CN103304618B - 具有抗炎活性的三萜皂苷类化合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于三萜皂苷类化合物及其制备和应用技术领域，具体为具有抗炎活性的三萜皂苷类化合物、制备方法及其应用。该化合物及它们的光学异构体、药用盐、溶剂合物具有制备抗炎药物的用途，它们可以以其自身的形式施用，也可以和药学上可以接受的载体组成药物组合物而应用；且制备方法简单易行，所得化合物纯度高，具有良好经济效益和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于三萜皂苷类化合物及其制备和应用技术领域，具体涉及从四倍体绞股蓝中提取分离得到的三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
绞股蓝(Gynostemma pentahyllum(Thunb.)Makino)是葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属多年生草质藤本植物。现代研究表明，绞股蓝具有降血糖、降血脂、改善心脑血管系统、增强机体免疫力以及抗肿瘤等广泛的生物活性，且其主要生物活性成分为三萜皂苷类化合物。我们对绞股蓝的化学成分及其生物活性进行了较为系统的研究，发现四倍体绞股蓝的总皂苷含量比二倍体绞股蓝更高，并从四倍体绞股蓝中成功分离得到多个新的三萜皂苷类新化合物，然后进一步对这些化合物进行了抗炎活性的研究。本专利即首次报道了其中六个三萜皂苷类新化合物，及其制备方法和抗炎活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供从四倍体绞股蓝中提取分离得到的三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途，该化合物及它们的光学异构体、药用盐、溶剂合物具有制备抗炎药物的用途，它们可以以其自身的形式施用，也可以和药学上可以接受的载体组成药物组合物而应用；且制备方法简单易行，所得化合物纯度高，具有良好经济效益和应用前景。
本发明提供一种从四倍体绞股蓝中分离得到的新的具有抗炎活性的六个三萜皂苷类化合物，它们的化学结构式分别如下：
其中，
本发明提供上述六种三萜皂苷类化合物的制备方法，包括：
（1）将四倍体绞股蓝地上部分用溶剂提取，浓缩提取液得浸膏；
（2）将浸膏加水溶解得分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取后得到正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得正丁醇部位浸膏；
（3）将正丁醇部位浸膏与硅胶拌样，上样于硅胶柱上，先以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，减压回收溶剂后再次进行硅胶柱色谱层析，用乙酸乙酯-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂后进行ODS填料中压柱色谱，以甲醇-水溶液系统进行梯度洗脱，收集含所述化合物的流份，其中一个流份直接以半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到所述化合物1和2；另一个流份先经过硅胶色谱柱层析，用三氯甲烷-甲醇溶液系统梯度洗脱，减压回收溶剂后，再通过半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到所述化合物3、4、5和6。
所述步骤（1）中为将四倍体绞股蓝的地上部分用溶剂提取2～5次，每次1～3小时，浓缩提取液得浸膏；
所述步骤（1）中的溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮或水中的一种或多种的混合物；
所述步骤（2）中的浸膏与水的质量比为1:2～1:15。
所述步骤（2）中石油醚的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1；
所述步骤（2）中乙酸乙酯的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1；
所述步骤（2）中正丁醇的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1。
所述步骤（3）中，二氯甲烷-甲醇溶液以体积比100:1～1:2进行梯度洗脱；乙酸乙酯-甲醇系统以体积比10:1～1:2进行梯度洗脱；再通过ODS填料中压柱色谱进行分离，以5vol%甲醇-水～100vol%甲醇溶剂依次洗脱，收集含所述化合物的流份；一个流份通过半制备型反相高效液相色谱以30%乙腈-15%甲醇-55%水（vol）的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物1和化合物2。另一个流份进行硅胶色谱柱层析，用三氯甲烷-甲醇系统以体积比5:1～1:1进行梯度洗脱，再通过半制备型反相高效液相色谱以40vol%乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物3和化合物4；再通过半制备型反相高效液相色谱以37.5vol%乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物5和化合物6。
所述步骤（3）中，二氯甲烷-甲醇溶液以体积比100:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2进行梯度洗脱；乙酸乙酯-甲醇系统以体积比10:1、5:1、2:1、1:1、1:2进行梯度洗脱；再通过ODS填料中压柱色谱进行分离，以5vol%甲醇-水、20vol%甲醇-水、40vol%甲醇-水、60vol%甲醇-水、80vol%甲醇-水、100vol%甲醇溶剂系统依次洗脱，收集含所述化合物的流份。
本发明提供上述六种三萜皂苷类化合物在制备抗炎药物中的应用。
根据本领域公知的筛选对脂多糖（LPS）诱导的RAW246.7小鼠巨噬细胞中IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA表达水平有抑制作用的化合物的方法，研究发现化合物1-6以及它们的光学异构体、药用盐、溶剂合物均能显著抑制脂多糖（LPS）引起的小鼠巨噬细胞RAW264.7中IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA的表达水平，且多呈剂量依赖关系，表明本发明所述化合物具有明显的抗炎活性，可用于抗炎药物的制备。
采用有效剂量的本发明所述的化合物1-6及它们的光学异构体、药用盐、溶剂合物的一种或多种作为活性成分与常规药用载体制备成药物组合物，可以按常规方法制备成口服或注射用途的常规剂型。通常的，载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加剂中的一种或多种。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明通过从四倍体绞股蓝中提取分离得到了六个新的三萜皂苷类化合物，该化合物及它们的光学异构体、药用盐、溶剂合物具有制备抗炎药物的用途，它们可以以其自身的形式施用，也可以和药学上可以接受的载体组成药物组合物而应用；
（2）本发明提供制备方法简单易行，可在通用设备中完成，且制备所得化合物纯度高，具有良好经济效益和应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）制备四倍体绞股蓝提取物
所用原料为葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属植物绞股蓝[G.pentahyllum(Thunb.)Makino]的四倍体，产于陕西省平利县。采集地上部分，干燥后粉碎，取3.8kg，每次用4L甲醇于65-70°C加热回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收甲醇，得提取物浸膏800g；
（2）提取三萜皂苷类化合物
将上述800g浸膏加水4800ml分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位。取正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得正丁醇部位浸膏390g；
（3）分离纯化
将正丁醇部位浸膏与硅胶（100-200目）拌样，上样于常规硅胶（100-200目）色谱柱上，用二氯甲烷-甲醇系统以体积比100:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2进行梯度洗脱，每份2000ml，共收集洗脱液27份，将7-16份合并（223g），减压回收溶剂后再上硅胶（200-300目）色谱柱，用乙酸乙酯-甲醇系统以体积比10:1、5:1、2:1、1:1、1:2进行梯度洗脱，每份1000ml，共收集洗脱液72份，将33-69份合并（12g），减压回收溶剂后通过ODS填料（50μm）中压柱色谱进行分离，以5vol%甲醇-水、20vol%甲醇-水、40vol%甲醇-水、60vol%甲醇-水、80vol%甲醇-水、100vol%甲醇溶剂系统依次洗脱，每份60ml，共收集1600份，合并871-960份（910mg），1021-1080份（1200mg），分别减压回收溶剂，得到浓缩样品。其中871-960份通过半制备型反相高效液相色谱以30%乙腈-15%甲醇-55%水（vol）的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物1（264mg），2（44mg）。1021-1080份进行硅胶（200-300目）色谱柱层析，用三氯甲烷-甲醇系统以体积比5:1、1:1进行梯度洗脱，每份500ml，共收集11份，取第2份（53mg）减压回收溶剂，再通过半制备型反相高效液相色谱以40vol%乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物3（4mg），4（9mg）；取第6份（50mg）减压回收溶剂，再通过半制备型反相高效液相色谱以37.5vol%乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物5（5mg），6（11mg）。其中，半制备反相高效液相色谱均使用Waters SunFire OBD-C18柱（250mm×19mm i.d.,5μm），流动相流速均为4ml/min，检测波长均为205nm。
经核磁共振波谱测试确定化合物1-6的化学结构，它们的理化性质和波谱数据分别为：
化合物1：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z911.4998[M-H]-(calculated for C47H75O17,911.5004)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
化合物2：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z911.4999[M-H]-(calculated for C47H75O17,911.5004)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
化合物3：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z911.5005[M-H]-(calculated for C47H75O17,911.5004)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
化合物4：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z911.5005[M-H]-(calculated for C47H75O17,911.5004)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
化合物5：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z911.5005[M-H]-(calculated for C47H75O17,911.5004)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
化合物6：白色无定型粉末，HRESIMS:m/z881.4916[M-H]-(calculated for C46H73O16,881.4899)；1H和13C-NMR数据见表1和表2；
表1.化合物1-6的1H-NMR（Pyridine-d5,500MHz）数据
表2.化合物1-6的13C-NMR（Pyridine-d5,125MHz）数据
实施例2
抗炎活性试验
将单体化合物1-6分别作用于脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞，通过检测RAW264.7细胞中IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA的表达水平来检测其抗炎活性。
1.药物溶液的配制
（1）将单体化合物1-6分别用DMSO配制成100μg/ml溶液，置于-4℃保存；
（2）LPS：E.Coli O111:B4（美国默克密理博公司，产品编号：LPS25），用重蒸水配制成100μg/mL溶液，-20℃保存。
2.细胞株：RAW264.7小鼠巨噬细胞，由中国科学研究院上海分院提供。
3.试验方法：
按常规复苏细胞并且传代培养，使用DMEM+10%PBS+1%双抗（青霉素、链霉素）的完全培养基，接种细胞到6孔细胞培养板，每孔细胞悬液2ml，细胞数为1.5×105个；每个化合物按每孔不同药物浓度分成2组，即100μg/ml和10μg/ml组，置于5%CO2培养箱于37℃培养48小时，加入LPS（终浓度为10ng/ml），诱导4小时，每孔加入1ml TRIzol试剂提取RNA，用RNA反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，用实时定量PCR方法（Real Time-PCR）进行IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA的表达水平检测，对检测数据进行统计分析，以确定药物预处理对于LPS诱导的炎症反应是否具有抑制作用。结果如表3所示。
表3.化合物1-6对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA表达水平相对值的影响（平均值±方差）
注：*P<0.05，**P<0.01；药物预处理组vs DMSO+LPS组
由表3中数据可见，化合物1-6均能显著抑制脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中IL-1β，COX-2和TNF-αmRNA的表达水平，且多呈剂量依赖关系，表明本发明所述化合物具有明显的抗炎活性。因此，可以用于制备新的抗炎活性药物。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然而其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更改与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。
Claims (6)
1.一种具有抗炎活性的三萜皂苷类化合物的制备方法，具体步骤包括：
(1)将四倍体绞股蓝地上部分用溶剂提取，浓缩提取液得浸膏；
(2)将浸膏加水溶解得分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取后分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位；取正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得正丁醇部位浸膏；
(3)将正丁醇部位浸膏与硅胶拌样，上样于硅胶柱上，先以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，减压回收溶剂后再次进行硅胶柱色谱层析，用乙酸乙酯-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂后进行ODS填料中压柱色谱，以甲醇-水溶液系统进行梯度洗脱，收集含所述化合物的流份，其中一个流份直接以半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到所述化合物1和2；另一个流份先经过硅胶色谱柱层析，用三氯甲烷-甲醇溶液系统梯度洗脱，减压回收溶剂后，再通过半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到所述化合物3、4、5和6；其中：
所述步骤(3)中，二氯甲烷-甲醇溶液以体积比100:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2进行梯度洗脱；乙酸乙酯-甲醇系统以体积比10:1、5:1、2:1、1:1、1:2进行梯度洗脱；再通过ODS填料中压柱色谱进行分离，以5vol％甲醇-水、20vol％甲醇-水、40vol％甲醇-水、60vol％甲醇-水、80vol％甲醇-水、100vol％甲醇溶剂系统依次洗脱，收集含所述化合物的流份；其中一个流份通过半制备型反相高效液相色谱以30vol％乙腈-15vol％甲醇-55vol％水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物1，2；另一个流份先进行硅胶色谱柱层析，用三氯甲烷-甲醇系统以体积比5:1、1:1进行梯度洗脱得到含化合物3，4，5和6的混合物流份；从混合物流份中选取其中一个流份进行减压回收溶剂，再通过半制备型反相高效液相色谱以40vol％乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物3，4；从混合物流份中选取另一个流份进行减压回收溶剂，再通过半制备型反相高效液相色谱以37.5vol％乙腈-水的溶剂系统进行分离纯化，得到化合物5，6；
所述具有抗炎活性的三萜皂苷类化合物的化学结构式分别为：
其中，
2.根据权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为将四倍体绞股蓝的地上部分用溶剂提取2～5次，每次1～3小时，浓缩提取液得浸膏；所述溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮或水中的一种或多种的混合物。
3.根据权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的浸膏与水的质量比为1:2～1:15。
4.根据权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中石油醚的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1。
5.根据权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙酸乙酯的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1。
6.根据权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中正丁醇的加入量与分散液的体积比为1:2～5:1。
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