BR112016006321B1

BR112016006321B1 - Enzima engenheirada tendo especificidade de substrato aceto acetil-coa e atividade aceto acetil-coa específica de hidrolase, micro-organismo modificado, e, processo de produção de um ou mais produtos a partir de uma fonte de carbono fermentável

Info

Publication number: BR112016006321B1
Application number: BR112016006321-0A
Authority: BR
Inventors: Avram Michael Slovic; Iuri Estrada Gouvea; Daniel Johannes Koch; Felipe Galzerani
Original assignee: Braskem S.A
Priority date: 2013-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2022-11-16
Also published as: US10774317B2; US10000744B2; US20160208228A1; BR112016006321A2; EP3536799A2; EP3049529B1; US20180327727A1; EP3536799A3; EP3049529A4; EP3049529A1; WO2015042588A1

Abstract

ENZIMA ENGENHEIRADA TENDO ATIVIDADE ACETO ACETIL-COA HIDROLASE, MICRO-ORGANISMOS COMPREENDENDO A MESMA, E PROCESSOS DE USO DA MESMA. A presente exposição provê enzimas engenheiradas que são capazes de mediar a conversão de aceto acetil-CoA a aceto acetato que não reagem com a mesma ordem de magnitude com a cetil-CoA como fazem com aceto acetil-CoA (por exemplo, as enzimas engenheiradas têm uma atividade específica para aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-Coa hidrolase). Adicionalmente, a exposição provê micro-organismos modificados que compreendem as enzimas engenheiradas aqui mostradas e processos de uso dos mesmos.

Description

Antecedentes

[001] A conversão de aceto acetil-CoA a aceto acetato (Fig. 1) é uma etapa essencial em caminhos metabólicos com tais intermediários. A específica hidrólise da ligação tio éster entre coenzima A (um tiol) e aceto acetato (um carreador grupo acila) em aceto acetil-CoA é um caminho eficiente para produção de conversão mencionada acima. Duas classes de enzimas ocorrendo naturalmente têm sido usadas para mediar tal conversão incluindo, CoA transferases (E.C. 2.8.3.-) e CoAhidrolases (tioesterases) (E.C. 3.1.2.-). Entretanto, enquanto aceto acetato- CoA transferases requerem a presença de um ácido não ativado atuando como um receptor de CoA, as CoA-hidrolases (acil-CoA tioesterases) descritas atuarem sobre aceto acetil-CoA não são específicas no sentido de que elas reagem com a mesma ordem de magnitude com acetil-CoA, o substrato requerido para formação de aceto acetil-CoA através da enzima tiolase (E.C.2.3.1.9), pelo que degradando o substrato para a própria biossíntese de aceto acetil-CoA.

[002] Por isso, existe uma necessidade na técnica de enzimas aperfeiçoadas para mediação de conversão de aceto acetil-CoA em aceto acetato.

Sumário

[003] A presente exposição provê enzimas engenheiradas que são capazes de mediar a conversão de aceto acetil-CoA a aceto acetato que não reagem com a mesma ordem de magnitude com acetil-CoA como elas fazem com aceto acetil-CoA (por exemplo, as enzimas engenheiradas têm uma atividade específica para aceto acetil-CoA pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase).

[004] A presente exposição também provê uma enzima engenhei- rada tendo especificidade para substrato aceto acetil-CoA e atividade hidrolase específica de aceto acetil-CoA.

[005] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada compreende i) uma sequência de aminoácidos de uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase; e ii) uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico (isto é, o resíduo de ácido glutâmico catalítico) para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1, ou uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo a uma posição de aminoácido 46 de SEQ ID NO: 3, ou uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 333 de SEQ ID NO: 5.

[006] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de uma família de enzimas tendo atividade 3-oxoácido CoA-transferase.

[007] Em algumas modalidades de cada um ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é butirato aceto acetato CoA-transferase ou acetato aceto acetato-CoA transferase.

[008] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de Clostridium acetobutilicum.

[009] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 2.

[0010] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de Escherichia coli.

[0011] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 3.

[0012] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 5.

[0013] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem uma atividade específica aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase.

[0014] A presente exposição também provê uma enzima engenhei- rada tendo a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 2.

[0015] A presente exposição também provê um micro-organismo modificado compreendendo um ou mais polinucleotídeos codificando uma ou mais enzimas em um caminho com aceto acetato como um intermediário ou produto final, e uma enzima engenheirada tendo especificidade para substrato aceto acetil-CoA e atividade hidrolase específica de aceto acetil-CoA.

[0016] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, o micro-organismo tem uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato ou uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição de uma enzima que descarboxila piruvato.

[0017] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a interrupção na uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato é uma supressão ou uma mutação.

[0018] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato incluem pdc1, pdc 5, e/ou pdc6, e onde o um ou mais fatores de transcrição da uma ou mais enzimas que des- carboxilam piruvato incluem pdc2.

[0019] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada compreende i) uma sequência de aminoácidos de uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase e ii) uma substituição de um resí-duo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO:1.

[0020] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de uma família de enzimas tendo atividade 3-oxoácido CoA-transferase.

[0021] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é butirato aceto acetato CoA-transferase ou acetato aceto acetato-CoA transferase.

[0022] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de Clostridium acetobutilicum.

[0023] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 2.

[0024] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de Escherichia coli.

[0025] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 4.

[0026] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 6.

[0027] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem uma específica atividade aceto acetil-CoA hidrolase 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase.

[0028] A presente exposição também provê um processo de engenharia de uma enzima tendo especificidade de substrato aceto acetil- CoA e atividade hidrolase específica aceto acetil-CoA, o processo compreendendo: a) seleção de uma enzima tendo atividade aceto acetil- CoA transferase, e b) substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1 na enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase para produzir uma enzima engenheirada.

[0029] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a substituição é introduzida via mutagênese direcionada de sítio.

[0030] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de uma família de enzimas tendo atividade 3-oxoácido CoA-transferase.

[0031] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é butirato aceto acetato CoA-transferase.

[0032] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é de Clostridium acetobutilicum ou Esche- richia coli.

[0033] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a enzima engenheirada tem uma específica atividade aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase.

[0034] A presente exposição também provê um processo de produção de um ou mais produtos a partir de uma fonte de carbono fermentá- vel, o dito processo compreendendo: a) provimento de uma fonte de carbono fermentável; e b) contato de fonte de carbono fermentável com o micro-organismo modificado como aqui mostrado em um meio de fermentação, onde o micro-organismo produz um ou mais produtos a partir da fonte de carbono fermentável.

[0035] Em algumas modalidades de cada uma ou qualquer das modalidades mencionadas acima ou abaixo, a fonte de carbono é contatada com o micro-organismo modificado sob condições anaeróbicas.

Breve Descrição dos Desenhos

[0036] O sumário anterior, assim como a seguinte descrição detalhada da exposição, serão melhor entendidos quando lidos em conjunção com os desenhos apostos. Para o propósito de ilustração da exposição, são mostradas nas figuras modalidades que são presentemente preferidas. Deve ser entendido, entretanto, que a exposição não é limitada aos precisos arranjos, exemplos e instrumentalidades mostradas.

[0037] A Figura 1 mostra um esquema de reação para a formação de aceto acetato através de hidrólise de aceto acetil-CoA.

[0038] A Figura 2 mostra esquemas de reação para caminhos metabólicos com os intermediários aceto acetil-CoA e aceto acetato.

[0039] A Figura 3 mostra um alinhamento de 3-oxoácido CoA- transferases ilustrando a identificação e localização do resíduo de ácido glutâmico ativo.

[0040] A Figura 4 mostra um caminho exemplar para a coprodução de 1-propanol e 2-propanol, onde 1-propanol é produzido via um intermediário di-hidroxiacetona-fosfato.

[0041] A Figura 5 mostra um caminho exemplar para a coprodução de 1-propanol e 2-propanol, onde 1-propanol é produzido via um glice- raldeído 3-fosfato.

Descrição Detalhada

[0042] A conversão de aceto acetil-CoA a aceto acetato (Fig. 1) é uma etapa essencial em caminhos metabólicos com tais intermediários incluindo, por exemplo, caminhos para a produção de 3-hidroxi butirato, acetona ou isopropanol (Fig. 2). Entretanto, nenhuma aceto acetil-CoA específica hidrolase é conhecida que possa produzir aceto acetato e regenerar CoA livre sem degradação de acetil-CoA, o substrato para a própria biossíntese de aceto acetil-CoA. A presente exposição provê a engenharia racional de uma 3-oxoácido Co-A transferase com especificidade de substrato aceto acetil-CoA (por exemplo, uma butirato aceto acetato CoA-transferase - SEQ ID NO: 1; uma acetato aceto acetato CoA-transferase - SEQ ID NO: 2; ou acetato CoA-transferase - SEQ ID NO: 3) a uma aceto acetil-CoA específica hidrolase e seu uso em caminhos metabólicos utilizando aceto acetato como um intermediário ou um produto final incluindo, por exemplo, caminhos para a síntese de 3- hidroxi butirato, acetona e/ou isopropanol. A enzima engenheirada tem uma maior atividade sobre aceto acetil-CoA versus acetil-CoA (por exemplo, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x, 50x, ou mais). A enzima engenheirada pode compreender: i) uma sequência de aminoácidos de uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase e ii) uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1, ou uma substituição de um resíduo de ácido glu- tâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 46 de SEQ ID NO: 3, ou uma substitui- ção de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspár- tico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 333 de SEQ ID NO: 5; e tem uma específica atividade aceto acetil-CoA hidro- lase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase. 3- oxo ácido CoA-transferases exemplares são listadas na Tabela 3 assim como a localização do resíduo de ácido glutâmico ativo que pode ser substituído para um resíduo de ácido aspártico para engenheirar uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA específica de hidrolase.

[0043] A aceto acetil-CoA hidrolase engenheirada aqui mostrada resolve o problema de que nenhuma aceto acetil-Coa específica para hidrolase é conhecida que possa produzir aceto acetato e regenerar CoA livre. Hidrolases tipo selvagem naturais são conhecidas aceitarem vários compostos CoA ácidos com atividades similares e podem ser esperadas serem muito difíceis de serem engenheiradas para tal especificidade. Assim, enzimas conhecidas e ocorrendo naturalmente com atividade aceto acetil-CoA hidrolase sugeridas previamente (ver, US 2010/0261237 A1) criam o problema de atividade ácido-CoA (por exemplo, acetil-CoA) hidrolase não específica. Tais enzimas destroem o precursor necessário para a formação de seu próprio substrato, isto é, geração de aceto acetil-CoA a partir de duas acetil-CoA por enzima tio- lase. Como um resultado, seu uso em caminhos metabólicos contendo ainda intermediários ácido-CoA é altamente ineficiente.

[0044] Adicionalmente, a aceto acetil-CoA hidrolase engenheirada aqui mostrada resolve o problema de requerer uma molécula receptora e processamento de um outro intermediário ácido-CoA. Apropriadas enzimas transferases para a remoção enzimática do grupo CoA de aceto acetil-CoA são tipicamente específicas. Entretanto, a reação requer uma molécula de ácido receptora e ainda rende um composto ácido- CoA que precisa ser processado para regeneração de CoA livre. Remoção de necessidade de uma molécula receptora permite a criação de caminhos simplificados, usualmente mais eficientes.

[0045] Além disso, transferases já descritas aceitaram aceto acetil- CoA como substrato tendo um valor Km para a molécula receptora que está acima de 10 mM que é cerca de 1000 vezes maior que o valor Km para o substrato doador aceto acetil-CoA. Assim a concentração de receptor é um fator limitante da reação transferase. Utilização de uma aceto acetil-CoA hidrolase engenheirada a partir de uma aceto acetil- CoA transferase (isto é, uma 3-oxo ácido CoA-transferase que aceita aceto acetil-CoA como um doador de CoA) tem o benefício adicionado de um Km muito baixo para o substrato aceto acetil-CoA. Isto permite hidrólise de aceto acetil-CoA com uma alta taxa de reação em baixas concentrações de substrato e por isso pode prevenir acumulação de aceto acetil-CoA e estabelecer uma "puxada" sobre a reação de bios- síntese de aceto acetil-CoA reversível mediada por tiolase, precedente. Uma vez que a reação de tiolase frequentemente representa uma etapa de limitação de taxa em uma biossíntese, um tal puxão pode ser altamente benéfico para o desempenho do inteiro caminho metabólico apropriado.

[0046] A invenção aqui mostrada tem particular importância no contexto de um micro-organismo tal como linhagem de Saccharomyces ce- revisiae que tem os genes piruvato descarboxilase (por exemplo, PDC1, PDC5 e PDC6) interrompidos e/ou suprimidos. Nesta linhagem, a reação catalisada por esta enzima, por exemplo, a conversão de piruvato a acetaldeído e CO2 não ocorre. O resultado de uma tal supressão é que acetaldeído não pode ser ainda reduzido por álcool desidrogenase para obter etanol e assim tal linhagem é julgada nula de etanol. Um efeito secundário de uma tal supressão é que uma tal linhagem também não produz ácido acético, o que no caminho de 2-propanol aqui descrito (ver, por exemplo, Tabela 3 e Figuras 4 e 5), é um receptor essencial para uma CoA que é transferida de aceto acetil-CoA quando ela é con- vertida a aceto acetato por uma transferase. Assim, na ausência de um receptor CoA para uma tal reação, é impossível remover a CoA de aceto acetil-CoA, e o caminho não pode avançar para 2-propanol. Linhagens de leveduras nulas para piruvato descarboxilase modificadas para produzir 2-propanol assim requer tanto acetato exógeno para receber a CoA de aceto acetil-CoA, como requer a atividade de uma enzima tal como uma hidrolase para remoção de uma tal CoA de aceto acetil-CoA. A hidrolase assim proposta tem aplicação prática no contexto de uma tal linhagem que é incapaz de produzir ácido acético, mas requer uma maneira para converter aceto acetil-CoA a aceto acetato.

[0047] Micro-organismos aqui mostrados com uma aceto acetil-CoA engenheirada específica para hidrolase também podem ser modificados para terem uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato ou uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição de uma enzima que descarboxila piruvato. Em uma modalidade, a interrupção em uma ou mais enzimas que descarboxilam pi- ruvato é uma supressão ou um mutação. Ainda em uma modalidade, a uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato incluem pdc 1, pdc 5, e/ou pdc6, e o um ou mais fatores de transcrição da uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato incluem pdc2. O micro-organismo adicionalmente pode compreender um ou mais polinucleotídeos exógenos codificando uma ou mais enzimas em caminhos para a coprodução de 1-propanol e/ou 2-propanol a partir de uma fonte de carbono fermentá- vel sob condições anaeróbicas.

[0048] Como aqui usado, o termo "atividade biológica" ou "atividade funcional", quando referindo-se a uma proteína, polipeptídeo ou peptí- deo, pode significar que a proteína, polipeptídeo ou peptídeo exibe uma funcionalidade ou propriedade que é útil como relacionando-se a algum processo, caminho ou reação biológica. Atividade biológica ou funcional pode referir-se a, por exemplo, uma habilidade para interagir ou associar com (por exemplo, ligar a) um outro polipeptídeo ou molécula, ou pode referir-se a uma habilidade para catalisar ou regular a interação de outras proteínas ou moléculas (por exemplo, reações enzimáticas).

[0049] Como aqui usado, o termo "cultura" pode referir-se a crescimento de uma população de células, por exemplo, células microbianas, sob condições apropriadas para crescimento, em um meio líquido ou sólido.

[0050] Como aqui usado, o termo "derivado de" pode abranger os termos originado de, obtido de, obtenível de, isolado de, e criado de, e genericamente indica que um material especificado encontra sua origem em um outro material especificado ou tem características que podem ser descritas com referência ao outro material especificado.

[0051] Como aqui usado, "polinucleotídeo exógeno" refere-se a qualquer ácido desoxirribonucleico que se origina fora do micro-organismo.

[0052] Como aqui usado, o termo "um vetor de expressão" pode referir-se a uma construção de DNA contendo uma sequência de poli- nucleotídeos ou ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo ou proteína, tal como uma sequência codificando DNA (por exemplo, sequência de gene) que está operavelmente ligada a uma ou mais sequência(s) controle apropriada capaz de afetar expressão da sequência codificante em um hospedeiro. Tais sequências controles incluem um promotor para afetar transcrição, uma sequência operadora para controlar tal transcrição, uma sequência codificando apropriados sítios de ligação de ri- bossoma mRNA, e sequências que controlam término de transcrição e tradução. O vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, partícula fago, cromossoma artificial bacteriano, ou simplesmente uma inserção genô- mica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro apropriado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma hospe- deiro (por exemplo, vetor ou plasmídeo independente), ou pode, em alguns exemplos, integrar no próprio genoma (por exemplo, vetor integrado). O plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor de expressão. Entretanto, a exposição é pretendida incluir tais outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que são, ou se tornam, conhecidos na técnica.

[0053] Como aqui usado, o termo "expressão" pode se referir ao processo através do qual um polipeptídeo é produzido baseado em uma sequência de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos (por exemplo, um gene). O processo inclui ambas, transcrição e tradução.

[0054] Como aqui usado, o termo "gene" pode se referir a um segmento de DNA que está envolvido em produção de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, proteína de fusão) e inclui regiões precedendo e seguindo as regiões codificantes assim como sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos codificantes individuais (éxons).

[0055] Como aqui usado, o termo "heterólogo", com referência a um ácido nucleico, polinucleotídeo, proteína ou peptídeo, pode referir-se a um ácido nucleico, polinucleotídeo, proteína ou peptídeo que não ocorre naturalmente em uma célula especificada, por exemplo, uma célula hospedeira. É pretendido que o termo abranja proteínas que são codificadas por genes ocorrendo naturalmente, genes que sofreram mutação, e/ou genes sintéticos. Em contraste, o termo homólogo, com referência a um ácido nucleico, polinucleotídeo, proteína ou peptídeo, refere-se a um ácido nucleico, polinucleotídeo, proteína ou peptídeo que ocorre naturalmente na célula.

[0056] Como aqui usado, o termo uma "célula hospedeira" pode referir-se a uma célula ou linha de células, incluindo uma célula tal como um micro-organismo no qual um vetor de expressão recombinante pode ser transfectado para expressão de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, proteína de fusão). Células hospedeiras incluem progênie de uma célula hospedeira simples, e a progênie pode não ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico total) à célula parente original devido à mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira pode incluir células transfectadas ou transformadas in vivo com um vetor de expressão.

[0057] Como aqui usado, o termo "introduzida", no contexto de inserção de uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de poli- nucleotídeos em uma célula, pode incluir transfecção, transformação, ou transdução e refere-se à incorporação de uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência de polinucleotídeos em uma célula eucariótica ou procariótica onde a sequência de ácidos nucleicos ou sequência de polinucleotídeos pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertida em um replicon autônomo, ou expressa transientemente.

[0058] Como aqui usado, o termo "não ocorrendo naturalmente" ou "modificado" quando usado em referência a um organismo microbiano ou micro-organismo da invenção é pretendido para significar que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética não encontrada normalmente em uma linhagem ocorrendo naturalmente das espécies referidas, incluindo linhagens tipo selvagem das espécies referidas. Alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações introduzindo ácidos nucleicos que podem ser expressos codificando polipeptí- deos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, supressões de ácido nucleico e/ou outra interrupção funcional do material genético de or-ganismo microbiano. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões codificantes e seus fragmentos funcionais, para polipeptídeos heterólo- gos, homólogos ou ambos heterólogos e homólogos para as espécies referidas. Adicionais modificações incluem, por exemplo, regiões reguladoras não codificantes nas quais as modificações alteram expressão de um gene ou óperon. Organismos microbianos não ocorrendo natu- ralmente da exposição podem conter alterações genéticas estáveis, que referem-se a micro-organismos que podem ser cultivados por mais que cinco gerações sem perda da alteração. Genericamente, alterações geneticamente estáveis incluem modificações que persistem mais que 10 gerações, modificações particularmente estáveis persistirão por mais que cerca de 25 gerações, e mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão maiores que 50 gerações, incluindo indefinidamente. Aqueles versados na técnica entenderão que as alterações genéticas, incluindo modificações metabólicas aqui exemplificadas, são descritas com referência a um apropriado organismo hospedeiro tal como E. coli e suas correspondentes reações metabólicas ou um apropriado organismo fonte para desejado material genético tais como genes para um desejado caminho metabólico. Entretanto, dado o completo sequencia- mento de genoma de uma ampla variedade de organismos e o alto nível de conhecimento na área de genômica, aqueles versados na técnica serão facilmente capazes de aplicar os ensinamentos e orientação aqui providos para essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas de E. coli aqui exemplificadas podem ser facilmente aplicadas a outras espécies através de incorporação de mesmo ou análogo ácido nucleico codificante de outras espécies que não as espécies referidas. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de espécies homólogas, em geral, e em particular, ortólogos, parálogos ou deslocamentos de gene não ortólogo.

[0059] Como aqui usado, o termo "ligado operavelmente" pode se referir a uma justaposição ou arranjo de elementos especificados que permite os mesmos desempenharem em concerto para ocasionarem um efeito. Por exemplo, um promotor pode estar operavelmente ligado a uma sequência codificante se ele controla a transcrição da sequência codificante.

[0060] Como aqui usado, "1-propanol" é pretendido significar n- propanol com uma fórmula genérica CH3CH2CH2OH (CAS number-7123-8).

[0061] Como aqui usado, "2-propanol" é pretendido significar álcool isopropílico com uma fórmula genérica CH3CH3CHOH (CAS number- 67-63-0).

[0062] Como aqui usado, o termo "um promotor" pode se referir a uma sequência reguladora que está envolvida em ligação de RNA poli- merase para iniciar transcrição de um gene. Um promotor pode ser um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Um promotor induzível é um promotor que é ativo sob condições reguladoras ambientais ou desenvolvimentais.

[0063] Como aqui usado, o termo "um polinucleotídeo" ou "sequência de ácidos nucleicos" pode se referir a uma forma polimérica de nu- cleotídeos de qualquer comprimento e qualquer estrutura tridimensional e de fita simples ou múltiplas (por exemplo, fita simples, fita dupla, hélice tripla, etc.), que contém desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou formas análogas ou modificadas de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, incluindo nucleotídeos ou bases modificados ou seus análogos. Tais sequências de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos podem codificar aminoácidos (por exemplo, polipeptídeos ou proteínas tais como proteínas de fusão). Devido ao código genético ser degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um particular aminoá- cido, e a presente exposição abrange polinucleotídeos que codificam uma particular sequência de aminoácidos. Qualquer tipo de nucleotídeo modificado ou análogo de nucleotídeo pode ser usadoa, tanto quanto o polinucleotídeo retenha a desejada funcionalidade sob condições de uso, incluindo modificações que aumentam resistência à nucleasse (por exemplo, desoxi, 2’-O-Me, fosforotioatos, etc.). Marcadores também podem ser incorporados para propósitos de detecção ou captura, por exemplo, marcadores radioativos ou não radioativos ou âncoras, por exemplo, biotina. O termo polinucleotídeo também inclui ácidos nuclei- cos peptídeos (PNA). Polinucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou não ocorrendo naturalmente. Os termos polinucleotídeo, ácido nu- cleico e oligonucleotídeo são aqui usados intercambiavelmente. Polinu- cleotídeos podem conter RNA, DNA, ou ambos, e/ou suas formas modificadas e/ou seus análogos. Uma sequência de nucleotídeos pode estar interrompida por componentes não nucleotídeos. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não são limitados a, modalidades onde fosfato é substituído por P(O)S (tioato), P(S)S (ditioa- to), (O)NR2 (amidato), P(O)R, P(O)OR’, COCH2 (formacetal), onde cada R ou R’ é independentemente H, ou alquila (1-20 C) substituído ou não substituído opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), arila, alque- nila, ciclo alquila, ciclo alquenila, ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Polinucleotídeos podem ser lineares ou circulares ou compreenderem uma combinação de porções lineares e circulares.

[0064] Como aqui usado, o termo uma "proteína" ou "polipeptídeo" pode referir-se a uma composição compreendida por aminoácidos e reconhecida como uma proteína por aqueles versados na técnica. O código de três letras ou uma letra convencional para resíduos de ami- noácidos é aqui usado. Os termos proteína e polipeptídeo são aqui usados intercambiavelmente para referirem-se a polímeros de aminoá- cidos de qualquer comprimento, incluindo aqueles compreendendo pep- tídeos/polipeptídeos ligados (por exemplo, fundidos) (por exemplo, proteínas de fusão). O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de ami- noácido que foi modificado naturalmente ou através de intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetila- ção, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também incluídos na definição são, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica.

[0065] Como aqui usado, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos relacionados podem abranger proteínas, polipeptídeos ou peptídeos variantes. Proteínas, polipeptídeos ou peptídeos variantes diferem de uma proteína, polipeptídeos ou peptídeo parente e/ou uns dos outros através de um pequeno número de resíduos de aminoácidos. Em algumas mo-dalidades, o número de resíduos de aminoácidos diferentes é qualquer um de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50. Em algumas modalidades, variantes diferem por cerca de 1 a cerca de 10 ami- noácidos. Alternativamente ou adicionalmente, variantes podem ter um grau especificado de identidade de sequência com uma proteína ou ácido nucleico referência, por exemplo, como determinado usando uma ferramenta de alinhamento de sequência, tal como BLAST, ALIGN, e CLUSTAL (ver, infra). Por exemplo, proteínas ou ácido nucleico variante podem ter pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mesmo 99,5% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência referência.

[0066] Como aqui usado, o termo "recuperado", "isolado", "purificado", e "separado" pode se referir a um material (por exemplo, uma proteína, peptídeo, ácido nucleico, polinucleotídeo ou célula) que é removido de pelo menos um componente como qual ele está naturalmente associado. Por exemplo, estes termos podem se referir a um material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o mesmo como encontrado em seu estado nativo, tal como, por exemplo, um sistema biológico intacto.

[0067] Como aqui usado, o termo "recombinante" pode se referir a sequências de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, polipeptídeos ou proteínas, e células baseadas nas mesmas, que foram manipuladas pelo homem de modo que elas não são as mesmas como ácidos nu- cleicos, polipeptídeos, e células como encontradas na natureza. Re- combinante também pode se referir a material genético (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, os polipeptídeos ou proteínas que elas codificam, e vetores e células compreendendo tais sequências de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos) que foi modifi-cado para alterar sua sequência ou características de expressão, tal como através de mutação de sequência codificante para produzir um polipeptídeo alterado, fundindo a sequência codificante àquela de uma outra sequência codificante ou gene, colocação de um gene sob o controle de um diferente promotor, expressão de um gene em um organismo heterólogo, expressão de um gene em níveis diminuídos ou elevados, expressão de um gene condicionalmente ou constitutivamente em maneiras diferentes de seu perfil de expressão natural, e semelhantes.

[0068] Como aqui usado, o termo "marcador seletivo" ou "marcador selecionável" pode se referir a um gene capaz de expressão em uma célula hospedeira que permite facilidade de seleção daqueles hospedeiros contendo uma sequência de ácidos nucleicos, polinucleotídeo ou vetor introduzida. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem mas não são limitados a substâncias antimicrobianas (por exemplo, higromi- cina, bleomicina, ou cloranfenicol) e/ou genes que transferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional, sobre a célula hospedeira.

[0069] Como aqui usado, o termo "substancialmente anaeróbico" significa que crescimento do micro-organismo modificado ocorre em meios de cultura que compreendem uma concentração de oxigênio dissolvido de menos que 5 ppm.

[0070] Como aqui usado, os termos "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nu- cleicos, polinucleotídeos, proteínas ou polipeptídeos podem significar que um ácido nucleico, polinucleotídeo, proteína ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mesmo 99,5% de identidade de sequência, em comparação com um ácido nucleeico, polinucleotídeo, proteína ou polipeptídeo de referência (por exemplo, tipo selvagem). Identidade de sequência pode ser determinada usando- se programas conhecidos como BLAST, ALIGN, e CLUSTAL usando parâmetros padrões. (Ver, por exemplo, Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10915; Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873; e Higgins et al. (1988) Gene 73:237). Suporte lógico para modalidade de análises BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Também, bases de dados podem ser pesquisadas usando FASTA (Person et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448). Em algumas modalidades, polipeptídeos substancialmente idênticos diferem somente por uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos. Em algumas modalidades, polipeptídeos substancialmente idênticos são imunologicamente reativos cruzados. Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico substancialmente idênticas hibridizam umas às outras sob condições rigorosas (por exemplo, dentro de uma faixa de rigorosidade de média a alta).

[0071] Como aqui usado, o termo "transfecção" ou "transformação" pode se referir à inserção de um ácido nucleico ou polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira. O ácido nucleico ou polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira. O termo transfectando ou transfecção é pretendido abranger todas as técnicas convencionais para introdução de ácido nucleico ou polinucleotídeo em células hospedeiras. Exemplos de técnicas de transfecção incluem, mas não são limitadas a, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada com DEAE-dextrano, lipofecc- ção, eletroporação, e microinjeção.

[0072] Como aqui usado, o termo "transformado", "estavelmente transformado", e "transgênico" pode se referir a uma célula que tem uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência de polinucleotídeos não nativa (por exemplo, heteróloga) integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissomal que é mantido através de múltiplas gerações.

[0073] Como aqui usado, o termo "vetor" pode se referir a uma sequência de polinucleotídeos projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de células. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores lançadores, plasmídeos, partículas de fagos, cassetes de fita simples e dupla e semelhantes.

[0074] Como aqui usado, o termo proteína "tipo selvagem", "nativa" ou "ocorrendo naturalmente" pode se referir àquelas proteínas encontradas em natureza. Os termos sequência tipo selvagem refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos que é encontrada na natureza ou ocorrendo naturalmente. Em algumas modalidades, uma sequência tipo selvagem é o ponto de partida de um projeto de engenharia de proteína, por exemplo, produção de proteínas variantes.

[0075] A menos que aqui definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como co- mumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta exposição pertence. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) provêm aqueles versados com um dicionário genérico de muitos dos termos usados nesta exposição. Ainda, será entendido que qualquer um dos substratos mostrados em qualquer dos presentes caminhos alternativamente pode incluir o ânion ou o cátion do substrato.

[0076] Faixas numéricas aqui providas são inclusivas dos números definindo a faixa.

[0077] A menos que indicado de outro modo, sequências de ácidos nucleicos, são escritas da esquerda para direita em orientação 5’ para 3’; sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para direita em orientação amino para carbóxi, respectivamente.

[0078] Embora a presente exposição seja capaz de ser realizada em várias formas, a descrição abaixo de várias modalidades é feita com o entendimento de que a presente exposição é para ser considerada como uma exemplificação da exposição, e não é pretendida limitar a exposição das específicas modalidades ilustradas. Títulos são providos somente por conveniência e não são para serem construídos para limitação de exposição em qualquer maneira. Modalidades ilustradas sob qualquer título podem ser combinadas com modalidades ilustradas sob qualquer outro título.

[0079] O uso de valores numéricos nos vários valores quantitativos especificados neste pedido de patente, a menos que expressamente indicado de outro modo, é estabelecido com aproximações como pensadas os valores mínimo e máximo dentro de faixas estabelecidas onde ambos precedidos pela palavra "cerca". Também, a exposição de faixas é pretendida como uma faixa contínua incluindo cada valor entre os valores mínimo e máximo recitados assim como quaisquer faixas que possam ser formadas por tais valores. Também são aqui mostradas quaisquer e todas razões (e faixas de quaisquer tais razões) que podem ser formadas através de divisão de um valor numérico mostrado em qualquer outro valor numérico mostrado. Da mesma maneira, aqueles versados na técnica apreciarão que muitas tais razões, faixas e faixas de razões podem ser inequivocamente derivadas dos valores numéricos aqui apresentados e em todos os exemplos tais razões, faixas e faixas de razões representam várias modalidades da presente exposição.

Engenharia de aceto acetil-CoA hidrolase

[0080] Uma transferase com especificidade de substrato aceto ace- til-CoA pode ser engenheirada para produzir uma hidrolase específica para aceto acetil-CoA. A exposição contempla que qualquer processo conhecido na técnica pode ser usado para modificar uma transferase com especificidade para substrato aceto acetil-CoA incluindo, por exemplo, mutagênese direcionada de sítio. Em uma modalidade, a transferase com especificidade de substrato aceto acetil-CoA pode ser modificada para compreender uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição corres-pondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1. A enzima en- genheirada ainda pode ser submetida à mutagênese (por exemplo, mu- tagênese randômica) para ainda aumentar sua atividade hidrolase.

[0081] A presente exposição também provê um processo de engenharia de uma enzima tendo especificidade de substrato aceto acetil- CoA e atividade hidrolase específica para aceto acetil-CoA, o processo compreendendo: a) seleção de uma enzima tendo atividade aceto ace- til-CoA transferase, e b) substituição de um resíduo de ácido glutâmico para um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1 na enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase para produzir uma enzima engenheira.

[0082] Em uma modalidade da exposição, um sítio ativo de resíduo de ácido glutâmico em posição 46 de SEQ ID NO: 3, ou um sítio ativo de resíduo de ácido glutâmico em posição 333 de SEQ ID NO: 5, está substituído com um resíduo de aspartato usando mutagênese direcionada de sítio para gerar uma CoA hidrolase (isto é, uma tioesterase com maior atividade sobre aceto acetil-CoA versus acetil-CoA.

[0083] Alternativamente, em uma modalidade da exposição uma aceto acetil-CoA hidrolase pode ser engenheirada a partir de uma transferase através de evolução direcionada. Em um processo exemplar, bibliotecas de aceto acetil-CoA transferases pelo menos parcialmente randomicamente mutadas são criadas e um mutante com a desejada atividade hidrolase é identificado através de apropriados processos de separação e seleção (isto é, detecção de CoA livre após contato de variante de enzima com aceto acetil-CoA, mas sem molécula receptora). Um tal processo pode resultar em outras mutações que não uma troca do resíduo de ácido glutamato ativo para resultar em atividade hidro- lase. Por exemplo, a estrutura tridimensional da proteína pode ser mudada em uma maneira tal que a distância entre substrato e grupo ácido do resíduo de ácido glutâmico ativo é aumentada para a mesma extensão como em uma substituição do ácido glutâmico ativo com um resíduo de ácido aspártico, com efeitos similares sobre atividade de enzima.

[0084] Será apreciado por aqueles versados na técnica que o sítio ativo de resíduo de glutamato de uma enzima com atividade aceto ace- til-CoA transferase pode ser facilmente identificado em qualquer transferase conhecida (ver, Tabela 1) através de alinhamento de sequências de tal enzima com SEQ ID NO: 1 e que qualquer transferase conhecida pode ser modificada para produzir uma aceto acetil-CoA específica de hidrolase. Um tal alinhamento permite a identificação do resíduo de ácido glutâmico em uma posição correspondendo à posição de aminoáci- do 51 de SEQ ID NO: 1 a ser substituído com um resíduo de ácido as- pártico. Também será apreciado que nem todas as transferases podem aceitar aceto acetil-CoA como um substrato. Como tal, aquelas transferases que podem aceitar aceto acetil-CoA como um substrato são preferidas para uso nos processos da exposição. Opcionalmente, a aceto acetil-CoA engenheirada específica para hidrolase ainda pode ser modificada através de quaisquer processos conhecidos na técnica incluindo, através de mutagênese randômica, para aumentar a atividade hidro- lase.

[0085] Enzimas exemplares apropriadas para aceitar aceto acetil- CoA como substrato são mostradas na Tabela 2 e são encontradas entre a subfamília de transferases atuando em 3-oxo ácidos (Tabela 1). Estas enzimas podem ser engenheiradas para não consumirem a quantidade equimolar da molécula de ácido receptora como cosubstrato, mas ao invés realizam a hidrólise do tio éster ligado e liberam aceto acetato e Coenzima A livre (HCoA) como produtos. Com a exceção de Uniprot No. P37766 (esta sequência é uma fusão de uma subunidade alfa e beta). A Tabela 1 lista a subunidade beta de uma CoA-trans- ferase. CoA-transferases são compreendidas por uma subunidade alfa e uma subunidade beta, e como tal, aquelas subunidades beta listadas na Tabela 1 têm de ser combinadas com uma subunidade alfa de modo a produzir uma CoA-transferase cataliticamente ativa. Será entendido que as subunidades beta de CoA-transferase listadas na Tabela 1 podem ser combinadas com qualquer subunidade alfa de CoA-transferase que proporcione a combinação da subunidade beta e subunidade alfa cataliticamente ativa. Tabela 1: 3-oxo ácido CoA-transferases exemplares (Parte 1)

Tabela 1: 3-oxo ácido CoA-transferases exemplares (Parte 2)

Tabela 2. 3-oxo ácido CoA transferases exemplares capazes de aceitar aceto acetil-CoA como substrato

Tabela 2. Continuação

Modificação de Micro-organismo

[0086] Um micro-organismo pode ser modificado (por exemplo, en- genheirado geneticamente) através de qualquer processo conhecido na técnica para compreender e/ou expressar um ou mais polinucleotídeos codificando para enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de uma fonte de carbono fermentável a um ou mais produtos. Tal microorganismo pode compreender um polinucleotídeo codificando uma enzima engenheirada tendo especificidade para substrato aceto acetil- CoA e atividade aceto acetil-CoA específica hidrolase (por exemplo, uma enzima que compreende i) uma sequência de aminoácidos de uma enzima tendo atividade aceto acetil CoA transferase e ii) uma substitui- ção de um resíduo de ácido glutâmico por um resíduo de ácido aspárti- co em uma posição correspondendo a aminoácido de posição 51 de SEQ ID NO: 1).

[0087] Caminhos que utilizam uma enzima engenheirada tendo especificidade de substrato aceto acetil-CoA e atividade aceto acetil-CoA específica hidrolase são mostrados abaixo. Tais caminhos são meramente exemplares e representam uns poucos dos caminhos nos quais a enzima engenheirada aqui mostrada pode ser explorada para catalisar a conversão de uma fonte de carbono fermentável a um ou mais produtos finais desejados.

[0088] Em algumas modalidades, um micro-organismo pode ser modificado (por exemplo, geneticamente engenheirado) através de qualquer processo conhecido na técnica para compreender e/ou expressar um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um cami-nho que catalisa a conversão de uma fonte de carbono fermentável a intermediários em um caminho para a coprodução de 1-propanol e 2- propanol. Tais enzimas podem incluir qualquer uma daquelas enzimas mostradas em Figuras 4 ou 5. Por exemplo, o micro-organismo pode ser modificado para compreender um ou mais polinucleotídeos codifi-cando enzimas que catalisam uma conversão de di-hidroxiacetona fosfato ou piruvato a 1-propanol.

[0089] Em algumas modalidades, o micro-organismo pode compreender um ou mais polinucleotídeos exógenos codificando uma ou mais enzimas em caminhos para a coprodução de 1-propanol e 2-propanol a partir de uma fonte de carbono fermentável sob condições anaeróbicas.

[0090] Em algumas modalidades, o micro-organismo pode compre-ender um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de piruvato a 2-propanol incluindo, por exemplo, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de piruvato a acetil-CoA, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetil-CoA a aceto acetil-CoA, um ou mais polinucleotí- deos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de aceto acetil-CoA a aceto acetato, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de aceto acetato a acetona, e/ou um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetona a 2- propanol. Enzimas catalisando qualquer uma dessas conversões podem incluir, por exemplo, aquelas enzimas listadas na Tabela 3.

[0091] Em algumas modalidades, o micro-organismo não ocorrendo naturalmente pode compreender um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de di- hidroxiacetona fosfato a 1-propanol incluindo, por exemplo: um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de di-hidroxiacetona fosfato a metil glioxal, um ou mais poli- nucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de metil glioxal a hidroxi acetona, um ou mais polinucleotí- deos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de hidroxi acetona a 1,2-propanodiol, um ou mais polinucleotídeos codi-ficando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de metil glioxal a lactaldeído, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactaldeído a 1,2- propanodiol, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de 1,2-propanodiol a propionalde- ído, e/ou um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de propionaldeído a 1-propanol. Enzimas catalisando qualquer uma destas conversões podem incluir, por exemplo, aquelas enzimas listadas na Tabela 4.

[0092] Em algumas modalidades, o micro-organismo não ocorrendo naturalmente pode compreender um ou mais polinucleotídeos codifi- cando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactato a 1-propanol incluindo, por exemplo, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactato a lactoil-CoA, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactoil-CoA a lactaldeído, um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactaldeído a 1,2-propanodiol, um ou mais poli- nucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de 1,2-propanodiol a propionaldeído, e/ou um ou mais poli- nucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de propionaldeído a 1-propanol. Enzimas catalisando qualquer uma destas conversões podem incluir, por exemplo, aquelas enzimas listadas na Tabela 5.

[0093] Um micro-organismo modificado como aqui provido pode compreender:

[0094] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactato a piruvato,

[0095] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de piruvato a acetil-CoA citossóli- ca,

[0096] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetil-CoA a aceto acetil-CoA,

[0097] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de aceto acetil-CoA a AcAcetato,

[0098] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de AcAcetato a acetona,

[0099] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetona a 2-propanol,

[00100] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de di-hidroxiacetona fosfato a me- til glioxal,

[00101] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de metil glioxal a lactaldeído,

[00102] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de metil glioxal a hidroxi acetona,

[00103] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de hidroxi acetona a 1,2-propa- nodiol,

[00104] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactaldeído a 1,2-propanodiol,

[00105] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de 1,2-propanodiol a propional- deído, e/ou

[00106] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de propionaldeído a 1-propanol.

[00107] Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado tem uma interrupção em cada um ou mais polinucleotídeos que codificam enzimas que descarboxilam piruvato e associado fator de transcrição (por exemplo, piruvato descarboxilase 1, 2, 5, e 6). Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado é capaz de crescer sobre uma fonte de carbono C6 sob condições anaeróbicas. Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado tem uma interrupção em cada um ou mais polinucleotídeos que codificam enzimas que descarboxilam piruvato e associado fator de transcrição (por exemplo, piruvato descar- boxilase 1, 2, 5, e 6) e é capaz de crescimento sobre uma fonte de carbono C6 sob condições anaeróbicas.

[00108] Um micro-organismo modificado como aqui provido pode compreender:

[00109] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de piruvato a lactato,

[00110] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactato a lactoil-CoA,

[00111] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactoil-CoA a lactaldeído,

[00112] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactato e acetil-CoA a lactoil- CoA e ácido acético;

[00113] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de lactaldeído a 1,2-propanodiol,

[00114] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de 1,2-propanodiol a propional- deído,

[00115] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de propionaldeído a 1-propanol,

[00116] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de piruvato a acetil-CoA,

[00117] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetil-CoA a aceto acetil-CoA,

[00118] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de aceto acetil-CoA a AcAcetato,

[00119] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de AcAcetato a acetona, e/ou

[00120] - um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetona a 2-propanol.

[00121] Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado tem uma interrupção em cada um ou mais polinucleotídeos que codificam enzimas que descarboxilam piruvato (por exemplo, piruvato des- carboxilase 1, 5, e 6). Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado é capaz de crescer sobre uma fonte de carbono C6 sob condições anaeróbicas. Em algumas modalidades, o micro-organismo modificado tem uma interrupção em cada um ou mais polinucleotídeos que codificam enzimas que descarboxilam piruvato (por exemplo, pi- ruvato descarboxilase 1, 5, e 6) e é capaz de crescer sobre uma fonte de carbono C6 sob condições anaeróbicas.

[00122] Enzimas exemplares que convertem uma fonte de carbono fermentável como glicose a 1-propanol (Caminhos B e C) e/ou 2- propanol (Caminho A) incluindo substratos enzimas, e produtos de reação de enzimas associados com as conversões são apresentados em Tabelas 3 a 5 abaixo. O identificador de referência de enzima listado em Tabelas 3 a 5 correlaciona com a numeração de enzimas usada em Figuras 4 e 5, que representam esquematicamente a conversão enzimáti- ca de uma fonte de carbono fermentável tal como glicose a di- hidroxiacetona fosfato ou lactato e piruvato. Di-hidroxiacetona fosfato ou lactato e piruvato ainda podem ser convertidos a 1-propanol e/ou 2- propanol, usando qualquer combinação daquelas enzimas providas em Tabelas 3 a 5 acima incluindo, todas aquelas enzimas como providas em Tabela 3 a 5 abaixo. Tabela 3. Caminho A (2-propanol a partir de piruvato)

Tabela 4. Caminho B (1-propanol de Di-hidroxiacetona fosfato

Tabela 5: Caminho C (1-propanol a partir de lactato)

*enzima com função homóloga mas especificidade para substrato alterada é requerida/preferida

[00123] O micro-organismo por ser um archea, bactéria, ou eucario ta. Em algumas modalidades, as bactérias são Propionibacterium, Pro- pionispira, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Pelobacter, ou Lactobacillus incluindo, por exemplo, Pelobacter propionicus, Clostridium propio- nicum, Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus, Propionibacterium acidipropionici ou Propionibacterium freudenreichii. Em algumas moda-lidades, o eucariota é uma levedura, fungo filamentoso, protozoa, ou algae. Em algumas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevi- siae, Kluyveromyces lactis ou Pichia pastoris.

[00124] Em algumas modalidades, o micro-organismo é adicionalmente modificado para compreender um ou mais mecanismos de tolerância incluindo, por exemplo, tolerância a uma molécula produzida (isto é, metil glioxal, 1-propanol, 2-propanol, ou butadieno), e/ou solventes orgânicos. Um micro-organismo modificado para compreender um tal mecanismo de tolerância pode prover um meio para aumentar títulos de fermentações e/ou pode controlar contaminação em um processo em escala industrial.

[00125] A presente exposição também provê micro-organismos (por exemplo, S. cerevisiae) para a coprodução de 2-propanol e 1-propanol e/ou 1,2-propanodiol. Micro-organismos podem ser modificados de modo que eles podem coproduzir 2-propanol e 1-propanol e/ou 1,2- propanodiol. Em uma modalidade, um micro-organismo pode ter sua produção nativa de etanol reduzida ou eliminada (isto é, desligada). Em uma modalidade, para eliminar produção de etanol no micro-organismo a atividade de piruvato descarboxilase (isto é, a enzima que descarboxi- la piruvato e no processo fabrica acetaldeído e CO2) pode ser interrompida incluindo, por exemplo, nocaute. Piruvato descarboxilase surge em três isoformas em levedura e sua atividade pode ser na maioria das vezes nocauteada através de supressão de genes PDC1, PDC5, e PDC6. Sem desejar ser preso por uma teoria da invenção, a eliminação da atividade piruvato descarboxilase no citoplasma de célula torna a célula de levedura incapaz de crescer sob condições anaeróbicas devido a dois fatores: (1) a falta de uma rota alternativa para produção citoplásmica de acetil-CoA, devido à falta de acetaldeído que possa ser convertido a acetato e acetil-CoA; e (2) um desequilíbrio redox devido a excesso de NADH porque NADH não é mais oxidada na conversão de acetaldeído a etanol. Assim, é necessário alterar também a habilidade do microorganismo para importar glicose através de truncação de um fator de transcrição do importador de glicose chamado MTH1. Esta truncação então restaura a habilidade do micro-organismo mutante ΔPDC1,5,6 para sobreviver sobre açúcares C6. Em uma modalidade, um ou mais polinucleotídeos codificando uma piruvato formiato liase bacteriana ou complexo piruvato desidrogenase citossólico podem ser inseridos no micro-organismo para converter piruvato em Acetil CoA no citosol. Em uma modalidade, o micro-organismo pode ser modificado para compreender um ou mais polinucleotídeos que codificam enzimas em um caminho para a coprodução de 2-propanol e 1-propano e/ou 1,2- propanodiol. Ainda em uma modalidade, o micro-organismo pode ser modificado para compreender uma aceto acetil-CoA hidrolase. Uma tal aceto acetil-CoA hidrolase pode ser engenheirada a partir de uma aceto acetil-CoA:acetato transferase através de obtenção de uma mutação Glu-Asp simples na aceto acetil CoA:acetato transferase. Em uma modalidade adicional, um micro-organismo pode ser modificado para compreender um ou mais polinucleotídeos codificando uma desidratase in- dependente-B12a partir do organismo Roseburia inuvolurans para converter 1,2-propanodiol em propanaldeído. Micro-organismos que compreendem uma ou mais das modificações mostradas acima são chamados um micro-organismo não ocorrendo naturalmente ou um microorganismo modificado.

[00126] WO2004099425 mostra a superprodução de piruvato em S. cerevisiae através de nocaute de atividade piruvato descarboxilase e um processo de evolução direcionada que permitiu este mutante triplo crescer sobre glicose devido a uma truncação do fator de transcrição MTH1. Entretanto, o escopo interrompeu na superprodução de piruvato em sistemas de fermentação aeróbicos. O uso de oxigênio, neste contexto, foi essencial na medida em que há um enorme desenvolvimento de NADH na célula devido ao fato de que NADH não é mais oxidada na conversão de acetaldeído a etanol.

[00127] A presente exposição também provê micro-organismos modificados que compreendem: uma interrupção de uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato e/ou uma interrupção de um ou mais fatores de transcrição de uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato; uma modificação genética que diminui substancialmente importação de glicose no micro-organismo; um ou mais polinucleotídeos codificando aceto acetil-CoA específica para hidrolase como aqui mostrada, um ou mais polinucleotídeos codificando uma ou mais enzimas em um caminho que produz acetil-CoA citossólica; um ou mais polinucleotídeos codificando uma ou mais enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de acetil-CoA citossólica a 2-propanol; e um ou mais polinucleo- tídeos codificando uma ou mais enzimas em um caminho que catalisa uma conversão de di-hidroxiacetona fosfato a 1-propanol e/ou 1,2- propanodiol.

[00128] A presente exposição ainda compreende uma célula super- produzindo piruvato capaz de produzir acetil-CoA citossólica inserindo, por exemplo, piruvato formiato liase ou complexo piruvato desidroge- nase citossólico para conversão de piruvato em acetil-CoA no citosol da célula eucariótica. A inserção de piruvato formiato liase emuma linhagem de levedura negativa-PDC foi mostrada por Waks and Silver em Engineering a Synthetic Dual-Organism System for Hydrogen Production (Applied and Environmental Microbiology, vol. 75, n. 7, 2009, p. 1867-1875) sem sucesso em crescimento ou metabolismo anaeróbico. Além disso, a presente exposição ainda compreende uma célula super- produzindo piruvato capaz de produzir acetil-CoA citosólica e de crescer sob condições anaeróbicas através de provimento de uma pia redox temporária que permite reoxidação de NADH através de introdução de um gene codificando NAD(P)+ transidrogenase solúvel bacteriana (específica-Si) (gene udhA de E. coli, E.C. número 1.6.1.1) que catalisa a interconversão de NADP+ + NADH + NADPH + NAD+. A concomitante expressão das enzimas PFL e udhA para restaurar crescimento anae- róbico para a linhagem de levedura nula-PDC expressando MTH1 truncado constitui o primeiro relato de crescimento anaeróbico de uma linhagem de levedura nula-PDC e serve como um novo chassis eucarió- tico para a produção de compostos químicos produtos.

[00129] Em algumas modalidades, a exposição contempla a modificação (por exemplo, engenharia) de uma ou mais das enzimas aqui providas. Tal modificação pode ser realizada para redesenhar a especificidade de substrato da enzima e/ou para modificar (por exemplo, reduzir) sua atividade contra outros substratos de modo a aumentar sua seletividade para um dado substrato. Adicionalmente ou alternativamente, um ou mais enzimas como aqui providas podem ser engenheiradas para alterar (por exemplo, aperfeiçoamento incluindo, por exemplo, aumento de sua atividade catalítica ou sua especificidade de substrato) uma ou mais de suas propriedades, incluindo aceitação de diferentes cofatores como NADH ao invés de NADPH.

[00130] Em algumas modalidades, alinhamento de sequências e modelagem comparativa de proteínas podem ser usados para alteração de uma ou mais das enzimas aqui mostradas. Modelagem de homolo- gia ou modelagem comparativa referem-se a construção de um modelo de resolução atômica da proteína desejada a partir de sua sequência de aminoácidos primária e uma estrutura tridimensional de uma proteína similar. Este modelo pode permitir que o sítio de ligação de substrato de enzima seja definido, e a identificação de específicas posições de ami- noácidos que podem ser substituídos com outros aminoácidos naturais de modo a redesenhar sua especificidade de substrato.

[00131] Variantes ou sequências tendo substancial identidade ou homologia com os polinucleotídeos codificando enzimas como aqui mostrados podem ser utilizadas na prática da exposição. Tais sequências podem ser referidas como variantes ou sequências modificadas. Ou seja, uma sequência de polinucleotídeos pode ser modificada e ainda retendo a habilidade para codificar um polipeptídeo exibindo a desejada atividade. Tais variantes ou sequências modificadas assim são equivalentes no sentido de que elas retêm sua função pretendida. Genericamente, a variante ou sequência modificada pode compreender pelo menos cerca de 40%-60%, preferivelmente cerca de 60%-80%, mais preferivelmente cerca de 80%-90%, e mesmo mais preferivelmente cerca de 90%-95% de identidade de sequência com a sequência nativa.

[00132] Em algumas modalidades, um micro-organismo pode ser modificado para expressar, incluindo, por exemplo, superexpressar, uma ou mais enzimas como aqui providas. O micro-organismo pode ser modificado através de técnicas de engenharia genética (isto é, tecnologia recombinante), técnicas de microbiologia clássicas, ou uma combinação de tais técnicas e também incluem variantes genéticas ocorrendo naturalmente para produção de um micro-organismo geneticamente modificado. Algumas de tais técnicas são genericamente mostradas, por exemplo, em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press; e Selifonova et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67(8):3645).

[00133] Um micro-organismo geneticamente modificado pode incluir um micro-organismo no qual um polinucleotídeo foi inserido, suprimido ou modificado (isto é, mutado; por exemplo, através de inserção, su- pressão, substituição e/ou inversão de nucleotídeos), em uma maneira tal que tais modificações provêm o desejado efeito de expressão (Por exemplo, superexpressão) de uma ou mais enzimas como aqui providas dentro de micro-organismo. Modificações genéticas que resultam em um aumento em expressão ou função de gene podem ser referidas como amplificação, superprodução, superexpressão, ativação, aperfeiçoamento, adição, ou regulação ascendente de um gene. Adição de genes clonados para aumentar expressão de gene pode incluir manutenção de gene(s) clonado sobre plasmídeos replicantes ou integração de gene(s) clonado no genoma do organismo de produção. Além disso, aumento de expressão dos desejados genes clonados pode incluir ligação operativa de gene(s) clonado a elementos de controle de transcrição nativos ou heterólogos.

[00134] Onde desejado, a expressão de uma ou mais das enzimas aqui providas sob o controle de uma sequência reguladora que controla direta ou indiretamente a expressão da enzima em uma maneira dependente de tempo durante uma reação de fermentação.

[00135] Em algumas modalidades, um micro-organismo é transformado ou transfectado com um veículo genético tal como, um vetor de expressão compreendendo uma sequência de polinucleotídeos exógena codificando as enzimas aqui providas.

[00136] Construções de polinucleotídeos preparadas para introdução em um hospedeiro procariótico ou eucariótico pode tipicamente, mas nem sempre, compreender um sistema de replicação (isto é, vetor) reconhecido pelo hospedeiro, incluindo o pretendido fragmento de polinu- cleotídeo codificando o desejado polipeptídeo, e pode preferivelmente, mas não necessariamente, também incluir sequências reguladoras de iniciação de transcrição e tradução ligadas operavelmente ao segmento codificando polipeptídeo. Sistemas de expressão (vetores de expressão) podem incluir, por exemplo, uma origem de replicação ou sequên- cia replicando autonomamente (ARS) e sequências de controle de expressão, um promotor, um aperfeiçoador e necessários sítios de informação de processamento, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de remoção de RNA, sítios de poliadenilação, sequências termi- nadoras de transcrição, sequências de estabilização de mRNA, sequências de nucleotídeos homólogas para DNA cromossomal de hospedeiro, e/ou um sítio de clonagem múltipla. Peptídeos sinais também podem ser incluídos onde apropriado, preferivelmente a partir de poli- peptídeos secretados das mesmas ou relacionadas espécies, o que permite a proteína cruzar e/ou alojar em membranas de células ou ser secretada da célula.

[00137] Os vetores podem ser construídos usando processos padrões (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; e Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Co. N.Y, 1995).

[00138] A manipulação de polinucleotídeos da presente exposição incluindo polinucleotídeos codificando para uma ou mais das enzimas aqui mostradas é tipicamente realizada em vetores recombinantes. Numerosos vetores são publicamente disponíveis, incluindo plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, cromossomas artificiais, vetores epissomais e vetores de expressão de gene, todos os quais podem ser empregados. Um vetor de uso de acordo com a exposição pode ser selecionado para acomodar uma sequência codificando proteína de um tamanho desejado. Uma célula hospedeira apropriada é transformada com o vetor após manipulações de clonagem in vitro. Células hospedeiras podem ser procarióticas, tais como quaisquer de um número de linhagens bacterianas, ou podem ser eucarióticas, tal como uma levedura ou outras células de fungos, insetos ou células de anfíbios, ou células de mamíferos incluindo, por exemplo, células de roedores, símios ou humanos. Cada vetor contém vários componentes funcionais, que generi- camente incluem um sítio de clonagem, uma origem de replicação e pelo menos um gene marcador selecionável. Se dado vetor é um vetor de expressão, ele adicionalmente possui um ou mais do seguinte: elemento aperfeiçoador, promotor, terminação de transcrição e sequências sinais, cada um posicionado na vizinhança do sítio de clonagem, de modo que eles sejam operativamente ligados ao gene codificando um membro de repertório de polipeptídeo de acordo com a exposição.

[00139] Vetores, incluindo vetores de clonagem e expressão, podem conter sequências de ácidos nucleicos que permitem que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Por exemplo, a sequência pode ser uma que permita o vetor replicar independentemente do DNA cromossômico de hospedeiro e pode incluir origens de repli- cação ou sequências replicando autonomamente. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. Por exemplo, a origem de replicação a partir de plasmídeo pBR322 é apropriada para maioria de bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo de 2 micra é apropriada para levedura, e várias origens virais (por exemplo, SV 40, adenovírus) são úteis para vetores de clonagem em células mamíferas. Genericamente, a origem de replicação não é necessária para vetores de expressão mamíferos a menos que estes sejam usados em células mamíferas capazes de replicar altos níveis de DNA, tais como células COS.

[00140] Um vetor de clonagem ou expressão pode conter um gene de seleção também referido como um marcador selecionável. Este gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas em um meio de cultura seletivo. Células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção por isso não sobreviverão no meio de cultura. Típicos genes de seleção codificam proteínas que conferem resistência para antibióticos e outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, me- totrexato, higromicina, tiostreptom, apramicina ou tetraciclina, complemento de deficiências auxotróficas, ou suprimento de nutrientes críticos não disponíveis nos meios de crescimento.

[00141] A replicação de vetores pode ser realizada em E. coli (por exemplo, linhagem TB1 ou TG1, DH5α, DH10β, JM110). Um marcador selecionável - E. coli, por exemplo, o gene beta-lactamase que confere resistência para o antibiótico ampicilina, pode ser de uso. Estes marcadores selecionáveis podem ser obtidos de plasmídeos E. coli, tais como pBR322 ou um plasmídeo pUC tal como pUC18 ou pUC19, ou pUC119.

[00142] Vetores de expressão podem conter um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro. O promotor pode estar opera- velmente ligado a uma sequência codificante de interesse. Um tal pro-motor pode ser induzível ou constitutivo. Polinucleotídeos são opera- velmente ligados quando os polinucleotídeos estão em uma relação permitindo os mesmos funcionarem em sua maneira pretendida.

[00143] Promotores apropriados para uso com hospedeiros procarió- ticos podem incluir, por exemplo, os sistemas promotores α-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, o sistema promotor triptofano (trp), o promotor eritromicina, promotor apramicina, promotor hidromicina, promotor metilenomicina e promotores híbridos como o promotor tac. Além disso, hospedeiro constitutivo ou promotores induzíveis podem ser usados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão genericamente uma sequência Shine-Dalgarno ligada operavelmente à sequência codificante.

[00144] Promotores virais obtidos a partir dos genomas de vírus incluem promotores de vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (por exemplo, Adenovirus 2 ou 5), vírus de herpes simplex (promotor timidi- na cinase), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, cito- megalovírus, um retrovírus (por exemplo, MoMLV, ou RSV LTR), vírus de hepatite B, promotor de vírus sarcoma mieloproliferativo (MPSV), VISNA, e vírus de símio 40 (SV40). Promotores mamíferos heterólogos incluem, por exemplo, o promotor actina, promotor imunoglobulina, promotores de proteína de choque térmico.

[00145] Os promotores inicial e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição que também contém a origem viral SV40 de replicação (ver, por exemplo, Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); e Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano (CMV) é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hind III E (ver, por exemplo, Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)). Um promotor de ampla faixa de hospedeiro, tal como o promotor inicial SV40 ou LTR vírus sarcoma Rous, é apropriado para uso nos presentes vetores de expressão.

[00146] Genericamente, um promotor forte pode ser empregado para prover alto nível de transcrição e expressão do desejado produto. Entre os promotores eucarióticos que foram identificados como fortes promotores para alto nível de expressão estão o promotor inicial SV40, promotor tardio principal adenovírus, promotor metalotioneína-I de camundongo, repetição terminal longa de vírus de sarcoma Rous, e promotor inicial imediato de citomegalovírus humano (CMV ou CMV IE). Em uma modalidade, o promotor é um promotor inicial CMV ou um SV40.

[00147] Os promotores empregados podem ser constitutivos ou reguláveis, por exemplo, induzíveis. Promotores induzíveis exemplares incluem jun, fos e metalotioneína e promotores de choque térmico. Um ou ambos promotores das unidades de transcrição podem ser promotores induzíveis. Em uma modalidade, a GFP é expressa a partir de um promotor constitutivo enquanto um promotor induzível dirige transcrição do gene codificando uma ou mais enzimas como aqui mostradas e/ou o marcador selecionável amplificável.

[00148] A região reguladora de transcrição em eucariotas superiores pode compreender uma sequência aperfeiçoadora. Muitas sequências aperfeiçoadoras de genes de mamíferos são conhecidas, por exemplo, de genes globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína e insulina. Um apropriado aperfeiçoador é um aperfeiçoador de um vírus de uma célula eucariótica. Exemplos incluem o aperfeiçoador SV40 lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o aperfeiçoador do promotor inicial imediato de citomegalovírus (Boshart et al. Cell 41:521 (1985)), o aper- feiçoador polioma sobre o lado tardio da origem de replicação, e aper- feiçoadores adenovírus (ver também, por exemplo, Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos aperfeiçoadores para ativação de promotores eucarióticos). As sequências aperfeiçoadoras podem ser introduzidas no vetor em uma posição 5’ ou 3’ para o gene de interesse, mas estão preferivelmente localizadas em um sítio 5’ para o promotor.

[00149] Vetores de expressão mamíferos e leveduras podem conter sequências procarióticas que facilitam a propagação do vetor em bactérias. Por isso, o vetor pode ter outros componentes como uma origem de replicação (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas), genes de resistência a antibióticos para seleção em bactérias, e/ou um códon de interrupção âmbar que pode permitir tradução para leitura através de códon. Adicional gene(s) selecionável eucariótico pode ser incorporado. Genericamente, em vetores de clonagem a origem de replicação é uma que permite o vetor replicar independentemente do DNA cromossomal de hospedeiro, e inclui origens de replica- ção ou sequências de replicação autônomas. Tais sequências são bem conhecidas, por exemplo, a origem de replicação CoIE1 em bactérias. Várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células mamíferas. Gene-ricamente, um replicon eucariótico não é necessário para expressão em células mamíferas humanas a menos que replicação extracromossomal (epissomal) seja pretendida (por exemplo, a origem SV40 pode ser tipicamente usada somente porque ela contém o promotor inicial).

[00150] Para facilitar inserção e expressão de diferentes genes codificando as enzimas como aqui mostradas a partir das construções e vetores de expressão, as construções podem ser projetadas com pelo menos um sítio de clonagem para inserção de qualquer gene codificando qualquer enzima aqui mostrada. O sítio de clonagem pode ser um sítio de clonagem múltiplo, por exemplo, contendo múltiplos sítios de restrição.

[00151] Os plasmídeos podem ser propagados em células hospedeiras bacterianas ou para introdução em células hospedeiras eucarióti- cas. Transfecção de células hospedeiras eucarióticas pode ser qualquer uma realizada através de qualquer processo bem conhecido na técnica. Processos de transfecção incluem lipofecção, eletroporação, coprecipi- tação com fosfato de cálcio, transfecção mediada com policátions ou cloreto de rubídio, fusão de protoplasma e microinjeção. Preferivelmente, a transfecção é uma transfecção estável. O processo de transfecção que provê ótima frequência e expressão de transfecção da construção na particular linha e tipo de célula hospedeira, é favorecido. Apropriados processos podem ser determinados através de procedimentos de rotina. Para transfectantes estáveis, as construções são integradas de modo a serem mantidas estavelmente dentro de cromossoma hospedeiro.

[00152] Vetores podem ser introduzidos para células hospedeiras selecionadas através de qualquer um de um número de processos apropriados conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, construções vetores podem ser introduzidas em apropriadas células através de qualquer um de um número de processos de transformação para vetores plasmídeos. Por exemplo, transformação bacteriana mediada por cloreto de cálcio padrão ainda é comumente usada para intro- dução de DNA nu para bactérias (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), mas eletroporação e conjugação também podem ser usadas (ver, por exemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y.).

[00153] Para a introdução de construções vetores para células de fungos ou outras leveduras, processos de transformação química podem ser usados (por exemplo, Rose et al., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Células transformadas podem ser isoladas sobre meios seletivos apropriados para o marcador selecionável usado. Alternativamente, ou em adição, placas ou filtros erguidos a partir de placas podem ser explorados para fluorescência de GFP para identificação de clones transformados.

[00154] Para a introdução de vetores compreendendo sequências diferencialmente expressas para células mamíferas, o processo usado pode depender da forma do vetor. Vetores plasmídeos podem ser introduzidos através de qualquer um de um número de processos de trans- fecção, incluindo, por exemplo, transfecção mediada por lipídeo ("lipo- fecção"), transfecção mediada por DEAE-dextrano, eletroporação ou precipitação com fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y.).

[00155] Reagentes de lipofecção e apropriados processos para transfecção transiente de uma ampla variedade de células transformadas e não transformadas ou primárias são amplamente disponíveis, tornando lipofecção um processo atraente de introdução de construções para células eucarióticas, e particularmente mamíferas em cultura. Por exemplo, kits LipofectAMINE (Life Technologies) ou LipoTaxi (Stratage- ne) são disponíveis. Outras companhias oferecendo reagentes e processos para lipofecção incluem Bio-Rad Laboratories, CLONTECH, Glen Research, InVitrogen, JBL Scientific, MBI Fermentas, PanVera, Promega, Quantum Biotechnologies, Sigma-Aldrich, e Wako Chemicals USA.

[00156] A célula hospedeira pode ser capaz de expressar a construção codificando a desejada proteína, processar a proteína e transportar a proteína secretada para a superfície de célula para secreção. Processamento inclui modificação co- e pós-traducional tal como clivagem de peptídeo líder, ligação de GPI, glicosilação, ubiquitinação e formação de ligação dissulfeto. Culturas de células hospedeiras imortalizadas suscetíveis a transfecção e cultura de células in vitro do tipo tipicamente empregado em engenharia genética são preferidas. Exemplos de linhas de células hospedeiras mamíferas úteis são linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (CO 7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônica humana (293 ou derivadas de 293 adaptadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); DHFR - células de ovário de hamster Chinês (ATCC CRL-9096); células dp 12.CHO, um derivado de CHO/DHFR-(EP 307 247 publicada em 15 de março de 1989); células sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. acad. Sci., 383:44-68 (1982); linha de células linfoblásti- cas agudas humanas PEER (Ravid et al. Int. J. Cancer 25:705-710 (1980)); células MRC 5; células FS4; linha de hepatoma humano (Hep G2), células HT1080 humanas, células KB, células JW-2, células Detroit 6, células NIH-3T3, células hibridoma e mieloma. Células embriônicas usadas para geração de animais transgênicos também são apropriadas (por exemplo, zigotos e células troncos embriônicas).

[00157] Apropriadas células hospedeiras para clonagem ou expressão de polinucleotídeos (por exemplo, DNA) em vetores podem incluir, por exemplo, células procariotas, de levedura, ou eucariotas superiores. Apropriados procariotas para este propósito incluem eubactéria, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos,por exemplo, Entero- bacteriaceae como Escherichia,por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P mostrado em DD 266,710 publicada em 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31 446), embora outras linhagens como E, coli B., E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. coli JM110 (ATCC 47 013) e E. coli W3110 (ATCC 27 325) são apro-priadas.

[00158] Em adição a procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras podem ser apropriados hospedeiros de clonagem ou expressão para vetores compreendendo polinucleo- tídeos codificando uma ou mais enzimas. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comumente usado entre micro-organismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Entretanto, um número de outros gêneros, espécies, e linhagens são comumente disponíveis e úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotole- rans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypo- cladium, e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.

[00159] Quando a enzima é glicosilada, apropriadas células hospedeiras para expressão podem ser derivadas de organismos multicelula- res. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Numerosas linhagens de baculovírus e variantes e correspondentes células hospedeiras de insetos permissivas a partir de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), e Bombyx mori (mariposa de seda) foram identificadas. Uma variedade de linhagens virais para transfecção é publicamente disponível, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser aqui usados como o vírus de acordo com a presente exposição, particularmente para trans- fecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00160] Culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, tabaco, lemna, e outras células de plantas também podem ser utilizadas como células hospedeiras.

[00161] Exemplos de células hospedeiras de mamíferos úteis são células de ovário de hamster Chinês, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, e células de ovário de hamster Chinês/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (CO 7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônico humano (células 293 ou subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59, 1977); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, (Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão hu mano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha hepatoma humana (Hep G2).

[00162] Células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com os vetores de clonagem ou expressão descritos acima para produção de uma ou mais enzimas como aqui mostrado ou com polinucleotí- deos codificando uma ou mais enzimas aqui mostradas e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para promotores de indução, transformantes de seleção, ou amplificação de genes codificando as desejadas sequências.

[00163] Células hospedeiras contendo desejadas sequências de ácidos nucleicos codificando as enzimas mostradas podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI- 1640 (Sigma), e Dulbecco’s Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) são apropriados para cultura de células hospedeiras. Em adição, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980); U.S. Patent NOS. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; ou U.S. Patent Re. No. 30,985 pode ser usado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado quando necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adeNOSine e timidina), antibióticos (como droga GENTAMICINA), elementos em traços (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em apropriadas concentrações que podem ser conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão aparentes para aqueles versados na técnica.

[00164] Qualquer um dos intermediários produzidos em qualquer um dos caminhos enzimáticos aqui mostrados pode ser um intermediário no sentido clássico da palavra em que eles podem ser convertidos enzima- ticamente a um outro intermediário ou um produto final. Alternativamente, os próprios intermediários podem ser considerados um produto final.

Polinucleotídeos e Enzimas Codificadas

[00165] Qualquer polinucleotídeo conhecido (por exemplo, gene) que codifique uma enzima ou sua variante que é capaz de catalisar uma conversão enzimática incluindo, por exemplo, uma enzima como mostrada em qualquer uma das Tabelas 3-5 ou Figuras 4-5, é contemplado para uso pela presente exposição. Tais polinucleotídeos podem ser modificados (por exemplo, geneticamente engenheirados) para modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) a especificidade de substrato de uma enzima codificada, ou os polinucleotídeos podem ser modificados para alterar a especificidade de substrato da enzima codificada (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma enzima com especificidade por um substrato pode ser modificado de modo que a enzima tenha especificidade por um substrato alternativo). Micro-organismos preferidos podem compreender polinucleotídeos codificando uma ou mais das enzimas mostradas em Tabelas 3-5 e Figuras 4-5.

[00166] Enzimas para catálise de conversões mostradas em caminhos A, B, e C de Tabelas 3-5 e Figuras 4-5 são categorizadas na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Números identificadores de gene (GI) exemplares

Processos para a coprodução de 1-propanol e 2-propanol

[00167] 1-propanol e 2-propanol podem ser produzidos através de contato de qualquer um dos micro-organismos geneticamente modificados aqui providos com uma fonte de carbono fermentável. Tais processos preferivelmente podem compreender contato de uma fonte de carbono fermentável com um micro-organismo compreendendo um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão da fonte de carbono fermentável para qualquer dos intermediários providos em Figuras 4-5 (Tabelas 3-5) e um ou mais poli- nucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão do um ou mais intermediários providos em Figuras 4-5 (tabelas 3-5) a 1-propanol e 2-propanol em meios de fermentação; e expressão de um ou mais polinucleotídeos codificando as enzimas no caminho que catalisa uma conversão da fonte de carbono fermentável para o um ou mais intermediários providos em Figuras 4-5 (tabelas 3-5) e um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa uma conversão do um ou mais intermediários providos em Figuras 4-5 (tabelas 3-5) a 1-propanol e 2-propanol.

[00168] Os caminhos metabólicos que conduzem à produção de compostos industrialmente importantes envolvem reações de oxidação - redução (redox). Por exemplo, durante fermentação, glicose é oxidada em uma série de reações enzimáticas em moléculas menores com a concomitante liberação de energia. Os elétrons liberados são transferidos de uma reação para outra através de carreadores universais de elétrons, como dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD) e dinucleotídeo adenina nicotinamida fosfato (NAD(P)), que atuam como cofatores para enzimas óxido redutase. Em catabolismo microbiano, glicose é oxidada por enzimas usando a forma oxidada dos cofatores (NAD(P)+ e/ou NAD+) como cofator assim gerando equivalentes redutores na forma do cofator reduzido (NAD(P)H e NADH). De modo a continuar a fermentação, metabolismo balanceado de redox é requerido, isto é, os cofatores têm de ser regenerados através de redução de compostos metabólicos de célula microbiana.

[00169] Fermentação catalisada com micro-organismo para a produção de produtos naturais é uma aplicação amplamente conhecida de biocatálise. Micro-organismos industriais podem afetar conversões multietapas de estoques de alimentação renováveis para produtos químicos de alto valor em uma reação simples. Produtos de processos de fermentação catalisada com micro-organismo variam de compostos químicos tais como etanol, ácido lático, aminoácidos e vitaminas, a compostos farmacêuticos de molécula pequena e alto valor, compostos farmacêuticos proteínas, e enzimas industriais. Em muitos destes processos, os biocatalisadores são micro-organismos de célula inteira, incluindo micro-organismos que foram geneticamente modificados para expressão de genes heterólogos.

[00170] Alguns parâmetros chaves para eficientes processos de fermentação catalisados com micro-organismos incluem a habilidade para crescer micro-organismos para uma maior densidade de células, aumentado rendimento de produtos desejados, aumentada quantidade de produtividade volumétrica, remoção de cometabólitos indesejado, aper-feiçoada utilização de fontes baratas de carbono e nitrogênio, adaptação a condições variáveis de fermentador, aumentada produção de um metabólito primário, aumentada produção de um metabólito secundário, aumentada tolerância para condições ácidas, aumentada tolerância para condições básicas, aumentada tolerância para solventes orgânicos, aumentada tolerância para condições de alto teor de sal e aumentada tolerância para temperaturas altas ou baixas. Ineficiências em quaisquer destes parâmetros pode resultar em altos custos de fabricação, inabilidade para capturar ou manter a parte do mercado, e/ou falha para levar produtos finais fermentados para o mercado.

[00171] Os processos e composições da presente exposição podem ser adaptados a biorreatores de fermentação convencionais (por exem- plo, fermentação em batelada, batelada - alimentada, reciclagem de célula, e fermentação contínua).

[00172] Em algumas modalidades, um micro-organismo (por exemplo, um micro-organismo modificado geneticamente como aqui provido é cultivado em meios líquidos de fermentação (isto é, uma cultura submersa) o que conduz à excreção do produto(s) fermentado nos meios de fermentação. Em uma modalidade, o produto(s) final fermentado pode ser isolado dos meios de fermentação usando qualquer processo apropriado na técnica.

[00173] Em algumas modalidades, formação do produto fermentado ocorre durante um período de crescimento rápido, inicial do microorganismo. Em uma modalidade, formação do produto fermentado ocorre durante um segundo período no qual a cultura é mantida em um estado de baixo crescimento ou nenhum crescimento. Em uma modalidade, formação do produto fermentado ocorre durante mais de um período de crescimento do micro-organismo. Em tais modalidades quantidade de produto fermentado por unidade de tempo é genericamente uma função da atividade metabólica do micro-organismo, as condições de cultura fisiológica (por exemplo, pH, temperatura, composição média), e a quantidade de micro-organismos presente no processo de fermentação.

[00174] Em algumas modalidades, o produto de fermentação é recuperado do periplasma ou meio de cultura como um metabólito secreta- do. Em uma modalidade, o produto de fermentação é extraído do microorganismo, por exemplo, quando o micro-organismo carece de um sinal de secreção correspondendo ao produto de fermentação. Em uma modalidade, os micro-organismos são rompidos e o meio de cultura ou li- sado é centrifugado para remoção de debris de células em partículas. As frações de proteína solúvel e membrana então podem ser separadas se necessário. O produto de fermentação de interesse então pode ser purificado da solução ou suspensão sobrenadante restante através de, por exemplo, destilação, fracionamento, cromatografia, precipitação, filtração, e semelhantes.

[00175] Os processos da presente exposição são preferivelmente realizados sob condições anaeróbicas. Ambos, o grau de redução de um produto assim como o requisito ATP de sua síntese determinam se o processo de produção é capaz de proceder aerobicamente ou anae- robicamente. Para produzir 1-propanol e 2-propanol ou 1-propanol e butadieno via conversão microbiana anaeróbica, ou pelo menos através de uso de um processo com reduzido consumo de oxigênio, desequilíbrios redox devem ser evitados. Vários tipos de etapas de conversão metabólica envolvem reações redox. Tais reações redox envolvem transferência de elétrons mediada pela participação de cofatores de redox como NADH, NADPH e ferredoxina. Uma vez que as quantidades de cofatores de redox na célula são limitadas para permitirem a continuação de processos metabólicos, os cofatores têm de ser regenerados. De modo a evitar tais desequilíbrios redox, meios alternativos de regeneração de cofator podem ser engenheirados, e em alguns casos fontes adicionais de geração de ATM podem ser providas. Alternativamente, processos de oxidação e redução podem ser separados espacialmente em sistemas bioeletroquímicos (Rabaey and. Rozendal, 2010, Nature reviews, Microbiology, vol 8: 706-716).

[00176] Em algumas modalidades, desequilíbrios redox podem ser evitados através do uso de substratos (por exemplo, fontes de carbono fermentáveis) que são mais oxidados ou mais reduzidos, por exemplo, se a utilização de um substrato resulta em um déficit ou excesso de elétrons, um requisito por oxigênio pode ser desviado através de uso de substratos que são mais reduzidos ou oxidados, respectivamente. Por exemplo, glicerol que é um principal subproduto de produção de biodiesel é mais reduzido que açúcares, e é por isso mais apropriado para a síntese de compostos cuja produção a partir de açúcar resulta em oxidação de cofator, tal como ácido succínico. Em algumas modalidades, se a conversão de um substrato a um produto resulta em um déficit de elétrons, cossubstratos podem ser adicionados que funcionem como doadores de elétrons (Babel 2009, Eng. Life Sci. 9, 285-290). Um impor-tante critério para o uso anaeróbico de cossubstratos é que seu potencial redox é maior que aquele de NADH (Geertman et al., 2006, FEMS Yeast Res. 6, 1193-1203). Se a conversão de substrato para produzir resulta em um excesso de elétrons, cossubstratos podem ser adicionados que funcionem como receptores de elétrons.

Processos para a produção de polipropileno

[00177] 1-propanol produzido via processos aqui mostrados pode ser desidratado para formar propileno, que então pode ser polimerizado para produção de polipropileno em uma maneira de custo efetivo.

[00178] Propileno é um composto químico que é amplamente usado para sintetizar uma ampla faixa de produtos petroquímicos. Por exemplo, esta olefina é o material bruto usado para a produção de polipropi- leno, seus copolímeros e outros compostos químicos como acrilonitrila, ácido acrílico, epicloridrina, e acetona. Demanda por propileno está crescendo mais rápido que demanda por etileno, principalmente devido ao crescimento de demanda de mercado por polipropileno. Propileno é polimerizado para produzir resinas termoplásticas para inúmeras aplicações tais como materiais de embalagem rígida ou flexível, moldagem de sopro e moldagem de injeção.

[00179] Propileno é tipicamente obtido em escalas de grande quantidade como um subproduto de craqueamento catalítico ou térmico de óleo, ou como um subproduto de produção de etileno a partir de gás natural. (Propylene, Jamie G. Lacson, CEH Marketing Research Report- 2004, Chemical Economics Handbook-SRI International). O uso de rotas alternativas para a produção de propileno tem sido continuamente avaliado usando uma ampla faixa de materiais brutos renováveis ("Green Propylene", Nexant, January 2009). Estas rotas incluem, por exemplo, dimerização de etileno para render butileno, seguido por me- tátese com adicional etileno para produzir propileno. Uma outra rota é produção de biobutanol através de fermentação de açúcar seguida por desidratação e metátese com etileno. Algumas rotas térmicas também estão sendo avaliadas, como gaseificação de biomassa para produzir um gás de síntese seguido por síntese de metanol, que pode então produzir propileno verde via tecnologia metanol-para-olefina.

[00180] Produção de propileno através de desidratação de isopropanol foi bem descrita no documento EP00498573B1, onde todos os exemplos mostram seletividade para propileno maior que 90% com altas conversões. Desidratação de 1-propanol também tem sido estudada nos seguintes artigos: "Mechanism and Kinetics of the Acid-Catalyzed Dehydration of 1- and iso-propanol in Hot Compressed Liquid Water" (Antal, M et al., Ind. Eng. Chem. Res. 1998, 37, 3820-3829) e "Fischer- Tropsch Aqueous Phase Refining by Catalytic Alcohol Dehydration" (Nel, R. et al., Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 3558-3565). O rendimento reportado é maior que 90%.

Exemplos Exemplo 1: Engenharia de aceto acetil-CoA hidrolase

[00181] Uma enzima tendo atividade aceto aceti-CoA transferase pode ser engenheirada através de qualquer processo conhecido na técnica para produzir uma aceto acetil-CoA específica para hidrolase.

[00182] Em um processo exemplar, uma sequência de aminoácidos de uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é obtida. A seguir, a resíduo de ácido glutâmico em uma posição correspondendo à posição de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1 na enzima é identificado através de alinhamento de sequência de aminoácidos da enzima com SEQ ID NO: 1. Um sítio na enzima correspondendo à posição de ami- noácido 51 de SEQ ID NO: 1 é então selecionado para substituição. Tal substituição do resíduo de ácido glutâmico identificado pode incluir substituição do resíduo de ácido glutâmico por ácido aspártico e pode ser feita através de qualquer processo conhecido na técnica incluindo, por exemplo, mutagênese direcionada de sítio. Subsequentemente, uma aceto acetil-CoA específica de hidrolase é obtida tendo atividade aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade ace- til-CoA hidrolase.

Exemplo 2: Modificação de micro-organismo para produção de 1- propanol e 2-propanol

[00183] Um micro-organismo tal como uma bactéria é geneticamente modificado para produzir 1-propanol e 2-propanol a partir de uma fonte de carbono fermentável incluindo, por exemplo, glicose.

[00184] Em um processo exemplar, um micro-organismo pode ser geneticamente engenheirado através de quaisquer processos conhecidos na técnica para compreender: i) um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa a conversão da fonte de carbono fermentável a di-hidroxiacetona fosfato ou gliceraldeído 3- fosfato e um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas em um caminho que catalisa a conversão de di-hidroxiacetona fosfato ou gliceral- deído 3-fosfato em 1-propanol e 2-propanol.

[00185] Alternativamente, um micro-organismo que carece de uma ou mais enzimas (por exemplo, uma ou mais enzimas funcionais que são cataliticamente ativas) para a conversão de uma fonte de carbono fermentável a 1-propanol e 2-propanol pode ser geneticamente modificado para compreender um ou mais polinucleotídeos codificando enzimas (por exemplo, enzimas funcionais incluindo, por exemplo, qualquer enzima aqui mostrada) em um caminho em que o micro-organismo falha para catalisar uma conversão da fonte de carbono fermentável a 1- propanol e 2-propanol.

Exemplo 3: Fermentação de glicose por micro-organismo geneticamente modificado para produção de 1-propanol e 2-propanol

[00186] Um micro-organismo geneticamente modificado, como produzido no Exemplo 1 acima, pode ser usado para fermentar uma fonte de carbono para produção de 1-propanol e 2-propanol.

[00187] Em um processo exemplar, um meio de cultura previamente esterilizado compreendendo uma fonte de carbono fermentável (por exemplo, glicose 9 g/L, KH2PO4 1 g/L, (NH4)2HPO4 2 g/L, Fe- SO4.7H2O 5 mg/L, MgSO4.7H2O 10 mg/L, MsSO4.H2O 2,5 mg/L, CaCl2.6H2O 10 mg/L, CoCl2.6H2O 10 mg/L, e extrato de levedura 10 g/L) é carregado em um biorreator.

[00188] Durante fermentação, condições anaeróbicas são mantidas através de, por exemplo, espargimento de nitrogênio através de meio de cultura. Uma temperatura apropriada para fermentação (por exemplo, cerca de 30oC) é mantida usando qualquer processo conhecido na técnica. Um pH próximo de fisiológico (por exemplo, cerca de 6,5) é mantido através de, por exemplo, adição automática de hidróxido de sódio. O biorreator é agitado em, por exemplo, cerca de 50 rpm. Fermentação é permitida correr até o término.

[00189] A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condições de reação, e assim por diante usadas no relatório descritivo e reivindicações são para serem entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo "cerca". Da mesma maneira, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e reivindicações apostas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas serem obtidas pela presente exposição. No mínimo, e não como uma tentativa para limitar a aplicação da doutrina de equivalentes para o escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo me- nos ser construído à luz do número de dígitos significantes reportados e através de aplicação de técnicas comuns de arredondamento.

[00190] Não obstante que as faixas numéricas e parâmetros mostrando o amplo escopo da exposição sejam aproximações, os valores numéricos mostrados nos específicos exemplos são reportados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contém inerentemente certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições testes.

[00191] Os termos "um", "uma", "o" e referentes similares usados no contexto de descrição de exposição (especialmente no contexto das reivindicações que se seguem) são para serem construídos para cobrirem ambos, o singular e o plural, a menos que aqui de outro modo indicado ou claramente contradito por contexto. Recitação de faixas de valores é aqui meramente pretendida servir como um processo de estenografia ou referindo individualmente a cada valor separado caindo dentro de faixa. A menos que aqui indicado de outro modo, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse individualmente ali recitado. Todos os processos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem apropriada a menos que aqui de outro modo indicado ou de outro modo claramente contradito por contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui providos é pretendido meramente iluminar a exposição e não possui uma limitação sobre o escopo da exposição de outro modo reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da exposição.

[00192] Agrupamentos de elementos ou modalidades alternativas da exposição aqui mostrada não são para serem construídos como limitações. Cada membro de grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos ali encontrados. É antecipado que um ou mais dos membros de um grupo pode sem ser incluídos em, ou suprimidos de, um grupo de razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando qualquer tal inclusão ou supressão ocorre, o relatório descritivo é julgado conter o grupo como modificado assim satisfazendo a descrição de todos os grupos Markush usados nas reivindicações apostas.

[00193] Em certas modalidades desta exposição são aqui descrita, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para modalidade da exposição. É claro, variações sobre estas modalidades descritas tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica com leitura da descrição anterior. O inventor espera que aqueles versados empreguem tais variações quando apropriado, e os inventores pretendem que a exposição seja praticada de outra maneira que não aquela aqui descrita. Da mesma maneira, esta exposição inclui todas as modificações e equivalentes da matéria objeto recitada nas reivindicações apostas como permitido por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas suas variações possíveis é abrangida pela exposição a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito por contexto.

[00194] Específicas modalidades aqui mostradas ainda podem ser limitadas nas reivindicações usando consistindo em e consistindo essencialmente em. Quando usado nas reivindicações, se como depositado ou adicionado por emenda, o termo de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e aqueles que materialmente não afetam a característica(s) nova e básica. Modalidades da exposição assim reivindicadas são inerentemente ou expressamente aqui descritas e possibilitadas.

[00195] É para ser entendido que as modalidades da exposição aqui mostradas são ilustrativas dos princípios da presente exposição. Outras modificações que podem ser empregadas estão dentro do escopo da exposição. Assim, por meio de exemplo, mas não limitação, configurações alternativas da presente exposição podem ser utilizadas de acordo com os presentes ensinamentos. Da mesma maneira, a presente expo-sição não é limitada àquela precisamente como mostrada e descrita.

[00196] Embora a presente exposição tenha sido aqui descrita e ilustrada por referências a vários específicos materiais, procedimentos e exemplos, é entendido que a exposição não é restrita às particulares combinações de materiais e procedimentos selecionados para este propósito. Numerosas variações de tais detalhes podem ser implicadas como será apreciado por aqueles versados na técnica. É pretendido que o relatório descritivo e exemplos sejam considerados somente como exemplares, com o verdadeiro escopo e espírito da exposição sendo indicados pelas reivindicações que se seguem. Todas as referências, patentes, e pedidos de patente referidos neste pedido de patente são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Claims

1. Enzima engenheirada tendo especificidade de substrato aceto acetil-CoA e atividade aceto acetil-CoA específica de hidrolase caracterizada pelo fato de que compreende i) uma sequência de aminoácido de uma enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e ii) uma substituição de um resíduo de ácido glutâmico na posição 51 da SEQ ID NO:1 a um resíduo de ácido aspártico.

2. Enzima engenheirada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima tendo uma atividade aceto acetil-CoA transferase é de uma família de enzimas tendo atividade 3- oxoácido-CoA transferase.

3. Enzima engenheirada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima que possui atividade aceto acetil-CoA transferase é butirato aceto acetato-CoA transferase ou aceto acetato-CoA transferase.

4. Enzima engenheirada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima tendo atividade aceto acetil-CoA transferase é proveniente de Clostridium acetobutilicum ou Escherichia coli.

5. Enzima engenheirada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima engenheirada tem uma atividade específica aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase.

6. Micro-organismo modificado caracterizado por conter a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 2, ou sequências degeneradas da mesma, que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e compreender um ou mais polinucleotídeos codificando uma ou mais enzimas em um caminho com aceto acetato como um intermediário ou produto final, e uma enzima engenheirada tendo especificidade de substrato aceto acetil-CoA e atividade aceto acetil-CoA específica de hidrolase, em que a enzima engenheirada é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima tendo atividade aceto acetil- CoA transferase é de uma família de enzimas tendo atividade 3- oxoácido-CoA transferase.

8. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima tendo atividade aceto acetil- CoA transferase é butirato aceto acetato-CoA transferase ou aceto acetato-CoA transferase.

9. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima tendo atividade aceto acetil- CoA transferase é proveniente de Clostridium acetobutilicum ou Escherichia coli.

10. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima tem uma atividade específica aceto acetil-CoA hidrolase pelo menos 10x maior que sua atividade acetil-CoA hidrolase.

11. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo compreende adicionalmente uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato ou uma interrupção em um ou mais polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição de uma enzima que descarboxila piruvato.

12. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a interrupção no um ou mais polinucleotídeos que codificam a uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato é uma supressão ou uma mutação.

13. Micro-organismo modificado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas que descarboxilam piruvato incluem piruvato descarboxilase 1 (pdc1), pdc5, e/ou pdc6, e em que o fator de transcrição de uma enzima que descarboxila piruvato é pdc2.

14. Processo de produção de um ou mais produtos a partir de uma fonte de carbono fermentável, o dito processo caracterizado por compreender: a) provimento de uma fonte de carbono fermentável; e b) contato de fonte de carbono fermentável com o microorganismo modificado como definido na reivindicação 6 em meios de fermentação, em que o micro-organismo produz um ou mais produtos a partir da fonte de carbono fermentável.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é contatada com o micro-organismo modificado sob condições anaeróbicas.