CN103304657A - 一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，以木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和乳清蛋白为反应原料，按照一定比例进行湿热糖基化反应。结果表明：乳清蛋白-木糖复合物的还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力和抗脂质过氧化能力随pH的升高提高最大。SDS-PAGE显示乳清蛋白-木糖复合物反应后分子量明显增大；傅里叶红外光谱(FTIR)结果显示：乳清蛋白-木糖复合物中蛋白质的酰胺I和II明显减少。本发明的目的在于，得到了具有较强的抗氧化功能的乳清蛋白糖基化制备方法，改善了乳清蛋白的抗氧化功能特性，开发出新型的功能性乳清蛋白配料，拓展其应用范围并增添新的功能性添加剂。

Description

一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法

技术领域

本发明涉及一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法

背景技术

乳清蛋白约占牛奶蛋白质的20％。乳清蛋白中的主要成分为：β-乳球蛋白48％(含有游离-SH基、为牛奶加热风味来源之一)、α-乳白蛋白约19％、蛋白酶20％、免疫球蛋白8％、牛血清蛋白5％以及少量的其他组分(如乳铁蛋白和乳过氧化物酶β-微球蛋白、溶菌酶、胰岛素样生长因子(IGF)、λ-球蛋白等)。

由于乳清蛋白具有高吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪和胆固醇，同时浓缩了牛奶大多数的营养成分，有利于促进身体健康，可抗衰老、促进心脏健康、抗癌、提高免疫力、提高骨质和控制体重，是当今最常见的蛋白质补充产品。

目前，通过改性的方法提高乳清蛋白的生物学活性及保健功能，正受到全球的广泛关注，在已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN101519426A中公开了一种具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽及其制备方法，得到的乳清蛋白多肽具有较高的抗氧化活性和清除自由基能力在体内和体外具有良好的抗氧化活性。专利CN101775429A中公开了一种乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与他们的用途，得到纯度较高的乳清蛋白抗氧化肽，具有良好的耐体外消化稳定性、耐热耐酸碱稳定性与耐储藏稳定性，具有较高的抗氧化活性，具有较小分子量和特定氨基酸序列，能够有效清除自由基，阻断氧化反应，减少氧化损伤的产生。以上都是通过不同的方法制备乳清蛋白多肽来提高乳清蛋白的抗氧化活性，然而，通过对乳清蛋白进行糖基化改性的方法提高其抗氧化功能的专利及专利申请到目前还没有。

通过美拉德反应进行糖基化是一种改善蛋白质功能特性的有效方法，糖基化是一种自然发生的反应，反应条件比其他化学改性方法温和，涉及蛋白质与多糖和小分子碳水化合物反应，并且低温下(60℃)在水溶液或其他低水分环境中即可进行。糖基化不仅可以改善蛋白质的功能特性，还能改变蛋白的生物学功能，如抗氧化活性。Kika等研究浓缩乳清蛋白与羧甲基纤维素在60℃孵浴5d的美拉德反应，结果表明乳清蛋白与CMC的聚合产物的乳化稳定性显著提高。Chevalier研究了六种小分子糖(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、鼠李糖和核糖)与β-乳球蛋白的糖基化，发现乳球蛋白与阿拉伯糖或核糖的糖基化产物的乳化性增加，与葡萄糖或半乳糖的糖基化产物的起泡性比天然蛋白好。目前，赵艳娜等通过干热糖基化改性，发现乳清蛋白-乳糖复合物具有较高的的还原力及对DPPH的清除能力，而对乳清蛋白糖基化改性后清除活氧自由基的清除能力国内外未见报道。

本发明通过湿热糖基化反应，研究不同浓度以及不同pH值对6种乳清蛋白糖基复合物的反应特性及其抗氧化特性，并通过傅里叶红外(FTIR)对其进行结构表征，为乳清蛋白糖基复合物作为天然抗氧化剂的应用奠定了理论基础，同时也为乳清蛋白的综合利用开辟新的途径。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法。

本发明的另一个目的在于提供一种所述湿热糖基化改性乳清蛋白复合物作为天然抗氧化剂的应用奠定基础理论，提高乳清蛋白的综合利用水平。

技术方案

1.本发明是一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，以木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和乳清蛋白为美拉德反应原料，按照一定比例混合后，配制成一定浓度的水溶液，每种糖与乳清蛋白混合物分别调节pH至3，4，5，6，7，8，9，于50℃加热7d。湿热糖基化反应后，对6种乳清蛋白糖基化复合物与乳清蛋白进行褐变程度分析和游离氨基酸含量测定。比较不同浓度，不同pH条件下6种乳清蛋白糖基化复合物和乳清蛋白的还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力及抗脂质过氧化能力。筛选出具有较好抗氧化能力的乳清蛋白糖基化复合物，及其最佳反应条件。包括如下步骤：

(1)选择6种糖基配体，与乳清蛋白按照一定比例混合，溶解，配制成一定浓度的水溶液，备用；

(2)将溶解好的乳清蛋白和糖溶液分别调至不同的pH，备用；

(3)将调整好pH的乳清蛋白和糖溶液放入具塞试管中，至于烘箱中加热；

(4)控制乳清蛋白与糖反应的温度与时间，制得乳清蛋白糖基化复合物，即最终产品；

(5)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行褐变程度分析；

(6)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行游离氨基浓度浓度测定；

(7)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行还原能力及体外抗氧化能力测定，筛选出具有较强抗氧化能力的糖基化复合物及最佳反应条件；

2.本发明步骤(1)所述的选择6种糖基配体，分别为木糖(X)、葡萄糖(G)、果糖(F)、乳糖(L)、蔗糖(S)、麦芽糖(M)，分别按2∶1比例溶解，配制成60mg/ml的水溶液。

3.本发明步骤(2)所述的采用氢氧化钠和盐酸将每一种种乳清蛋白和糖溶液分别调pH(3、4、5、6、7、8、9)，然后放入具塞试管中。

4.本发明步骤(3)和(4)所述的将不同pH条件下的6种乳清蛋白和糖溶液，置于烘箱中，控制在50℃条件下进行反应，反应7d，即得乳清蛋白糖基化复合物。

5.本发明步骤(5)、(6)、(7)所述的试验方案：

①褐变程度分析

将待测样品采用蒸馏水进行稀释成质量浓度为10mg/ml的溶液，测定其在420nm条件下的吸光值；同时将待测样品采用蒸馏水进行稀释成浓度为5mg/ml的溶液，随时间变化，测定其在294nm条件下的吸光值。

②游离氨基酸含量的测定

采用OPA方法100mL邻苯二甲醛(OPA)试剂含：50mL浓度为0.1mol/L硼酸盐缓冲液，5mL质量分数为20％的SDS溶液，80mg OPA(溶于2mL甲醇)，200μLβ-巯基乙醇。取样品液100μL(浓度为5mg/ml)和3mL OPA试剂混合，室温暗处反应5min后，340nm处测其吸光值。以L-亮氨酸为标准物，按上述方法绘制出L-亮氨酸浓度(0.25～20mmol/l)与吸光值之间的标准曲线回归方程，根据测定样品的吸光值，利用标准曲线方程，计算得出样品中的游离氨基酸浓度。

③还原能力测定

取样品0.5mL(浓度为30mg/ml)的样品，加入2.5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L，pH值为6.6)和2.5mL的1％铁氰化钾溶液，混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷却，加入2.5mL的10％的三氯乙酸溶液，然后将混合物在5500r/min下离心10min。取2.5mL上层清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1％的氯化铁溶液，混合均匀，放置10min后，在700nm处测定其吸光值。

④DPPH自由基清除能力的测定

将样品稀释成30mg/mL的浓度，取样液1.0mL及4.0mL浓度为0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混匀，室温下避光反应30min，如有沉淀可在5500r/min条件下离心5min。用体积分数为95％乙醇溶液作参比，于517nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率：

清除率＝(1-Ai-Aj/Ac)×100％

式中：Ai：为加样品液后DPPH溶液的吸光值；

Aj：为样品液的吸光值；

Ac：为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。

⑤清除·OH自由基的确定

利用Fenton反应产生羟基自由基(·OH)，水杨酸能够有效捕捉·OH，生成有色物质2，3-二羟基苯甲酸，其在510nm处有强吸收。

向试管中加入1.00mL蒸馏水、FeSO₄溶液1.00mL(浓度为10mmol/l)、水杨酸-乙醇1.00mL(浓度为10mmol/l)、最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，在波长510nm处测定其吸光度值。向试管中加入一系列不同糖基化改性条件的溶液1.00mL(浓度为30mg/ml)，FeSO₄溶液1.00mL，水杨酸-乙醇1.00mL，最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min，5500r/min离心7min，在波长510nm下测量吸光度值。

SA＝[1-(A_S-Ax/A_C-A₀)]×100％

式中：A_C：不加清除剂时吸光度为；

A_S：将样品的吸光度；

A₀：空白管吸光度，以水代替样品。

⑥抗脂质过氧化能力测定

脂质体PBS分散体系的制备(LLS)：30mg卵磷脂溶于30mlLPBS(10mmol/l，pH＝7.4)溶液中，与超声波中处理数分钟得到均质的脂质体分散液，冰浴保存备用。三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液，15gTCA，0.375gTBA，2.1mlHCL依次溶于100ml水中。

测定步骤：与样品管中依次加入1mlLLS，1ml400μm/硫酸亚铁溶液和1ml样品，混匀。避光于37℃水浴60min，再加入2ml的TCA-TBA-HCL混合液，100℃水浴15min，迅速冷却，以5500r/min离心10min，取上清液532nm处测得吸光度。

抑制率(％)＝[(As-Ac)/Ac]×100％

式中：As：加样品管吸光度；

Ac：空白管吸光度，以水代替样液。

本发明的优点

1.本发明采用糖基化改性的方法对乳清蛋白进行改性，除了乳清蛋白-蔗糖复合物外，其他5种乳清蛋白糖基化复合物的还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力和抗脂质过氧化能力随pH的升高都有所提高。乳清蛋白-木糖复合物的抗氧化能力提高最大，而且在pH7～9的反应条件下，具有比Vc更高的还原能力。另外在pH6的条件下，除了乳清蛋白-蔗糖复合物外，其他5种乳清蛋白糖基化复合物随浓度的增加，还原能力和DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力和抗脂质过氧化能力都有所提高，其中乳清蛋白-木糖复合物的抗氧化能力提高最大。

2.本发明是利用乳清蛋白与小分子糖类发生的美拉德反应，对乳清蛋白进行改性，而美拉德反应产物中的促黑激素释放素、还原酮及一些含N、S的杂环化合物具有一定的抗氧化活性，且某些物质抗氧化活性甚至可与合成的抗氧化剂相媲美。

3.本发明工艺操作简单，可适于工厂生产，大大提高了乳清蛋白的抗氧化活性，为乳清蛋白糖基复合物作为天然抗氧化剂的应用奠定了理论基础，同时也为乳清蛋白的综合利用开辟新的途径。

4.近年来，我国干酪需要强劲，而发展干酪产业将产生大量乳清，目前我国尚缺乏乳清蛋白综合利用相关技术。因此，迫切需要开发乳清蛋白综合利用技术，以实现干酪产业的可持续发展。糖基化改性乳清蛋白的应用延伸到可作为天然抗菌剂、天然防腐剂和免疫增强剂，广泛应用于食品与医药工业。此外还可作为生物高分子材料用于食品包装。

附图说明

图1不同pH值乳清蛋白糖基化复合物还原能力变化

图2不同浓度的乳清蛋白糖基化产物还原能力变化

图3不同pH值乳清蛋白糖基化复合物DPPH自由基清除能力变化

图4不同浓度的乳清蛋白糖基化产物清除DPPH自由基能力变化

图5不同pH值乳清蛋白糖基化复合物羟自由基清除能力变化

图6不同pH值乳清蛋白糖基化复合物抗脂质过氧化能力变化

图76种乳清蛋白糖基化产物电泳结果

图8乳清蛋白、乳清蛋白-蔗糖、乳清蛋白-木糖和乳清蛋白-葡萄糖的傅里叶红外光谱

具体实施方式

下面结合实施例对糖基化改性乳清蛋白的制备方法以及抗氧化功能进行阐述。

实施例1

将乳清蛋白和6种糖：木糖(X)、葡萄糖(G)、果糖(F)、乳糖(L)、蔗糖(S)、麦芽糖(M)，分别按2∶1比例溶解，采用氢氧化钠和盐酸调pH(3、4、5、6、7、8、9)，制成60mg/mL的水溶液，然后放入具塞试管中。并置于烘箱中，控制在50℃条件下进行反应，反应7d，即得乳清蛋白糖基复合物。

实施例2

将待测样品用蒸馏水进行稀释成质量浓度为10mg/mL的溶液，测定其在420nm条件下的吸光值；同时将待测样品采用蒸馏水进行稀释成浓度为5mg/mL的溶液，随时间变化，测定其在294nm条件下的吸光值。每个试验重复3次，结果表示为平均值±偏差。数据统计分析采用SPSS11.5软件(p＜0.05表示差异显著，p＞0.05表示差异不显著)，画图采用Excel。

乳清蛋白-木糖(WPI-X)、乳清蛋白-葡萄糖(WPI-G)、乳清蛋白-果糖(WPI-F)、乳清蛋白-乳糖(WPI-L)、乳清蛋白-蔗糖(WPI-S)、乳清蛋白-麦芽糖(WPI-M)6种糖基化复合物与乳清蛋白(WPI)不同pH值反应后的褐变程度分析。褐变程度试验结果如表1和表2所示。

表1不同pH值乳清蛋白糖基化复合物在420nm处得吸光值

注：-表示没有测定，a＝0.05；字母在同一行数据中，相同表示差异不显著，不同表示差异显著。字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著，下同。

表2不同pH值乳清蛋白糖基化复合物在294nm处得吸光值

由表1和表2中的T检验结果可知，WPI与6种糖基化复合物湿热条件下反应后，在420nm处，WPI-X、WPI-G、WPI-L与WPI之间的吸光值差异显著(P＜0.05)；在294nm处的吸光值，除了WPI-S、WPI-M、WPI-G(P＞0.05)外，它3种乳清蛋白糖基化复合物与WPI之间的吸光值差异显著(P＜0.05)。

从表1和表2中的方差分析的多重比较结果可知，糖基化反应后，在420nm和294nm处，WPI-X复合物在pH3，4条件下与pH值5～9条件下吸光值差异显著(p＜0.05)，pH值在7～9条件下吸光值差异不显著差异显著(p＞0.05)；WPI-L复合物在pH值3的条件下与pH值7～9条件下差异显著(p＜0.05)，pH7～9条件下的吸光值差异不显著差异显著(p＞0.05)；WPI-G复合物除在pH8，9时差异不显著差异显著(p＞0.05)外，其他pH值之间差异显著差异显著(p＜0.05)；WPI-F，WPI-M和WPI-S不同pH值时在420nm和294nm处得吸光值差异不显著差异显著(p＞0.05)。糖基化反应后，WPI-X复合物的颜色变化最大，色泽最深，为棕褐色；WPI-L，WPI-G为淡黄色；其它3种复合物的色泽变化最小，颜色较浅，为乳白色。因此可得出，木糖、乳糖和葡萄糖的羰基反应活性高，比蔗糖、果糖和麦芽糖与乳清蛋白的湿热糖基化反应迅速。

实施例3

6种糖基化复合物浓度稀释到0.6mg/ml，WPI稀释到0.4mg/ml在340nm处的测其吸光值，根据L-亮氨酸标准曲线计算游离氨基含量，试验结果如表3所示。

表3不同pH值乳清蛋白糖基化复合物游离氨基含量(mmol/l)

在糖基化反应过程中，游离氨基酸浓度变化在一定程度上，反映了美拉德反应的进程，反应越彻底，消耗的游离氨基酸越多。由表3的T检验结果可知，6种糖基化复合物在pH3～9值时反应后与WPI游离氨基酸浓度差异显著(P＜0.05)。

从表3的方差分析的多重比较结果可得，在pH3～9时6种糖基化复合物反应后游离氨基酸浓度差异显著(P＜0.05)；由此可以看出，pH条件对羰氨缩合反应影响显著，且随pH值的升高，糖基化速度越快，消耗的游离氨基越多，即强酸性条件会抑制羰氨缩合，弱酸以及碱性条件会促进羰氨缩合反应的进行。WPI-X在pH3～9时与其他5种糖基化复合物的游离氨基酸浓度差异显著(P＜0.05)，反应后游离氨基浓度明显低于其他5种糖基化复合物，即WPI-X反应消耗的游离氨基最多，反应最强烈；WPI-S在pH3～9时与其他5种糖基化复合物相比反应后消耗的游离氨基最少，即WPI-S美拉德反应程度最小。

实施例4

6种糖基化复合物与WPI在不同pH条件下反应后的还原能力，以及质量分数为0.01％的Vc的还原能力进行比较。取样品0.5mL(浓度为30mg/mL)的样品，加入2.5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L，pH值为6.6)和2.5mL的1％铁氰化钾溶液，混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷却，加入2.5mL的10％的三氯乙酸溶液，然后将混合物在5500r/min下离心10min。取2.5mL上层清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1％的氯化铁溶液，混合均匀，放置10min后，在700nm处测定其吸光值。

实施例5

6种糖基化复合物与WPI在不同pH条件下反应后对DPPH自由基清除能力，以及质量分数为0.01％的Vc对DPPH自由基清除能力的比较。将样品稀释成30mg/mL的浓度，取样液1.0mL及4.0mL浓度为0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混匀，室温下避光反应30min，如有沉淀可在5500r/min条件下离心5min。用体积分数为95％乙醇溶液作参比，于517nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率：

清除率(％)＝(1-A_i-A_j/A_c)×100％

式中：A_i：为加样品液后DPPH溶液的吸光值；

A_j：为样品液的吸光值；

A_c：为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。

实施例6

6种糖基化复合物与WPI在不同pH条件下反应后对羟自由基清除能力，以及质量分数为0.01％的Vc对羟自由基清除能力比较。向试管中加入1.00mL蒸馏水、硫酸亚铁溶液1.00mL(浓度为10mmol/L)、水杨酸-乙醇1.00mL(浓度为10mmol/L)、最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，在波长510nm处测定其吸光度值。向试管中加入一系列不同糖基化改性条件的溶液1.00mL(浓度为30mg/mL)，硫酸亚铁溶液1.00mL，水杨酸-乙醇1.00mL，最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min，5500r/min离心7min，在波长510nm下测量吸光度值。

清除率(％)＝[1-(A_S-A₀)/(A_C-A₀)]×100％，

式中：A_C：不加清除剂时吸光度；

A_S：将样品的吸光度；

A₀：空白管吸光度，以水代替样品。

实施例7

6种糖基化复合物与WPI在不同pH条件下反应后抗脂质过氧化能力，以及质量分数为0.01％的BHA的抗脂质过氧化能力比较。脂质体PBS分散体系的制备(LLS)：30mg卵磷脂溶于30mlLPBS(10mmol/l，pH＝7.4)溶液中，与超声波中处理数分钟得到均质的脂质体分散液，冰浴保存备用。三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液，15gTCA，0.375gTBA，2.1mlHCL依次溶于100ml水中。

测定步骤：与样品管中依次加入1mlLLS，1ml400μm/硫酸亚铁溶液和1ml样品，混匀。避光于37℃水浴60min，再加入2ml的TCA-TBA-HCL混合液，100℃水浴15min，迅速冷却，以5500r/min离心10min，取上清液532nm处测得吸光度。

抑制率(％)＝[(As-Ac)/Ac]×100％

式中：As：加样品管吸光度；

Ac：空白管吸光度，以水代替样液。

实施例8

蛋白质侧链是否有糖链结合可通过对SDS-PAGE谱带的考马斯亮蓝R-250染色确认。在凝胶玻璃版中先后加入约7mL分离胶(12％，pH8.8)和1.5mL浓缩胶(5％，pH6.8)。将样品稀释至蛋白质质量浓度为0.75mg/mL，与等体积样品处理液混合后煮沸5min。每孔加样5μL。样品经过浓缩胶时，电压为80V，经过分离胶时，电压为120V，经2.5h后溴酚蓝指示剂到达底端，电泳结束。经考马斯亮兰R-250染色后，由含有甲醇、乙酸的脱色液脱色至条带清晰可见。采用Solarbio的Pretained Protein Maker。

从附图7中的1号样品中可以看出，电泳结果呈现典型的乳清蛋白特征，其中位于图像下端的条带为α-乳白蛋白，上端条带为为β-乳球蛋白。由图中WPI-G和WPI-X的谱带可以看出20.1KDa以下的α-乳白蛋白特征谱带明显减少甚至消失，从而可以判断发生糖基化反应的部分很可能为α-乳白蛋白。另外图中WPI-X的谱带明显上移，即反应后的分子量明显增大，大于97.4KDa，说明美拉德反应进展程度明显；除WPI-G以外，其他5种糖基化产物在43KDa～66.2KDa之间的谱带比WPI清晰，可能是因为α-乳白蛋白经糖基化以后分子量增大，谱带上移导致；6种糖基化产物的考马斯亮蓝染色结果显示WPI-L、WPI-M、WPI-S具有与未处理的WPI几乎有同样的谱带和迁移率，说明乳糖、麦芽糖糖和蔗糖与乳清蛋白糖基化反应的程度很低，这三种糖基化复合物的抗氧化能力低的原因也可能就在于此。

实施例9

选择抗氧化能力好的乳清蛋白糖基化复合物WPI-X、WPI-G，抗氧化能力最差的WPI-S以及未处理的WPI进行傅里叶红外全波长扫描，来进一步判断乳清蛋白糖基化的程度。样品浓度为45％，采用ART法压片，再用傅立叶红外分光光度计作全波段(4000～400cm^-1)扫描。

包括蛋白质分子在内的大分子聚合物的光谱分析是非常复杂的，主要是构成大分子的大量的不同的原子振动所致。而傅里叶红外光谱是一种用来分析蛋白质-碳水化合物系统的特殊实用技术，因为在中红外区蛋白质和碳水化合物的化学指纹图谱是可以明显分开，蛋白质的酰胺I和II键主要集中在1650cm^-1和1540cm^-1范围内，而碳水化合物的特征吸收峰主要集中在1180～953cm^-1范围内，如：C-C和C-O的伸缩振动，C-H的弯曲振动，它们通常被称为糖苷键。从图6中可以看出，WPI-X和WPI-G与WPI和WPI-S相比在1180-953cm^-1处的吸收峰明显增加，是因为乳清蛋白在糖基化以后，导致其复合物在1180-953cm^-1处的吸收峰增加，另外，WPI-X和WPI-G在1650cm^-1和1540cm^-1处的吸收峰减小，说明来自于乳清蛋白的NH₂官能团在减少，这很可能与美拉德反应产物如：羰基化合物(C＝O)，希夫碱(C＝N)，和吡嗪(C-N)的生成有关。另外，WPI-X和WPI-G在1441cm^-1～1398cm^-1以及1300cm^-1～200cm^-1处的峰减弱，主要是来自于蛋白质酰胺键C-N的伸缩振动减弱，进一步证明了，乳清蛋白与木糖、葡萄糖发生糖基化反应明显，而与蔗糖没有发生明显反应。

Claims (5)

1.一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选择6种糖基配体，与乳清蛋白按照一定比例混合，溶解，配制成一定浓度的水溶液，备用；

(2)将溶解好的乳清蛋白和糖溶液分别调至不同的pH，备用；

(3)将调整好pH的乳清蛋白和糖溶液放入具塞试管中，至于烘箱中加热；

(4)控制乳清蛋白与糖反应的温度与时间，制得乳清蛋白糖基化复合物，即最终产品；

(5)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行褐变程度分析；

(6)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行游离氨基浓度浓度测定；

(7)对不同pH条件下的，不同浓度的6种乳清蛋白糖基化复合物进行还原能力及体外抗氧化能力测定，筛选出具有较强抗氧化能力的糖基化复合物及最佳反应条件。

2.根据权利要求1所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(1)所述的选择6种糖基配体，分别为木糖(X)、葡萄糖(G)、果糖(F)、乳糖(L)、蔗糖(S)、麦芽糖(M)，分别按2∶1比例溶解，配制成60mg/ml的水溶液。

3.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性法，其特征在于步骤(2)所述的采用氢氧化钠和盐酸将每一种种乳清蛋白和糖溶液分别调pH(3、4、5、6、7、8、9)，然后放入具塞试管中。

4.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(3)和(4)所述的将不同pH条件下的6种乳清蛋白和糖溶液，置于烘箱中，控制在50℃条件下进行反应，反应7d，即得乳清蛋白糖基化复合物。

5.根据权利要求1所述所述一种改善乳清蛋白抗氧化活性的糖基化改性方法，其特征在于步骤(5)、(6)、(7)所述的对不同pH条件下的6种乳清蛋白 糖基化复合物进行褐变程度分析，游离氨基含量测定以及还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力及抗脂质过氧化能力进行比较，筛选出抗氧化能力较强的乳清蛋白糖基化复合物，及最佳制备了条件，所述的试验方案：

①褐变程度分析

将待测样品采用蒸馏水进行稀释成质量浓度为10mg/ml的溶液，测定其在420nm条件下的吸光值；同时将待测样品采用蒸馏水进行稀释成浓度为5mg/ml的溶液，随时间变化，测定其在294nm条件下的吸光值。

②游离氨基酸含量的测定

采用OPA方法100mL邻苯二甲醛(OPA)试剂含：50mL浓度为0.1mol/L硼酸盐缓冲液，5mL质量分数为20％的SDS溶液，80mg OPA(溶于2mL甲醇)，200μLβ-巯基乙醇。取样品液100μL(浓度为5mg/ml)和3mLOPA试剂混合，室温暗处反应5min后，340nm处测其吸光值。以L-亮氨酸为标准物，按上述方法绘制出L-亮氨酸浓度(0.25～20mmol/l)与吸光值之间的标准曲线回归方程，根据测定样品的吸光值，利用标准曲线方程，计算得出样品中的游离氨基酸浓度。

③还原能力测定

取样品0.5mL(浓度为30mg/ml)的样品，加入2.5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L，pH值为6.6)和2.5mL的1％铁氰化钾溶液，混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷却，加入2.5mL的10％的三氯乙酸溶液，然后将混合物在5500r/min下离心10min。取2.5mL上层清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1％的氯化铁溶液，混合均匀，放置10min后，在700nm处测定其吸光值。

④DPPH自由基清除能力的测定

将样品稀释成30mg/mL的浓度，取样液1.0mL及4.0mL浓度为0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95％)，混匀，室温下避光反应30min，如有沉淀可在5500r/min条件下离心5min。用体积分数为95％乙醇溶液作参比，于517nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率：

清除率＝(1-Ai-Aj/Ac)×100％

式中：Ai：为加样品液后DPPH溶液的吸光值；

Aj：为样品液的吸光值；

Ac：为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。

⑤清除·OH自由基的确定 

利用Fenton反应产生羟基自由基(·OH)，水杨酸能够有效捕捉·OH，生成有色物质2，3-二羟基苯甲酸，其在510nm处有强吸收。

向试管中加入1.00mL蒸馏水、FeSO₄溶液1.00mL(浓度为10mmol/l)、水杨酸-乙醇1.00mL(浓度为10mmol/l)、最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，在波长510nm处测定其吸光度值。向试管中加入一系列不同糖基化改性条件的溶液1.00mL(浓度为30mg/ml)，FeSO₄溶液1.00mL，水杨酸-乙醇1.00mL，最后加H₂O₂(0.03％)1.00mL启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min，5500r/min离心7min，在波长510nm下测量吸光度值。

SA＝[1-(A_S-A₀/A_C-A₀)]×100％

式中：A_C：不加清除剂时吸光度为；

A_S：将样品的吸光度；

A₀：空白管吸光度，以水代替样品。

⑥抗脂质过氧化能力测定

脂质体PBS分散体系的制备(LLS)：30mg卵磷脂溶于30mlL PBS(10mmol/l，pH＝7.4)溶液中，与超声波中处理数分钟得到均质的脂质体分散液，冰浴保存备用。三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液，15gTCA，0.375gTBA，2.1mlHCL依次溶于100ml水中。

测定步骤：与样品管中依次加入1mlLLS，1ml400μm/硫酸亚铁溶液和1ml样品，混匀。避光于37℃水浴60min，再加入2ml的TCA-TBA-HCL混合液，100℃水浴15min，迅速冷却，以5500r/min离心10min，取上清液532nm处测得吸光度。

抑制率(％)＝[(As-Ac)/Ac]×100％

式中：As：加样品管吸光度；

Ac：空白管吸光度，以水代替样液。 

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