CN103285041B - 朱红密孔菌蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了朱红密孔菌蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。该朱红密孔菌蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：1）将朱红密孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到朱红密孔菌水溶性提取物；2）对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述朱红密孔菌蛋白质提取物。该朱红密孔菌蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，IC₅₀值分别为12μg/mL，6μg/mL，4μg/mL，并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。

Description

朱红密孔菌蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用

技术领域

本发明涉及朱红密孔菌蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。

背景技术

朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)又名红栓菌、朱红栓菌、朱血菌、红菌子。在分类上属于非褶菌目、多孔菌科、栓菌属，其子实体具有清热、解毒、消炎之功效。目前有关朱红密孔菌的研究主要集中在发酵工艺优化和活性成分功能研究等方面。为了获得红栓菌胞外多糖，曹幼琴研究了红栓菌深层培养产生胞外多糖的工艺条件，并优化了发酵培养基配方。荣维燕探索了红栓菌双态发酵法及多糖提取工艺，试验结果表明，双态发酵具有生长周期短、经济效益高等优点。郑泉采用蒽酮-硫酸比色法分别对不同批次的红栓菌深层培养物中的多糖进行了测定，研究发现，红栓菌深层培养物中含有一定量的胞外多糖和胞内多糖。目前从朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)中提取蛋白类物质直接杀伤肿瘤细胞的研究尚属空白。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供具有抗肿瘤活性的朱红密孔菌蛋白质提取物。

本发明所提供的朱红密孔菌蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1）将朱红密孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到朱红密孔菌水溶性提取物；

2）对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述朱红密孔菌蛋白质提取物。

上述步骤1）中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。

所述朱红密孔菌子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的朱红密孔菌子实体在常温（如20-25℃）下干燥得到的。

所述新鲜朱红密孔菌子实体和水的体积比可为1：4-6，如1：4。

上述步骤1）中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。上述步骤2）中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。

上述步骤2）中，在4℃对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

上述步骤2）中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g（如6000g），离心10-20分钟（如15分钟），收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成朱红密孔菌蛋白质提取物干粉的步骤。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述朱红密孔菌蛋白质提取物的用途。

本发明所提供的上述朱红密孔菌蛋白质提取物的用途，为下述A或B：

A、抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品），其活性成分为上述朱红密孔菌蛋白质提取物；

B、上述朱红密孔菌蛋白质提取物在制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品）中的应用。

上述用途中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

所述实体肿瘤可为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞可为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。所述肺癌可为肺腺癌，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞。

所述肝癌细胞可为人肝癌细胞，如HepG2细胞；所述乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞，如MCF-7细胞；所述肺癌细胞可为人肺腺癌细胞，如A-549细胞。

上文中，所述朱红密孔菌具体可为朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)CFCC89594。

本发明的朱红密孔菌蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，HepG2、MCF-7、A-549细胞的增殖均明显受到抑制，且IC₅₀值分别为12μg/mL,6μg/mL，4μg/mL,并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。说明朱红密孔菌蛋白质提取物对HepG2、MCF-7、A-549细胞均有显著的抑制增殖作用，可用于制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品。

附图说明

图1为BCA蛋白定量试剂盒制作标准曲线。

图2为MTT法测定朱红密孔菌蛋白质提取物处理HepG2细胞72h后细胞凋亡情况。

图3为MTT法测定朱红密孔菌蛋白质提取物处理MCF-7细胞72h后细胞凋亡情况。

图4为MTT法测定朱红密孔菌蛋白质提取物处理A-549细胞72h后细胞凋亡情况。

图2-图4中，0、4、8、12、16、20分别表示0μg/mL组、4μg/mL组、8μg/mL组、12μg/mL组、16μg/mL组、20μg/mL组；下方的培养板从左至右的列依次为0μg/mL组，4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组；数据结果以平均数±标准差表示（n=3），经单因素方差分析，其中*表示与0μg/mL组比较具有显著性差异（*P<0.05）的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)CFCC89594，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,China Forestry Culture Collection Center英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。

实施例1、朱红密孔菌蛋白质提取物的制备

1、制备朱红密孔菌子实体

将朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)CFCC89594斜面菌种接种到一级种培养基中进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满试管后将其接种到二级种培养基中，25℃恒温培养室培养至菌丝长满，将二级种接种到装有栽培培养基的栽培袋中25℃的条件下进行发菌，菌种长满栽培袋后进行搔菌并移入温室大棚，出菇条件保持湿度在90%以上，温度为24-28℃，收集第一潮子实体，得到朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)CFCC89594子实体。

其中，该实验所用的培养基如下：

一级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，3g KH₂PO₄,10mg维生素B₁,5g蛋白胨，1.5g MgSO₄，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。

二级种培养基：棉籽壳80%，麸皮18%，石膏1%，糖1%.，料水比为1:1，经121℃，30min高压灭菌。

栽培培养基：木屑78%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，料水比为1:1。经121℃，30min高压灭菌。

2、制备朱红密孔菌水溶性提取物

用4倍体积的去离子水浸泡步骤1的新鲜朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarirus)CFCC89594子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提（即静置）12h后，12000g离心15min，收集上清溶液，该上清溶液即为朱红密孔菌水溶性提取物。

3、制备朱红密孔菌蛋白质提取物

在4℃向步骤2的朱红密孔菌水溶性提取物中加入(NH₄)₂SO₄至(NH₄)₂SO₄的饱和度为80%，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻干燥36小时，得到朱红密孔菌蛋白质提取物，作为抑制肿瘤细胞增殖药物。

实施例2、朱红密孔菌蛋白质提取物抑制肿瘤细胞增殖实验

1.1供试细胞株

人肝癌HepG2细胞（购自美国ATCC）、人乳腺癌MCF-7细胞（购自美国ATCC）和人肺腺癌A-549细胞（购自美国ATCC）。

1.2实验方法

1.2.1细胞系及细胞培养

人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞按照常规培养方法进行活化和传代。其中，人肝癌HepG2细胞的传代和活化培养基是DMEM-高糖+1%双抗+10%FBS（在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的传代和活化培养基是RPMI1640+1%双抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。

1.2.2细胞活性检测

采用噻唑蓝比色法（MTT）检测实施例1的朱红密孔菌蛋白质提取物对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的抑制活性，具体方法如下：

本实验选用步骤1.2.1的P8代（第8代）细胞，以每孔7×10³个/mL细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，随机选18孔细胞分为6组，一个对照组和5个实验组，分别为0μg/mL组（对照组），4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组。每组三孔细胞。0μg/mL组的每孔细胞中加入200μL无血清培养液，4μg/mL组每孔加入200μL朱红密孔菌蛋白质提取物浓度为4μg/mL的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液；8μg/mL组每孔加入200μL朱红密孔菌蛋白质提取物浓度为8μg/mL的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液；12μg/mL组每孔加入200μL朱红密孔菌蛋白质提取物浓度为12μg/mL的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液；16μg/mL组每孔加入200μl朱红密孔菌蛋白质提取物浓度为16μg/mL的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液；20μg/mL组每孔加入200μL朱红密孔菌蛋白质提取物浓度为20μg/mL的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液。加完培养液在37℃培养72h后，每孔加入200μL MTT工作液（无菌水配制的5mg/mL MTT溶液：无血清培养液=1:9（体积比）避光继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加200μL DMSO（二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在560nm波长处测吸光度，以对照组的细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。各组细胞的凋亡率=100%-各组细胞的存活率。实验重复三次。

试验所有数据采用SPSS12.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。根据各组细胞的凋亡率计算朱红密孔菌蛋白质提取物对每种癌细胞的IC50值（使癌细胞的凋亡率为50%的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液中朱红密孔菌蛋白质提取物浓度）。

其中，人肝癌HepG2细胞的无血清培养液是DMEM-高糖+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液分别是向DMEM-高糖+1%双抗中加入朱红密孔菌蛋白质提取物母液得到的朱红密孔菌蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。DMEM-高糖+1%双抗是在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的无血清培养液是RPMI1640+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含朱红密孔菌蛋白质提取物培养液分别是向RPMI1640+1%双抗中加入朱红密孔菌蛋白质提取物母液得到的朱红密孔菌蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。RPMI1640+1%双抗是在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

上述朱红密孔菌蛋白质提取物母液均是用各种细胞的相应无血清培养液溶解实施例1制备的朱红密孔菌蛋白质提取物，配制成蛋白质含量为100μg/ml的朱红密孔菌蛋白质提取物水溶液。

其中，朱红密孔菌蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量的测定方法如下：

1）标准曲线的制作：利用标准样品小牛血清蛋白（BSA）配置成不同浓度的蛋白溶液，采用BCA（北京博迈德科技公司）蛋白定量试剂盒制作标准曲线（图1）。

2）采用BCA蛋白定量试剂盒测定朱红密孔菌蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量，该蛋白质含量即为朱红密孔菌蛋白质提取物水溶液中朱红密孔菌蛋白质提取物浓度。

2实验结果及分析

2.1朱红密孔菌蛋白质提取物抗肿瘤活性检测结果

MTT法测定结果表明，实施例1的朱红密孔菌蛋白质提取物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着朱红密孔菌蛋白质提取物浓度的增加，HepG2细胞、MCF-7细胞和A-549细胞的凋亡率均增高，且IC50值分别为12μg/mL，6μg/mL，4μg/mL；光镜下可观察到细胞凋亡形态的改变。具体抑制效果见表1。

表1.朱红密孔菌蛋白质提取物对三株癌症细胞体外抑制率

Claims (3)

1.朱红密孔菌蛋白质提取物在制备抗肿瘤产品中的应用，所述朱红密孔菌蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将朱红密孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到朱红密孔菌水溶性提取物；

2)对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述朱红密孔菌蛋白质提取物；

所述肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述步骤2)中，在4℃对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

2.朱红密孔菌蛋白质提取物在制备抗肿瘤细胞产品中的应用，所述朱红密孔菌蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将朱红密孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到朱红密孔菌水溶性提取物；

2)对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述朱红密孔菌蛋白质提取物；

所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述步骤2)中，在4℃对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

3.朱红密孔菌蛋白质提取物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用，所述朱红密孔菌蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将朱红密孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到朱红密孔菌水溶性提取物；

2)对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述朱红密孔菌蛋白质提取物；

所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述步骤2)中，在4℃对所述朱红密孔菌水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。