CN103263382B - 一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明所属医药产品研究开发技术领域，本发明涉及一种对免疫性肝损伤有保护作用的生物技术产品制剂，将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆、酶解，提取有效组分，进一步纯化，制备成凝胶制剂，装瓶，密封后备用，本发明产品对肝脏有保护作用及对肝功能有调理作用，本发明产品利于工业化生产。

Description

一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂

技术领域

本发明所属医药产品研究开发技术领域，具体涉及一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂，本发明产品对肝脏有保护作用及对肝功能有调理作用，本发明产品利于工业化生产。

背景技术

免疫性肝损伤(包括自身免疫性肝炎)是由于患者肝脏的免疫耐受性减退，引起的一种不能自然痊愈的肝炎。关于自身免疫性肝炎的发病机制，最新观点认为，机体在易感性基因的作用下，受环境因素、药物或感染因子的诱导而发病，由于产生肝细胞膜自身靶抗原，机体免疫功能失调，以及肝脏本身免疫耐受性减退，导致肝损伤。卡介苗与脂多糖联合诱导小鼠产生的免疫性肝损伤，其病理改变与肝细胞损伤机制和乙型病毒性肝炎相类似，此种造模方法所需时间短，方法简便易行，损伤持续时间较久，适用于从免疫途径筛选新药，是目前研究肝炎发病与治疗较为理想的模型之一。本实验采用此种造模方法来探讨牡蛎多糖凝胶制剂对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。研究结果表明，小鼠尾静脉注射卡介苗和脂多糖后，引起模型组小鼠血清转氨酶的显著升高，肝脏、脾脏和胸腺系数显著改变，证明卡介苗加脂多糖复制的小鼠免疫性肝炎模型获得成功。牡蛎多糖凝胶制剂的高、中剂量组与模型组比较能显著降低血清中AST和ALT的含量。肝脏系数和脾脏系数显著减小，胸腺系数显著增大。尤其以牡蛎多糖高剂量组疗效更为明显，但是牡蛎多糖低剂量组疗效不显著，在试验剂量范围内显示出随着剂量的增加有疗效增强作用。

发明内容

1.本发明涉及一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂，其特征在于该制剂包括以下过程：

步骤(一)：将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆，匀浆液加入菠萝蛋白酶，加酶量为匀浆液的2-3％，用10％碳酸钠调节pH为7.5-8.0，于60-65℃酶解3-4h；然后调节pH至8.5加入碱性蛋白酶，在55℃下酶解3-4h。将提取液置于90-100℃，10-20min，灭活菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶，冷却，高速低温离心(8500-10000r/min)30min，取上清液，得牡蛎粗多糖，冻干备用。

步骤(二)：将步骤(一)中的冻干粉末用10-20倍水中充分搅拌溶解，静置，离心去不 溶物，滤纸抽滤，滤液中缓慢加入2-3倍量95％乙醇，4℃下过夜，离心，上清液回收乙醇，沉淀用无水乙醇洗涤后真空干燥，得醇沉多糖。醇沉法的多糖含量为70-77.1％±3.4％，计算得率为牡蛎粗提物的33-38％；

步骤(三)：取辅料0.4-0.6％琼脂、0.2-0.5％卡拉胶、0.2-0.5％羧甲基纤维素，加水适量，溶胀20min，置90℃水浴中加热20min，加入0.2％KCI、0.3％CaCI2、15-20％饴糖、5-10％蜂蜜及0.5-0.8％柠檬酸酸，搅拌使溶解，在等温下，加入步骤(二)项的多糖0.1-0.3％，搅拌均匀，冷却，分装，即得；

步骤(四)：将步骤(三)中的产品进行免疫性肝损伤保护作用试验，该制剂对肝损伤有保护作用。

2.根据本发明所述的一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂主要原料为太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为牡蛎科、巨蛎属。生鳞片，排列稀疏。壳形变化大，呈长圆形或长三角形，左壳凹陷较深，鳞片排列紧密，利用壳顶固着在岩礁石块等坚硬的物体上生长，壳内面白色，内有宽大的韧带槽。闭壳肌痕大，外套膜边缘呈黑色。

根据本发明，本发明中的“％”是重量百分比。

具体实施方式

本发明所述的涉及一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶制剂包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不可以任何方式限制本发明。

实施例1

步骤(一)：挑选新鲜牡蛎10kg，将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆，匀浆液加入菠萝蛋白酶，加酶量为匀浆液的3％，用10％碳酸钠调节pH为8.0，于65℃酶解4h；然后调节pH至8.5加入碱性蛋白酶，在55℃下酶解3h。将提取液置于90℃，20min，灭活菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶，冷却，高速低温离心(10000r/min)30min，取上清液，得牡蛎粗多糖约，冻干约290g，备用；

步骤(二)：将步骤(一)中的冻干粉末用10倍水中充分搅拌溶解，静置，离心去不溶物，滤纸抽滤，滤液中缓慢加入2倍量95％乙醇，4℃下过夜，离心，上清液回收乙醇，沉淀用无水乙醇洗涤后真空干燥，得醇沉多糖。醇沉法的多糖含量为74.1％±2.7％，计算得率为牡蛎粗提物的35％；

步骤(三)：取辅料0.2％琼脂、0.3％卡拉胶，加水适量，溶胀20min，置90℃水浴中加热20min，加入0.2％KCI、15％饴糖、5％蜂蜜及0.5％柠檬酸酸，搅拌使溶解，在等温下，加 入步骤(二)项的0.1％多糖，搅拌均匀，冷却，分装，即得；

步骤(四)：将步骤(三)中的产品进行免疫性肝损伤保护作用试验，该制剂对肝损伤有保护作用。

实施例2：

步骤(一)：挑选新鲜牡蛎20kg，将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆，匀浆液加入菠萝蛋白酶，加酶量为匀浆液的2％，用10％碳酸钠调节pH为7.5，于60℃酶解3h；然后调节pH至8.5加入碱性蛋白酶，在55℃下酶解4h。将提取液置于90℃，10min，灭活菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶，冷却，高速低温离心(8500r/min)30min，取上清液，得牡蛎粗多糖约，冻干约550g，备用；

步骤(二)：将步骤(一)中的冻干粉末用20倍水中充分搅拌溶解，静置，离心去不溶物，滤纸抽滤，滤液中缓慢加入3倍量95％乙醇，4℃下过夜，离心，上清液回收乙醇，沉淀用无水乙醇洗涤后真空干燥，得醇沉多糖。醇沉法的多糖含量为71.3％±3.8％，计算得率为牡蛎粗提物的34％；

步骤(三)：取辅料0.3％琼脂、0.4％卡拉胶、0.2％羧甲基纤维素，加水适量，溶胀20min，置90℃水浴中加热20min，加入0.3％CaCI2、20％饴糖、10％蜂蜜及0.6％柠檬酸酸，搅拌使溶解，在等温下，加入步骤(二)项的0.3％多糖，搅拌均匀，冷却，分装，即得；

步骤(四)：将步骤(三)中的产品进行免疫性肝损伤保护作用试验，该制剂对肝损伤有保护作用。

1.材料与仪器 

1.1受试物与药品 

牡蛎多糖凝胶制剂：将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆、酶解，提取有效组分，进一步纯化，制备成0.1-0.3％牡蛎多糖凝胶制剂，装瓶，密封后备用，本发明产品对肝脏有保护作用及对肝功能有调理作用。脂多糖(sigma公司)；卡介苗冻干粉(中国药品生物制品检定所)；ALT试剂盒(南京建成生物工程研究所)；AST试剂盒(南京建成生物工程研究所)；联苯双酯滴丸(北京协和药厂)。

1.2动物

清洁级昆明种小鼠，山东绿叶制药有限公司提供，体重18-25g，雌雄兼用。环境温度：25℃±2℃，12h光照周期的动物室内饲养，自由饮水、进食。实验前饲养1周以适应环境。

1.3仪器

U2008型紫外可见分光光度计(日本日立)，JA2003N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造厂)，FJ-200高速分散均质机(上海 右一仪器公司)，SC-3610离心机(常州国华电器有限公司)，pH S-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)，真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)，灭菌锅(西安常仪仪器设备有限公司)。

2.方法

2.1动物模型的建立

采用卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导小鼠免疫性肝损伤。小鼠尾静脉注射BCG浆液0.2ml/只(含菌量5×10⁷单位)，致敏后12d，尾静脉注射LPS0.2ml/只(7.5μg)以诱导肝损伤，正常组小鼠尾静脉注射同等剂量生理盐水。

2.2动物分组与处理

将实验动物随机分为6组：正常组、模型组、牡蛎多糖高(1500mg/kg)、中(1000mg/kg)、低(500mg/kg)剂量组、联苯双酯滴丸组(200mg/kg)，每组12只。造模同时开始灌胃直到动物处死前1d，正常组给予同等剂量生理盐水。造模结束后小鼠禁食12h左右，称重后眼球采血，脱椎处死取肝脏、脾脏、胸腺称重计算脏器系数(mg/g体质量)，血液3000转10min离心，取血清超低温冰箱冻存以备下一步检测所需。

2.3血清中ALT、AST含量检测

取小鼠血清按试剂盒说明检测。

2.4统计学分析 

采用SPSS17.0统计分析软件进行t检验，数据用“均数±标准差”表示，双侧检验以p＜0.05表示差别有统计学意义。

3结果

3.1对小鼠免疫性肝损伤的治疗保护作用

与正常对照组比，模型组血清AST、ALT水平显著升高(p＜0.01)，表明BCG+LPS干预后对小鼠肝细胞造成了严重的损伤，动物模型建立成功。牡蛎多糖高、中、低剂量组与模型组相比有显著差异(p＜0.01)。阳性药物对照组与模型组相比有显著差异(p＜0.01)。结果见表1。

与正常对照组比，模型组脏器系数水平显著改变(p＜0.01)。牡蛎多糖高剂量组与模型组相比有显著差异(p＜0.01)；牡蛎多糖中剂量组与模型组相比肝脏系数(p＜0.01)、脾脏系数(p＜0.01)有显著差异。牡蛎多糖低剂量组与模型组相比无显著差异(p＞0.1)。阳性药物对照组与模型组相比除脾脏系数差异不显著外(p＞0.05)，其余两项均有显著差异。结果见表2。

表1牡蛎多糖对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响(x±S，n＝12)

表2牡蛎多糖对免疫性肝损伤小鼠肝脏系数、脾脏系数、胸腺系数水平的影响(x±S，n＝12)

4讨论

本次试验表明牡蛎多糖凝胶制剂对免疫性肝损伤有保护作用及对肝功能有调理作用。

表1牡蛎多糖凝胶剂对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响(n＝12)

*p＜0.01vs normal group；#p＜0.05，##p＜0.01vs model group

表2牡蛎多糖凝胶剂对小鼠肝指数、脾指数和胸腺指数的影响(n＝12)

*p＜0.01vs normal group；#p＜0.05，##p＜0.01vs model group 。

Claims (2)

1.一种对免疫性肝损伤有保护作用的牡蛎多糖凝胶剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(一)：将牡蛎去壳、牡蛎肉洗净、去杂质、沥干、打浆，匀浆液加入菠萝蛋白酶，加酶量为匀浆液的2-3％，用10％碳酸钠调节pH为7.5-8.0，于60-65℃酶解3-4h；然后调节pH至8.5加入碱性蛋白酶，在55℃下酶解3-4h；将提取液置于90-100℃，10-20min，灭活菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶，冷却，8500-10000r/min高速低温离心30min，取上清液，得牡蛎粗多糖，冻干备用；

步骤(二)：将步骤(一)中的冻干粉末用10-20倍水充分搅拌溶解，静置，离心去不溶物，滤纸抽滤，滤液中缓慢加入2-3倍量95％乙醇，4℃下过夜，离心，上清液回收乙醇，沉淀用无水乙醇洗涤后真空干燥，得醇沉多糖；醇沉法的多糖含量为70-77.1％±3.4％，计算得率为牡蛎粗提物的33-38％；

步骤(三)：取辅料0.4-0.6％琼脂、0.2-0.5％卡拉胶、0.2-0.5％羧甲基纤维素，加水适量，溶胀20min，置90℃水浴中加热20min，加入0.2％KCl、0.3％CaCl₂、15-20％饴糖、5-10％蜂蜜及0.5-0.8％柠檬酸，搅拌使溶解，在等温下，加入步骤(二)项的多糖0.1-0.3％，搅拌均匀，冷却，分装，即得；

所述“％”均为重量百分比；

步骤(四)：将步骤(三)中的产品进行免疫性肝损伤保护作用试验，该制剂对肝损伤有保护作用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述牡蛎为太平洋牡蛎。