CN103285042A

CN103285042A - 黑木耳蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用

Info

Publication number: CN103285042A
Application number: CN2013102094494A
Authority: CN
Inventors: 赵爽; 许峰; 刘宇; 王兰青; 王守现; 耿小丽
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: CN103285042B

Abstract

本发明公开了黑木耳蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。该黑木耳蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：1）将黑木耳子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到黑木耳水溶性提取物；2）对所述黑木耳水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述黑木耳蛋白质提取物。该黑木耳蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，IC50值分别为6μg/mL，6μg/mL，6μg/mL，并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。

Description

黑木耳蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用

技术领域

本发明涉及黑木耳蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。

背景技术

黑木耳（Auricularia auricula)又名木耳、耳子、光木耳等，属木耳目，木耳科，木耳属，是一种营养价值极高的药食两用真菌。现已研究证明，黑木耳中含有多糖、腺苷、黑色素、磷脂类及多种维生素等化学成分，具有降脂抗血栓、抗辐射及抗突变、降血糖等生物活性。刘可春等对黑木耳中的化学成分进行研究，采用硅胶、凝胶等多种色谱方法对黑木耳中的化学成分进行分离和纯化出尿苷（uridine）、α-D吡喃葡萄糖（α-D-glucopyranose）、脑苷酯B(cerebroside B)，并测定分离纯化后的黑木耳提取物抗血小板凝集活性，研究发现，脑苷酯B对大鼠血小板凝集无抑制作用，尿苷对血小板凝集有抑制活性。于国萍等利用酶法对黑木耳多糖分级纯化工艺进行了研究，通过纸层析法对黑木耳纯多糖进行组分分析的结果表明黑木耳多糖是一种杂多糖，其组分由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖组成。有研究报道探讨了粉碎工艺与提取工艺处理对黑木耳多糖抑菌活性的影响，以抑菌圈为指标，结果显示，原料粒度与提取工艺对黑木耳多糖的抑菌效果均有较大影响，超声处理时多糖的抑菌效果不如水提。对黑木耳多糖和五味子醇提取物配伍使用对乙酰氨基酚引起的小鼠急性肝损伤协同保护作用的研究发现，五味子醇提取物与黑木耳多糖配伍使用可以保护对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤，二者作用呈现协同效应。目前对于黑木耳多糖的研究较为细致，相关的功能研究报道较多，但是从黑木耳中分离蛋白类提取物，并对体外抗肿瘤活性的研究尚属空白。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供具有抗肿瘤活性的黑木耳蛋白质提取物。

本发明所提供的黑木耳蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1）将黑木耳子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到黑木耳水溶性提取物；

2）对所述黑木耳水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述黑木耳蛋白质提取物。

上述步骤1）中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。

所述黑木耳子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的黑木耳子实体在常温（如20-25℃）下干燥得到的。

所述新鲜黑木耳子实体和水的体积比可为1：4-6，如1：4。

上述步骤1）中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。上述步骤2）中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。

上述步骤2）中，在4℃对所述黑木耳水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

上述步骤2）中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g（如6000g），离心10-20分钟（如15分钟），收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成黑木耳蛋白质提取物干粉的步骤。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述黑木耳蛋白质提取物的用途。

本发明所提供的上述黑木耳蛋白质提取物的用途，为下述A或B：

A、抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品），其活性成分为上述黑木耳蛋白质提取物；

B、上述黑木耳蛋白质提取物在制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品）中的应用。

上述用途中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

所述实体肿瘤可为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞可为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。所述肺癌可为肺腺癌，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞。

所述肝癌细胞可为人肝癌细胞，如HepG2细胞；所述乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞，如MCF-7细胞；所述肺癌细胞可为人肺腺癌细胞，如A-549细胞。

上文中，所述黑木耳具体可为黑木耳（Auricularia auricula）Au888CFCC89530。

本发明的黑木耳蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，HepG2、MCF-7、A-549细胞的增殖均明显受到抑制，且IC₅₀值分别为6μg/mL，6μg/mL，6μg/mL,并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。说明黑木耳蛋白质提取物对HepG2、MCF-7、A-549细胞均有显著的抑制增殖作用，可用于制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品。

附图说明

图1为BCA蛋白定量试剂盒制作标准曲线。

图2为MTT法测定黑木耳蛋白质提取物处理HepG2细胞72h后细胞凋亡情况。

图3为MTT法测定黑木耳蛋白质提取物处理MCF-7细胞72h后细胞凋亡情况。

图4为MTT法测定黑木耳蛋白质提取物处理A-549细胞72h后细胞凋亡情况。

图2-图4中，0、4、8、12、16、20分别表示0μg/mL组、4μg/mL组、8μg/mL组、12μg/mL组、16μg/mL组、20μg/mL组；下方的培养板从左至右的列依次为0μg/mL组，4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组；数据结果以平均数±标准差表示（n=3），经单因素方差分析，其中*表示与0μg/mL组比较具有显著性差异（*P<0.05）的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的黑木耳（Auricularia auricula）Au888 CFCC 89530，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,China Forestry Culture Collection Center英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。

实施例1、黑木耳蛋白质提取物的制备

1、制备黑木耳子实体

将黑木耳（Auricularia auricula）Au888 CFCC 89530斜面菌种接种到一级种培养基中进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满试管后将其接种到二级种培养基中，25℃恒温培养室培养至菌丝长满，将二级种接种到装有栽培培养基的栽培袋中25℃的条件下进行发菌，菌种长满栽培袋后进行搔菌并移入温室大棚，出菇条件保持湿度在90%以上，温度为20-25℃，收集第一潮子实体，得到黑木耳（Auricularia auricula）Au888 CFCC 89530子实体。

其中，该实验所用的培养基如下：

一级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，3g KH₂PO_4,10mg维生素B₁,5g蛋白胨，1.5g MgSO₄，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。

二级种培养基：棉籽壳80%，麸皮18%，石膏1%，糖1%.，料水比为1:1，经121℃，30min高压灭菌。

栽培培养基：木屑50%，棉籽壳28%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，料水比为1:1。经121℃，30min高压灭菌。

2、制备黑木耳水溶性提取物

用4倍体积的去离子水浸泡步骤1的新鲜黑木耳（Auricularia auricula）Au888CFCC 89530子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提（即静置）12h后，12000g离心15min，收集上清溶液，该上清溶液即为黑木耳水溶性提取物。

3、制备黑木耳蛋白质提取物

在4℃向步骤2的黑木耳水溶性提取物中加入(NH₄)₂SO₄至(NH₄)₂SO₄的饱和度为80%，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻干燥36小时，得到黑木耳蛋白质提取物，作为抑制肿瘤细胞增殖药物。

实施例2、黑木耳蛋白质提取物抑制肿瘤细胞增殖实验

1.1供试细胞株

人肝癌HepG2细胞（购自美国ATCC）、人乳腺癌MCF-7细胞（购自美国ATCC）和人肺腺癌A-549细胞（购自美国ATCC）。

1.2实验方法

1.2.1细胞系及细胞培养

人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞按照常规培养方法进行活化和传代。其中，人肝癌HepG2细胞的传代和活化培养基是DMEM-高糖+1%双抗+10%FBS（在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的传代和活化培养基是RPMI1640+1%双抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。

1.2.2细胞活性检测

采用噻唑蓝比色法（MTT）检测实施例1的黑木耳蛋白质提取物对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的抑制活性，具体方法如下：

本实验选用步骤1.2.1的P8代（第8代）细胞，以每孔7×10³个/mL细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，随机选18孔细胞分为6组，一个对照组和5个实验组，分别为0μg/mL组（对照组），4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组。每组三孔细胞。0μg/mL组的每孔细胞中加入200μL无血清培养液，4μg/mL组每孔加入200μL黑木耳蛋白质提取物浓度为4μg/mL的含黑木耳蛋白质提取物培养液；8μg/mL组每孔加入200μL黑木耳蛋白质提取物浓度为8μg/mL的含黑木耳蛋白质提取物培养液；

12μg/mL组每孔加入200μL黑木耳蛋白质提取物浓度为12μg/mL的含黑木耳蛋白质提取物培养液；16μg/mL组每孔加入200μl黑木耳蛋白质提取物浓度为16μg/mL的含黑木耳蛋白质提取物培养液；20μg/mL组每孔加入200μL黑木耳蛋白质提取物浓度为20μg/mL的含黑木耳蛋白质提取物培养液。加完培养液在37℃培养72h后，每孔加入200μL MTT工作液（无菌水配制的5mg/mL MTT溶液：无血清培养液=1:9（体积比）避光继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加200μL DMSO（二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在560nm波长处测吸光度，以对照组的细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。各组细胞的凋亡率=100%-各组细胞的存活率。实验重复三次。

试验所有数据采用SPSS12.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。根据各组细胞的凋亡率计算黑木耳蛋白质提取物对每种癌细胞的IC50值（使癌细胞的凋亡率为50%的含黑木耳蛋白质提取物培养液中黑木耳蛋白质提取物浓度）。

其中，人肝癌HepG2细胞的无血清培养液是DMEM-高糖+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含黑木耳蛋白质提取物培养液分别是向DMEM-高糖+1%双抗中加入黑木耳蛋白质提取物母液得到的黑木耳蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。DMEM-高糖+1%双抗是在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的无血清培养液是RPMI1640+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含黑木耳蛋白质提取物培养液分别是向RPMI1640+1%双抗中加入黑木耳蛋白质提取物母液得到的黑木耳蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。RPMI1640+1%双抗是在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

上述黑木耳蛋白质提取物母液均是用各种细胞的相应无血清培养液溶解实施例1制备的黑木耳蛋白质提取物，配制成蛋白质含量为100μg/ml的黑木耳蛋白质提取物水溶液。

其中，黑木耳蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量的测定方法如下：

1）标准曲线的制作：利用标准样品小牛血清蛋白（BSA）配置成不同浓度的蛋白溶液，采用BCA（北京博迈德科技公司）蛋白定量试剂盒制作标准曲线（图1）。

2）采用BCA蛋白定量试剂盒测定黑木耳蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量，该蛋白质含量即为黑木耳蛋白质提取物水溶液中黑木耳蛋白质提取物浓度。

2实验结果及分析

2.1黑木耳蛋白质提取物抗肿瘤活性检测结果

MTT法测定结果表明，实施例1的黑木耳蛋白质提取物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着黑木耳蛋白质提取物浓度的增加，HepG2细胞、MCF-7细胞和A-549细胞的凋亡率均增高，且IC50值分别为6μg/mL，6μg/mL，6μg/mL；光镜下可观察到细胞凋亡形态的改变。具体抑制效果见表1。

表1黑木耳蛋白质提取物对三株癌症细胞体外抑制率

Claims

1.黑木耳蛋白质提取物在制备抗肿瘤产品或抗肿瘤细胞产品中的应用，所述黑木耳蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

2.黑木耳蛋白质提取物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用，所述黑木耳蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为实体肿瘤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述实体肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述步骤2）中，在4℃对所述黑木耳水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

7.黑木耳蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

8.根据权利要求7所述的黑木耳蛋白质提取物，其特征在于：所述步骤2）中，在4℃对所述黑木耳水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

9.根据权利要求7或8所述的黑木耳蛋白质提取物，其特征在于：所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。