACCTTGAGGCGGCAAAGGAGCTTGGCCTGCGCGTC
GTGCGCGTTCCAGCTTACTCTCCGGAAGCGGTCGCTGAGCATGCGATCGGTATG
ATGATGTCGCTCAACCGCCGCATCCACCGCGCTTACCAGCGTACCCGCGATGCC
AATTTCTCCCTCGAAGGCCTCACCGGCTTCACCATGTACGGCAAAACCGCCGGG
GTGATCGGCACCGGGAAAATTGGCGTAGCGATGTTGCGGATCCTTAAAGGCTT
CGGCATGCGCCTGCTGGCGTTCGACCCGTACCCAAGCGCCGCCGCGCTGGAGC
TGGGGGTGGAATATGTTGACCTCGCCACGCTGTACAAGGAATCGGACGTGATC
TCCCTGCACTGTCCGCTGACCGACGAAAACTACCACCTGCTCAATCGCGAAGCC
TTCGATCAGATGAAAGACGGGGTGATGGTGATCAACACCAGCCGCGGCGCCCT
GATCGACTCCCAGGCGGCCATCGACGCCCTGAAGCACCAGAAAATTGGCGCGC
TGGGGCTGGACGTTTATGAGAACGAACGCGATCTGTTCTTTGAAGACAAATCC
AACGACGTGATCCAGGACGATGTCTTCCGCCGCCTCTCCGCCTGCCATAACGTG
CTGTTTACCGGCCATCAGGCGTTCCTCACCGCCGAGGCGCTGATCAGCATTCGG
AGACCACTTCTAGA
将上述基因片段与克隆载体pMD18-T-vector连接。筛选阳性克隆载体LDH-pMD18-T-tector，使用EcoRI和XbaI对LDH-pMD18-T-tector进行双酶切，回收片段与已经被同样内切酶(EcoRI和XbaI)消化过的pGPKm载体连接，然后通过电转化法转入大肠杆菌SM10感受态细胞。含有重组质粒LDH-pGPKm的SM10菌与野生型菌株进行双亲交换实验，使用pGPKm载体上面的卡那霉素抗性基因作为筛选标记，筛选出D型乳酸脱氢酶基因缺失的菌株。
(2)PHP重组质粒的构建
以克雷伯氏菌HR526为出发菌株，提取基因组DNA，并以其为模板克隆辅酶A依赖性的醛脱氢酶(CoA-Dependent Proionaldehyde Dehydrogenase，PAD)，设计引物为：5-GCT GAATTC ATGAATACAGCAGAACTGGA-3和5-GGCGGTACCTTAGCGAATGGAAAAACCGT-3)。在EcoRI和KpnI核酸内切酶的帮助下连接载体pDK6构建重组表达载体PAD_pDK6。把经过Xba I和Hind III消化后的来源于Ralstoniaeutropha的聚羟基脂肪酸合酶基因片段与载体PAD_pDK6连接构建重组载体PAD_PhaC_pDK6。电转化法转化到步骤(1)中所构建的敲除了D型乳酸脱氢酶基因的工程菌感受态细胞里，鉴定并分离出阳性克隆，即为目的菌株HR526G。
2.发酵
(1)菌种：所构建的目的菌株HR526G
(2)培养基：
表1培养基组成
Figure A20081010572200101
*铁溶液的配制：每升水中加入FeSO4·H2O 5.0g，37％的浓盐酸4ml。
(3)发酵方式：将所构建的基因工程菌在固体培养基上培养24h，将菌种接入含有30g/L甘油的种子培养基中(250ml三角瓶，装液量100ml)，培养温度37℃，摇床转速150rpm，好氧培养24h。以5％的接种量接入含初始甘油为30g/l的发酵培养基。发酵采用5L发酵罐，发酵温度37℃。发酵过程中采用将甘油和NaOH溶液(1∶0.1)进行耦合流加，pH值控制在6.0，通气量0.2vvm空气，转速150rpm，40h后停止流加至发酵结束。
(4)发酵结果：
72小时后，OD650nm达到11；PHP含量1.46％(g/g cell)；PDO：42g/l；BDO：14g/l，乳酸未检测出。
3.产品提取
发酵液经膜过滤，滤液经电渗析、浓缩、蒸馏、精馏等步骤分离出产品PDO和BDO。过滤所得菌体用于提取PHP。产品PDO提取收率85％。

Claims (7)

1.一种构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法，其特征在于：在产生PDO的野生菌里敲除D型乳酸脱氢酶基因、引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，构建发酵联产PDO、BDO和PHP的基因工程菌；采用将甘油和碱溶液进行混合流加的发酵调控方式；以及将发酵液经膜过滤，电渗析、浓缩、精馏步骤分离出产品PDO、BDO和PHP的产品提取流程。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的基因工程菌的构建包括：D型乳酸脱氢酶基因的敲除，PHP重组质粒的构建；
(1)D型乳酸脱氢酶基因的敲除工艺步骤为
克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属可产生PDO的野生型菌株基因组DNA的提取并纯化；
以纯化的基因组样品为模板，根据D型乳酸脱氢酶基因设计引物，进行基因扩增；
把基因扩增产物D型乳酸脱氢酶基因片段纯化后与克隆载体连接，所述的克隆载体为pMD18-T vector；
筛选阳性克隆载体并进行酶切，回收、连接自杀载体，然后转入大肠杆菌感受态细胞；所述的自杀载体为pGPKm或pGP704，所述的大肠杆菌为SM10；
含有重组质粒大肠杆菌与野生型宿主菌株进行双亲交换实验，使用自杀载体上面的抗性基因作为筛选标记，筛选出D型乳酸脱氢酶基因缺失的菌株。
(2)PHP重组质粒的构建的工艺步骤为：
以克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属可产生PDO的野生型菌株基因组为模板克隆辅酶A依赖性的醛脱氢酶，经酶切、连接表达载体pDK6构建重组表达载体PAD_pDK6；
把来源于罗尔斯顿氏菌属或贪铜菌属的聚羟基脂肪酸合酶基因片段与PAD_pDK6连接构建重组载体PAD_PhaC_pDK6；
把PAD_PhaC_pDK6重组载体转化到步骤(1)中所构建的敲除了D型乳酸脱氢酶基因的工程菌感受态细胞里，鉴定并分离出阳性克隆为目的菌株；
3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的构建发酵联合生产PDO、BDO和PHP的基因工程菌是利用所构建的基因工程菌发酵联产PDO，BDO，PHP；其工艺为：将所构建的基因工程菌在固体培养基上培养16～24h，接入种子培养基30～37℃有氧培养，以1％～5％的接种量接入以甘油为发酵底物的发酵培养基；发酵温度30～37℃，发酵过程中根据所构建基因工程菌的特点，采用将甘油和碱溶液1∶0.05～1.0进行耦合流加的调控方式进行发酵，pH值控制在5.0～8.0，40～60h后停止流加至发酵结束。
4、按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的产品提取工艺为：发酵液经过微滤和超滤，滤液经电渗析脱盐，脱盐后富含PDO，BDO的淡室液经浓缩、精馏等步骤分离出产品PDO和BDO；过滤所得菌体用于提取PHP；另外来自电渗析的富含盐的浓室液经浓缩结晶得到丁二酸钠有机酸盐，作为产品之一，结晶母液又回到电渗析前。
5、按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的用于构建基因工程菌的野生菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸梭菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属能产生PDO的菌株。
6、按照权利要求1所述方法，其特征在于：基因工程菌发酵联产PDO、BDO、PHP是采用有氧发酵，并采用将甘油和碱溶液进行混合流加发酵的方式。
7、按照权利要求3所述方法，其特征在于：所构建的基因工程菌发酵底物为甘油、甘油发酵液、生物柴油副产物粗甘油或肥皂行业的副产物粗甘油。
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