CN103304564A - 含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物及其制备方法和医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物及其制备方法和医药用途，产品具有通式Ⅰ的结构。本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物例如烷化剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、DNA插入剂联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。本发明包括含有通式Ⅰ化合物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物、阿尔茨海默病药物和帕金森病药物中的应用。这些其他抗肿瘤药物或放射治疗可以与本发明化合物同时或在不同时间给予。这些联合治疗可以产生协同作用从而有助于改善治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一类含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物及其药学上可接受的盐，它们的制备方法，含有这些衍生物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备恶性肿瘤、阿尔茨海默和帕金森病药物中的应用。
背景技术
β-咔啉类衍生物是一类天然的吲哚生物碱，广泛的分布于自然界。这类化合物具有广泛的生物活性，但其毒性却非常低，吸引了药物化学家对其进行开发研究的兴趣，最近的研究表明β-咔啉作用于多个生物靶点，因此表现出广谱的药理活性，尤其在抗肿瘤活性方面的应用。近年来研究发现，利用β-咔啉生物碱来设计新的药物分子，通常在β-咔啉的1位和3位进行适当的取代往往能够增强其抗肿瘤活性，降低毒性，在β-咔啉的3位引入碱性基团，能够大大增强其与DNA的亲和性等构效关系信息，这也为β-咔啉类化合物在其它领域的应用提供了基础。
组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂(HDACi)是通过抑制HDACs的酶活性，阻碍组蛋白的去乙酰化，使染色体结构松弛，促进转录因子和DNA结合，能有效抑制肿瘤细胞增殖，导致细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，提高放化疗的敏感性。因此，HDACs成为抗癌药物设计的新靶点，开发HDACs抑制剂被视为肿瘤治疗一个有效的策略。同时，近来研究发现HDAC6参与调节Tau蛋白磷酸化、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)影响线粒体运输等有关的生化过程，提示HDAC6可能与AD的发生有关，是治疗AD的潜在靶点。但目前β-咔啉类化合物应用于组蛋白去乙酰化酶抑制剂方面的报道相对较少，仅得到了初步的应用。
Mikana Therapeutics公司成功研制了带有取代基的四氢γ-咔啉作为表面识别区的羟肟酸系列化合物，对人乳腺癌细胞株MCF-7抗增殖作用显示良好效果（Anandan S K,Xiao X,Ward J S,et al.WO2006088949,2006.）。Kozikowski小组报道了含有四氢γ-咔啉骨架的HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A，其对HDAC6抑制作用为IC50=0.015μM（Butler K V,Kalin J,Brochier C,et al.J.Am.Chem.Soc.2010,132(31),10842-10846.），2012年该课题组又报道了对该类化合物的进一步优化和改造，其中对选择性最强的化合物对于HDAC6的IC50值为1.44nM，其选择性为HDAC1(IC50=l0.3μM)的7152倍，可以加强Foxp3+调节T细胞的免疫作用，抑制效应T细胞的有丝分裂（Kalin J H,Butler K V,Akimova T,et al.J.Med.Chem.2012,55(2),639-651.）。
研究组蛋白去乙酰化药效团模型时发现，大多数抑制剂都有相同的药效团模型：以SAHA为例，锌离子螯合区(ZBG)，与口袋底部的锌离子产生螯合作用，主要包括羟肟酸、苯甲酰胺、环酮、硫醇等（Miller,T.A.;Witter,D.J.;Belvedere,S.J.Med.Chem.2003,46(24),5097-5116.）；表面识别区(CAP)，与酶活性口袋周围的氨基酸残基发生相互作用，主要包括一些带有取代基的芳香，环肽化合物等；以及连接这两部分的填充于疏水管状空腔的链接区(Link)，包括饱和和不饱和的脂肪链或者是环状的芳香基团等。本项目以β-咔啉芳环看做CAP区，在β-咔啉3位羧酸上引入不同碳链长度的氨基酸作为疏水管状空腔的链接区，末端采用羟肟酸基团作为锌离子螯合区(ZBG)。从而为获得含有羟肟酸结构片段的新型骨架的β-咔啉类生物碱衍生物，深入研究其对肿瘤细胞抑制作用，发现该类化合物对多种肿瘤细胞（包括肝癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等）增殖都具有强烈的抑制效果，并能够显著诱导肿瘤细胞凋亡。深入研究这类化合物的药物作用机制和生物学特性，本发明公开了一类具有药用价值羟肟酸类β-咔啉衍生物及其药学上可接受的盐，目前尚未见对此类化合物的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有药用价值的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物及其制备方法和医药用途。
本发明的技术解决方案是：
一种含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物，具有下述通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：R代表H或叔丁氧羰基或CH3(CH2)n-，n=0～3；
R1代表H或CH3(CH2)m-，m=0～3；或者R1代表对甲氧基苯基，2-氯苯基，3-硝基苯基，4-氯苯基，2-溴苯基，4-溴苯基，4-(N,N-二甲基)-苯基；
-NH-R2-CO-选自构型甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者-NH-R2-CO-还可以代表-NH(CH2)pCO-，p=3～7；或者-NH-R2-CO-代表
o=0～5。
所述通式Ⅰ的结构中的R、R1和-NH-R2-CO-选自如下组合：
R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者R=H，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=CH3，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
一种含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物制得的医学上可接收的盐，其特征在于：是通式Ⅰ化合物的盐。
一种所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
L-色氨酸(1)与不同取代醛在酸或碱催化下通过Pictet–Spengler反应得到1位不同取代1,2,3,4-四氢-β-咔啉衍生物(2)，1,2,3,4-四氢-β-咔啉衍生物(2)的3-位羧基与甲醇在二氯亚砜作用下酯化后得到化合物(3)，再经硫去氢得到1位不同取代β-咔啉-3-羧酸甲酯(4)；β-咔啉-3-羧酸甲酯(4)与(Boc)2O或卤代烃得到N-9叔丁氧羰基或N-9-alkyl取代的化合物(5)。化合物(5)经1N的NaOH溶液水解得到不同取代的β-咔啉-3-羧酸(6)；β-咔啉-3-羧酸(6)经氯甲酸乙酯和N-甲基吗啉作用制成混合酸酐后与各种氨基酸甲酯反应得到中间体(7)；中间体(7)与盐酸羟胺在氢氧化钾的甲醇溶液下反应制得通式化合物(8)，化合物(8)中9-位为Boc取代的化合物经三氟乙酸脱去Boc得到化合物(9)，其中化合物(8)和(9)均属于通式Ⅰ所述化合物，具体合成路线如下：
其中，R1代表H或CH3(CH2)m-，m=0～3或者R1代表对甲氧基苯基，2-氯苯基，3-硝基苯基，4-氯苯基，2-溴苯基，4-溴苯基，4-(N,N-二甲基)-苯基；
-NH-R2-CO-选自构型甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者-NH-R2-CO-还可以代表-NH(CH2)pCO-，p=3～7；或者-NH-R2-CO-代表
o=0～5。
化合物(5-8)中R代表叔丁氧羰基或CH3(CH2)n-，n=0～3。
一种药物组合物，由治疗上有效剂量的通式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或辅料的药物组成的组合物。
一种所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗恶性肿瘤、阿尔茨海默、帕金森病的药物中的应用。
所述恶性肿瘤是指肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌及胃癌。
本发明化合物可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药。例如，溶剂、稀释剂等，可以用口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%～90%重量的活性成分，更常见约15%～60%之间重量的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物例如烷化剂（如环磷酰胺或顺铂）、抗代谢药（如5-氟尿嘧啶或羟基脲）、拓扑异构酶抑制剂（如喜树碱）、有丝分裂抑制剂（如紫杉醇或长春碱）、DNA插入剂（如阿霉素）联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。这些其他抗肿瘤药物或放射治疗可以与本发明化合物同时或在不同时间给予。这些联合治疗可以产生协同作用从而有助于改善治疗效果。
本发明化合物的部分药理试验结果如下：
（1）四甲基氮唑蓝比色法（MTT）体外抗肿瘤试验
药理实验结果表明：本发明化合物Ⅰ1-Ⅰ33对人类肿瘤细胞的增殖具有不同程度的抑制作用，大部分化合物抗肿瘤活性显示出比阳性对照药SAHA稍强或相当。多数化合物抗肿瘤活性经过一系列肿瘤细胞测试，尤其表1中Ⅰ7-Ⅰ8，Ⅰ16-Ⅰ17和Ⅰ23-Ⅰ33化合物在25μmol/L浓度下抑制率均超过阳性对照药SAHA。
表1本发明部分化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率%(25μmol/L)
ND:未检测.
（2）凋亡活性测试
实验结果发现：化合物Ⅰ1-Ⅰ33均不同程度上显示出诱导肿瘤细胞凋亡作用，其中化合物Ⅰ7-Ⅰ8，Ⅰ16-Ⅰ17和Ⅰ23-Ⅰ33在6.125μM和12.5μM浓度下可以显著促进肿瘤细胞凋亡，并且随着药物浓度的增加早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞数量显著增加，提示新型含有羟肟酸的β-咔啉类生物碱衍生物具有较强的促进肿瘤细胞凋亡作用。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（Ⅰ1）的制备
1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸（2a）
将L-色氨酸（10.2g,50mmol）溶解于20ml2.5mol/L的H2SO4溶液中，加入13.8ml40%乙醛溶液（115mmol），60℃下搅拌2h。反应完毕，用2M的HCl将反应液调至PH=5，析出大量白色固体，抽滤，用水洗涤，真空干燥得到白色固体9.8g，产率85.2%。
1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯（3a）
将2a（11.5g,50mmol）溶于100ml甲醇中，-5℃低温剧烈搅拌下缓慢滴加10.9ml SOCl2（17.85g,150mmol），半小时后加热回流2h，反应完毕加压浓缩除去溶剂，浓缩物中加入适量水溶解，用1M NaOH溶液调PH至8，析出白色固体，抽虑，滤饼减压干燥得到白色固体11.4g，产率93.4%。
1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯（4a）
将3a（12.2g,50mmol）溶于100ml DMF溶剂中，-5℃机械搅拌下，分批加入KMnO4(11.05g,70mmol)，继续搅拌0.5h后，抽滤，反应液加入到200ml冷水中，析出沉淀，抽虑得淡棕色固体；溶液再用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，浓缩，与抽虑固体合并得8.4g，总收率69.0%。
1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-羧酸甲酯（5a）
将4a（0.96g,4mmol）溶于10mL CH2Cl2和10mL丙酮的混合溶剂，加入催化量的DMAP，滴加(Boc)2O（2.6mL,12mmol），室温搅拌，直至TLC检测反应完全。蒸干溶剂，加入20mL水，乙酸乙酯萃取（20mL×3），合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕黄色固体1.19g，收率87.5%。
1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-羧酸（6a）
将5a(0.68g,2.0mmol)溶于20mL甲醇溶液中，加入氢氧化钠(0.16g,4.0mmol)的2mL水溶液，60℃下搅拌2h，蒸除反应液中的甲醇后，加入10mL水，调Ph至5-6，析出固体，抽滤干燥得到淡黄色固体0.54g，收率83.1%。
N-(2-(甲氧)-2-氧杂乙基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7a）的制备
将6a(0.4g,1.77mmol)溶于10mL无水THF和5mL无水DMF的混合溶液中，加入N-甲基吗啉(0.27g,2.65mmol)，在冰浴下缓慢滴加氯甲酸乙酯(0.23g,2.14mmol)，滴毕在室温下搅0.5h。在冰浴下将上述混合溶液滴加到甘氨酸甲酯(0.17g,1.95mmol)和三乙胺(0.26g,2.65mmol)的10mL无水THF溶液中，滴毕在室温搅拌2h，蒸除反应液中的THF加入100mL水，乙酸乙酯（3×50mL）萃取，合并有机层，清水洗（30mL×2），饱和食盐水（30mL）洗，干燥，过滤，浓缩得黄色油状物0.42g，收率79.2%。
N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I1）的制备
将盐酸羟胺(1.74g,25mmol)溶解于10mL甲醇中，冰浴下向其中缓慢加入氢氧化钾(1.40g，25mmol)的10mL甲醇溶液，室温搅拌1h后过滤，冰浴下向滤液中加入3a(0.15g，0.5mmol)的5mL甲醇溶液，室温搅拌0.5h后加入氢氧化钾(0.06g,1.0mmol)，再继续室温反应24h后，浓缩，柱层析得到0.09g黄色固体，收率60.1%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.75(s,1H,H-4),8.70(m,1H,NHCH2),8.28(m,1H,H-5),8.10(m,1H,H-8),7.56(m,H,H-6),7.30(m,1H,H-7),4.24(m,2H,CH2),2.91(s,3H,1-CH3),1.99(s,1H,OH),1.24(s,9H,-C(CH3)3).ESI-MS(m/z):399[M+H]+.
实施例2N-(2-(羟氨基)-2-氧杂乙基)-1-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I2）的制备
将I1（0.1g,0.25mmol）溶于CF3COOH/CH2Cl2(v/v=1:1,共10mL)，室温搅拌过夜，反应完全后，蒸除溶剂得到I2，收率94.9%。ESI-MS(m/z):299[M+H]+.
实施例3N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I3）的制备
N-(4-(甲氧基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7b）的制备
参照7a的制备方法，由6a和γ-丁氨酸甲酯制得黄色油状物，收率73.8%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I3）的制备
参照I1的制备方法，由7b和羟胺制得黄色固体，收率66.1%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.76(s,1H,H-4),δ8.69(m,1H,NHCH2),8.27(m,1H,H-5),8.08(m,1H,H-8),7.60(m,H,H-6),7.28(m,1H,H-7),3.79(m,2H,NCH2),2.92(s,3H,CH3),2.67(m,2H,CH2C=O),2.01(s,1H,OH),1.91(m,2H,CH2CH 2CH2),1.26(s,9H,-C(CH3)3).ESI-MS(m/z):427[M+H]+.
实施例4N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I4）的制备
参照I2的制备方法，由I3制得黄色固体，收率89.5%。ESI-MS(m/z):327[M+H]+.
实施例5N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I5）的制备
N-(5-(甲氧基)-5-氧杂戊基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7c）的制备
参照7a的制备方法，由6a和5-戊氨酸甲酯制得黄色油状物，收率73.6%。
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I5）的制备
参照I1的制备方法，由7c和羟胺制得黄色固体，收率66.7%。1H NMR(CDCl3,300MHz):8.70(s,1H,H-4),δ8.65(m,1H,NHCH2),8.30(m,1H,H-5),8.09(m,1H,H-8),7.61(m,H,H-6),7.28(m,1H,H-7),3.55(m,2H,NCH2),2.89(s,3H,CH3),2.29(m,2H,CH2C=O),1.98(s,1H,OH),1.80-1.84(m,4H,CH2CH 2CH 2CH2),1.27(s,9H,-C(CH3)3).ESI-MS(m/z):441[M+H]+.
实施例6N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I6）的制备
参照I2的制备方法，由I5制得黄色固体，收率90.2%。ESI-MS(m/z):341[M+H]+.
实施例7(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I7）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7d）的制备
参照7a的制备方法，由6a和(E)-4-氨基苯丙烯酸甲酯制得黄色油状物，收率76.0%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺I7的制备
参照I1的制备方法，由7d和羟胺制得黄色固体，收率66.5%。8.71(s,1H,H-4),δ8.60(m,1H,NHCH2),8.30(m,1H,H-5),8.04(m,1H,H-8),7.68(m,3H,Ar-H,ArCH),7.58(m,H,H-6),7.51(m,2H,Ar-H),7.28(m,1H,H-7),6.42(m,1H,C=OCH),2.87(s,3H,CH3),2.01(s,1H,OH),1.27(s,9H,-C(CH3)3).ESI-MS(m/z):487[M+H]+.
实施例8(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I8）的制备
参照I2的制备方法，由I7制得黄色固体，收率88.4%。ESI-MS(m/z):387[M+H]+.
实施例9N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I9）的制备1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯（5d）
将4a（0.96g,4mmol）溶于15mL DMF中，冰浴下缓慢加入60%NaH(0.24g,6mmol),连续搅拌1h后，缓慢滴加CH3I00.78mL(12mmol),冰浴下搅拌1h后继续室温搅拌1h。反应完全后，反应液缓慢倾入30mL冰水中，析出沉淀。抽虑得棕黄色固体，水液继续用乙酸乙酯萃取（30mL×3），有机层饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕黄色固体，合并固体，总收率87.5%。
1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-羧酸（6d）
参照6a合成方法，5d水解后得到灰白色固体6d，收率82.6%。
N-(4-(甲氧)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7e）的制备
参照7a合成方法，由6d和丁氨酸甲酯得到黄色油状物，收率79.5%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I9）的制备
参照I1的制备方法，由7e和羟胺制得黄色固体，收率68.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.64(s,1H,H-4),8.55(m,1H,H-5),8.33(m,1H,H-8),7.72-7.73(m,2H,C=ONH),7.61(m,1H,H-6),7.28(m,1H,H-7),4.18(s,3H,N9-CH3),3.64(m,2H,NCH2),3.05(s,3H,CH3),2.67(m,2H,CH2C=O),2.01(s,1H,OH),1.93(m,2H,CH2CH 2CH2).ESI-MS(m/z):341[M+H]+.
实施例10(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I10）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7f）的制备
参照7a的制备方法，由6d和(E)-4-氨基苯丙烯酸甲酯制得黄色油状物，收率59.5%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺I10的制备
参照I1的制备方法，由7f和羟胺制得黄色固体，收率63.7%。ESI-MS(m/z):401[M+H]+.
实施例11N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I11）的制备
N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7g）的制备
参照7a的制备方法，由6d和(E)-4-氨基苯丙酸甲酯制得黄色油状物，收率76.3%。
N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-1-甲基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺I11的制备
参照I1的制备方法，由7g和羟胺制得黄色固体，收率62.5%。ESI-MS(m/z):403[M+H]+.
实施例12N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I12）的制备1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸（2b）
将L-色氨酸（5.1g,25mmol）溶解于100ml0.25mol/L的NaOH溶液中，加入3.8ml甲醛溶液（50mmol），N2保护下于室温搅拌2h，然后于38℃反应4h。反应完毕，用2M的HCl将反应液调至PH=5，析出大量白色固体，抽滤，用水及甲醇洗涤，所得粗品用热甲醇洗涤，真空干燥得到白色固体4.2g，产率82.0%。β-咔啉-3-羧酸（6b）
参照合成6a的方法，由2b制得3b，4b，5b，然后制得淡黄色固体6b,总收率46.7%。
N-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7h）的制备
参照7a的制备方法，由6b和甘氨酸甲酯制得黄色油状物，收率79.2%。
N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I12）的制备
参照I1的制备方法，由7h和羟胺制得黄色固体，收率64.0%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.85(s,1H,H-1),8.75(s,1H,H-4),8.27(m,1H,NHCH2),8.16(m,1H,H-5),7.70(m,H,Ar-H),7.56(m,1H,H-8),7.49(m,1H,Ar-H),7.43(m,1H,Ar-H),7.37(m,1H,H-6),7.32(m,1H,H-7),3.85(m,2H,NCH2),2.71(m,2H,CH2C=O),1.99(s,1H,OH),1.26(s,9H,-C(CH3)3);ESI-MS(m/z):399[M+H]+.
实施例13N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I13）的制备
参照I2的制备方法，由I12制得黄色固体，收率63%。ESI-MS(m/z):299[M+H]+.
实施例14N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I14）的制备
N-(4-(甲氧基)-4-氧杂丁基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7i）的制备
参照7a的制备方法，由6b和γ-丁氨酸甲酯制得黄色油状物，收率83.8%。
N-(2-(羟氨基)-2-氧杂丁基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I14）的制备
参照I1的制备方法，由7i和羟胺制得黄色固体，收率67.1%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.89(s,1H,H-1),8.70(s,1H,H-4),8.28(m,1H,NHCH2),8.20(m,1H,H-5),7.71(m,H,Ar-H),7.52(m,1H,H-8),7.45(m,1H,Ar-H),7.38(m,1H,Ar-H),7.36(m,1H,H-6),7.30(m,1H,H-7),3.68(m,2H,NCH2),2.63(m,2H,CH2C=O),1.99(s,1H,OH),1.91(m,2H,CH2CH 2CH2),1.26(s,9H,-C(CH3)3);ESI-MS(m/z):413[M+H]+.
实施例15N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I15）的制备
参照I2的制备方法，由I14制得黄色固体，收率63.8%。ESI-MS(m/z):313[M+H]+.
实施例16(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I16）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7j）的制备
参照7a的制备方法，由6b和(E)-4-氨基苯丙烯酸甲酯制得黄色油状物，收率50.7%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I16）的制备
参照I1的制备方法，由7j和羟胺制得黄色固体，收率60.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.87(s,1H,H-1),8.78(s,1H,H-4),8.31(m,1H,NHCH2),8.19(m,1H,H-5),7.69-7.71(m,3H,Ar-H,ArCH),7.50(m,1H,H-8),7.41(m,1H,Ar-H),7.36(m,1H,H-6),7.28(m,1H,H-7),6.45(d,1H,CH2C=O),1.99(s,1H,OH),1.26(s,9H,-C(CH3)3);;ESI-MS(m/z):473[M+H]+.
实施例17(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I17）的制备
参照I2的制备方法，由I17制得黄色固体，收率86.3%。ESI-MS(m/z):373[M+H]+.
实施例18N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I18）的制备9-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯（5e）
参照5d的合成方法，由4b制得棕黄色固体，收率82.4%9-甲基-β-咔啉-3-羧酸（6e）
参照6a合成方法，5e水解后得到黄白色固体，收率88.3%。
N-(4-(甲氧)-4-氧杂丁基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7k）的制备
参照7a合成方法，由6e和γ-丁氨酸甲酯得到黄色油状物，收率84.7%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I18）的制备
参照I1的制备方法，由7k和羟胺制得黄色固体，收率71.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.89(s,1H,H-1),8.70(s,1H,H-4),8.26(m,1H,NHCH2),8.17(m,1H,H-5),7.60(m,1H,H-8),7.40(m,1H,H-6),7.32(m,1H,H-7),4.18(s,1H,N9-CH3),3.69(m,2H,NCH2),3.01(s,3H,CH3),2.64(m,2H,CH2C=O),2.01(s,1H,OH),1.89(m,2H,CH2CH 2CH2);ESI-MS(m/z):327[M+H]+.
实施例19N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I19）的制备
N-(5-(甲氧)-5-氧杂戊基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7l）的制备
参照7a合成方法，由6e和5-己氨酸甲酯得到黄色油状物，收率80.1%。
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I19）的制备
参照I1的制备方法，由7l和羟胺制得黄色固体，收率65.4%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.84(s,1H,H-1),8.78(s,1H,H-4),8.27(m,1H,NHCH2),8.20(m,1H,H-5),7.58(m,1H,H-8),7.38(m,1H,H-6),7.32(m,1H,H-7),4.19(s,1H,N9-CH3),3.61(m,2H,NCH2),2.36(m,2H,CH2C=O),1.99(s,1H,OH),1.85(m,4H,CH2CH 2CH 2CH2).;ESI-MS(m/z):341[M+H]+.
实施例20N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I20）的制备
N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基)苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7m）的制备
参照7a的制备方法，由6e和(E)-4-氨基苯丙酸甲酯制得黄色油状物，收率70.8%。
N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺I20的制备
参照I1的制备方法，由7m和羟胺制得黄色固体，收率62.4%。ESI-MS(m/z):389[M+H]+.
实施例21N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I21）的制备
1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸（2c）
将L-色氨酸（10.2g,50mmol）溶解于100mL乙酸中，加入6.6ml茴香醛溶液（55mmol），回流反应2h。反应完毕，加入100mL水，乙酸乙酯洗涤(50mL×3)，水层用氨水将反应液调至PH=5，析出大量棕白色固体，抽滤。所得粗品用热乙醇洗涤，真空干燥得到白色固体13.1g，产率81.4%。
1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-羧酸（6c）的制备
参照合成6a的方法，由2c甲酯化，氧化和Boc保护分别制得3c，4c，5c，然后水解制得淡黄色固体6c,总收率50.2%。
N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7n）的制备
参照7a的制备方法，由6c和丙氨酸甲酯制得黄色油状物，收率84.3%。
N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I21）的制备
参照I1的制备方法，由7n和羟胺制得黄色固体，收率71.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.70(s,1H,H-4),8.62(m,1H,NHCH2),8.20(d,1H,J=8.40Hz,H-5),8.14(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.74(d,2H,J=8.79Hz,Ar-H),7.64(m,1H,H-6),7.48(m,1H,H-7),7.06(d,2H,J=8.79Hz,Ar-H),3.89(s,3H,OCH3),3.77(m,2H,NCH2),2.74(m,2H,CH2C=O),2.03(s,1H,OH),1.36(s,9H,-C(CH3)3).MS(ESI)m/z=505[M+1]+.
实施例22N-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基)-1-(4-甲氧基苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I22）的制备
参照I2的制备方法，由I21制得黄色固体，收率92.0%.MS(ESI)m/z=405[M+1]+.
实施例23N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I23）的制备
N-(4-(甲氧基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7o）的制备
参照7a的制备方法，由6c和γ-丁氨酸甲酯制得黄色油状物，收率82.5%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I23）的制备
参照I1的制备方法，由7o和羟胺制得黄色固体，收率72.0%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.70(s,1H,H-4),8.46(m,1H,NHCH2),8.19(d,1H,J=7.20Hz,H-5),8.16(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.84(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.65(m,1H,H-6),7.47(m,1H,H-7),7.06(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),3.89(s,3H,OCH3),3.58(m,2H,NCH2),2.32(m,2H,CH2C=O),1.99(s,1H,OH),1.89(m,2H,CH2CH 2CH2),1.27(s,9H,-C(CH3)3).MS(ESI)m/z=519[M+1]+.
实施例24N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I24）的制备
参照I2的制备方法，由I23制得黄色固体，收率86.4%。ESI-MS(m/z)=419[M+H]+.
实施例25N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I25）的制备
N-(5-(甲氧基)-5-氧杂戊基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7p）的制备
参照7a的制备方法，由6c和5-戊氨酸甲酯制得黄色油状物，收率82.1%。
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I25）的制备
参照I1的制备方法，由7p和羟胺制得黄色固体，收率69.7%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.70(s,1H,H-4),8.42(m,1H,NHCH2),8.17(d,1H,J=7.20Hz,H-5),8.16(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.85(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.66(m,1H,H-6),7.45(m,1H,H-7),7.06(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),3.89(s,3H,OCH3),3.55(m,2H,NCH2),2.29(m,2H,CH2C=O),1.98(s,1H,OH),1.80-1.84(m,4H,CH2CH 2CH 2CH2),1.26(s,9H,-C(CH3)3).MS(ESI)m/z=533[M+1]+.
实施例26N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-(4-甲氧基苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I26）的制备
参照I2的制备方法，由I25制得黄色固体，收率90.6%。MS(ESI)m/z=433[M+1]+.
实施例27N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-1-(3-硝基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I27）的制备
N-(6-(甲氧基)-6-氧杂己基)-1-(3-硝基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7q）的制备
参照7a的制备方法，由6c和6-己氨酸甲酯制得黄色油状物，收率80.5%。
N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-1-(3-硝基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I27）的制备
参照I1的制备方法，由7q和羟胺制得黄色固体，收率63.5%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.72(s,1H,H-4),8.26(m,1H,NHCH2),8.19(d,1H,J=7.41Hz,H-5),8.18(d,1H,J=7.77Hz,H-8),7.85(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.64(m,1H,H-6),7.46(m,1H,H-7),7.16(m,2H,Ar-H),3.53(m,2H,NCH2),2.39(m,2H,CH2CO),2.06(s,1H,OH),1.71(m,4H,CH2(CH 2CH2)2),1.49(m,2H,CH 2(CH2CH2)2),1.29(s,9H,-C(CH3)3).MS(ESI)m/z=562[M+1]+.
实施例28N-(6-(羟氨基)-6-氧杂己基)-1-(3-硝基苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I28）的制备
参照I2的制备方法，由I27制得黄色固体，收率91.4%。MS(ESI)m/z=462[M+1]+.
实施例29(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I29）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（7r）的制备
参照7a的制备方法，由6c和(E)-4-氨基苯丙烯酸甲酯制得黄色油状物，收率84.9%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-Boc-β-咔啉-3-甲酰胺（I29）的制备
参照I1的制备方法，由7r和羟胺制得黄色固体，收率68.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.76(s,1H,H-4),8.21(d,1H,J=7.20Hz,H-5),8.05(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.84(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.68(m,4H,Ar-H,H-6,ArCH),7.46(m,1H,H-7),7.06(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),6.48(m,2H,CHC=O),3.89(s,3H,OCH3),1.99(s,1H,OH),1.27(s,9H,-C(CH3)3);ESI-MS(m/z):578[M+H]+.
实施例30(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-β-咔啉-3-甲酰胺（I30）的制备
参照I2的制备方法，由I30制得黄色固体，收率87.3%。ESI-MS(m/z):478[M+H]+.
实施例31N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I31）的制备
1-对甲氧基苯基-9-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯（5f）
参照5d的合成方法，由4c制得棕黄色固体，收率82.4%。
1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-羧酸（6f）
参照6a合成方法，5f水解后得到黄白色固体，收率88.3%。
N-(4-(甲氧)-4-氧杂丁基)-1-对甲氧基苯基-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺(7s）的制备
参照7a合成方法，由6f和丁氨酸甲酯得到黄色油状物，收率81.0%。
N-(4-(羟氨基)-4-氧杂丁基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I31）的制备
参照I1的制备方法，由7s和羟胺制得黄色固体，收率64.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.70(s,1H,H-4),8.46(m,1H,NHCH2),8.19(d,1H,J=7.20Hz,H-5),8.16(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.84(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.65(m,1H,H-6),7.47(m,1H,H-7),7.06(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),4.18(s,3H,N9-CH3),3.89(s,3H,OCH3),3.61(m,2H,NCH2),2.28(m,2H,CH2CO),1.99(s,1H,OH),1.86(m,2H,CH2CH 2CH2).MS(ESI)m/z=433[M+1]+.
实施例32N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-(3-硝基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I32）的制备
N-(5-(甲氧)-5-氧杂戊基)-1-(3-硝基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7t）的制备
参照7a合成方法，由6f和5-己氨酸甲酯得到黄色油状物，收率84.8%。
N-(5-(羟氨基)-5-氧杂戊基)-1-(3-硝基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I32）的制备
参照I1的制备方法，由7t和羟胺制得黄色固体，收率68.2%。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.75(s,1H,H-4),8.42(m,1H,NH),8.17(d,1H,J=7.20Hz,H-5),8.16(d,1H,J=7.50Hz,H-8),7.85(d,2H,J=8.76Hz,Ar-H),7.66(m,1H,H-6),7.45(m,1H,H-7),7.13(m,2H,Ar-H),4.15(s,3H,N9-CH3),3.55(m,2H,NCH2),2.29(m,2H,CH2CO),1.98(s,1H,OH),1.80(m,4H,CH2CH 2CH 2CH2).MS(ESI)m/z=462[M+1]+.
实施例33(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I33）的制备
(E)-N-(4-(3-(甲氧基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（7u）的制备
参照7a的制备方法，由6f和(E)-4-氨基苯丙酸甲酯制得黄色油状物，收率58.2%。
(E)-N-(4-(3-(羟氨基)-3-氧杂丙基-1-烯)苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-9-甲基-β-咔啉-3-甲酰胺（I33）的制备
参照I1的制备方法，由7u和羟胺制得黄色固体，收率60.5%。ESI-MS(m/z):493[M+H]+.
实施例34四甲基氮唑蓝比色法（MTT）体外抗肿瘤试验
采用四甲基氮唑蓝比色法（MTT）评价了本发明化合物对6种人癌细胞株的抗增殖活性。MTT法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感测定等。选择SAHA作为阳性对照药。SAHA是目前上市抗肿瘤药物HDAC抑制剂，因此选择它作为阳性对照药。
人癌细胞株：肝癌细胞SMMC-7721、胰腺癌细胞PANC-1、乳腺癌细胞MCF-7、卵巢癌细胞SKOV-3、膀胱癌细胞EJ、胃癌细胞SGC-7901。
实验方法如下：取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×104～4×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μL，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入受试化合物Ⅰ1-Ⅰ33（化合物用DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度分别为6.25×10-6，1.25×10-5，2.5×10-5，5×10-5mol/L），每孔20μL，培养72小时。将MTT加入96孔板中，每孔20μL，培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入DMSO，每孔150μL，平板摇床上振摇5min。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞抑制率。实验结果如表3所示。
细胞抑制率=（阴性对照组OD值–受试物组OD值）/阴性对照组OD值×100%。
实施例35流式细胞术检测细胞凋亡率
取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，细胞培养方式同上，加入不同浓度受试化合物Ⅰ1-Ⅰ33（化合物用DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度分别为6.25×10-6，1.25×10-5，2.5×10-5，5×10-5mol/L），继续培养72小时。收集细胞，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，数目约为1～5×106个，2000r/min离心5min，弃去培养基，用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1～5×105个细胞。加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞。加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀。室温、避光、反应5～15min。在1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。
Claims (7)
1.一种含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物，具有下述通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：R代表H或叔丁氧羰基或CH3(CH2)n-，n=0～3；
R1代表H或CH3(CH2)m-，m=0～3；或者R1代表对甲氧基苯基，2-氯苯基，3-硝基苯基，4-氯苯基，2-溴苯基，4-溴苯基，4-(N,N-二甲基)-苯基；
-NH-R2-CO-选自构型甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者-NH-R2-CO-还可以代表-NH(CH2)pCO-，p=3～7；或者-NH-R2-CO-代表
o=0～5。
2.根据权利要求1所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物，其特征在于：所述通式Ⅰ的结构中的R、R1和-NH-R2-CO-选自如下组合：
R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=CH3，-NH-R2-CO-=
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=CH3，R1=H，-NH-R2-CO-=
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NHCH2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)2CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者R=H，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)5CO-；
或者R=叔丁氧羰基，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
或者R=H，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
或者R=CH3，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)3CO-；
或者R=CH3，R1=3-硝基苯基，-NH-R2-CO-=-NH(CH2)4CO-；
或者R=CH3，R1=4-甲氧基苯基，-NH-R2-CO-=
3.一种权利要求1所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物制得的药学上可接收的盐，其特征在于：是通式Ⅰ化合物的盐。
4.一种权利要求1所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
L-色氨酸(1)与不同取代醛在酸或碱催化下通过Pictet–Spengler反应得到1位不同取代1,2,3,4-四氢-β-咔啉衍生物(2)，1,2,3,4-四氢-β-咔啉衍生物(2)的3-位羧基与甲醇在二氯亚砜作用下酯化后得到化合物(3)，再经硫去氢得到1位不同取代β-咔啉-3-羧酸甲酯(4)；β-咔啉-3-羧酸甲酯(4)与(Boc)2O或卤代烃得到N-9叔丁氧羰基或N-9-alkyl取代的化合物(5)；化合物(5)经1N的NaOH溶液水解得到不同取代的β-咔啉-3-羧酸(6)；β-咔啉-3-羧酸(6)经氯甲酸乙酯和N-甲基吗啉作用制成混合酸酐后与各种氨基酸甲酯反应得到中间体(7)；中间体(7)与盐酸羟胺在氢氧化钾的甲醇溶液下反应制得通式化合物(8)，化合物(8)中9-位为Boc取代的化合物经三氟乙酸脱去Boc得到化合物(9)，其中化合物(8)和(9)均属于通式Ⅰ所述化合物，具体合成路线如下：
其中，R1代表H或CH3(CH2)m-，m=0～3或者R1代表对甲氧基苯基，2-氯苯基，3-硝基苯基，4-氯苯基，2-溴苯基，4-溴苯基，4-(N,N-二甲基)-苯基；
-NH-R2-CO-选自构型甘氨酸残基、L-或D-型α-丙氨酸残基、β-丙氨酸残基、L-或D-型缬氨酸残基、L-或D-型亮氨酸残基、L-或D-型异亮氨酸残基、L-或D-型甲硫氨酸残基、L-或D-型半胱氨酸残基、L-或D-型苯丙氨酸残基、L-或D-型酪氨酸残基、L-或D-型色氨酸残基、L-或D-型精氨酸残基、L-或D-型脯氨酸残基、L-或D-型组氨酸残基；或者-NH-R2-CO-还可以代表-NH(CH2)pCO-，p=3～7；或者-NH-R2-CO-代表
o=0～5；
化合物(5-8)中R代表叔丁氧羰基或CH3(CH2)n-，n=0～3。
5.一种药物组合物，由治疗上有效剂量的权利要求1所述的通式Ⅰ化合物或其医学上可接受的盐与药学上可接受的载体或辅料的药物组成的组合物。
6.一种权利要求1所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗恶性肿瘤、阿尔茨海默、帕金森病的药物中的应用。
7.根据权利要求5所述的含有羟肟酸的β-咔啉类衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗恶性肿瘤、阿尔茨海默、帕金森病的药物中的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤是指肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌及胃癌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Effective date of registration: 20191118 Address after: 215400 Jiangsu city of Suzhou province Taicang city Beijing East Road No. 88 East Street's G Patentee after: Jiangsu fangshiyuanlue Technology Consulting Co., Ltd Address before: 226019 Jiangsu city of Nantong province sik Road No. 9 Patentee before: Nantong University |
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