CN103224957A - 体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，包括以下步骤：1）使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞：Ⅰ.构建pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II质粒；Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L-ASPase II的病毒颗粒；Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞；2）体外诱导诱导性多能干细胞生成含L-ASPase II的红细胞：Ⅰ.IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB；Ⅱ.EB诱导分化成成熟红细胞。本发明通过对IPS细胞使用慢病毒载体系统进行基因改造，并将之在体外诱导生成含有L-ASPase II的红细胞，生成的红细胞既能够作为L-ASPase II的缓释载体使用，又能够保持红细胞原有的形态功能，进一步降低了L-ASPase II的毒副作用，为今后的临床应用打下坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）并将其在体外诱导生成含L-天冬酰胺酶II药物红细胞的方法，属于再生医学领域。
背景技术
L-天门冬酰胺是某些肿瘤细胞生长必不可少的氨基酸,对人体正常细胞而言,自身具有合成L-天门冬酰胺的能力,而肿瘤细胞缺乏天门冬酰胺合成酶不能合成天门冬酰胺，其细胞需要从外源的L-天门冬酰胺摄取才能存活。L-天门冬酰胺酶II(L-asparaginase,L-ASPase II)能催化水解L-天门冬酰胺生成L-天门冬氨酸和氨,因此能够有效地抑制癌细胞的生长,最终使癌细胞消亡。所以L-ASPase II是治疗肿瘤的一种重要药物，尤其对急性淋巴细胞白血病(Actute lymphoblastic leukemia,ALL)和非何杰淋巴瘤(NHL)有较好疗效。虽然L-ASPase II在临床应用中有较好的疗效，但L-ASPase II在临床应用过程会产生严重的毒副作用,引起过敏、急性胰腺炎、糖尿病、高血糖及血液系统异常等甚至危及生命的严重不良反应，这些毒副作用限制了L-ASPase II在临床的应用。目前如何减少L-ASPaseII的毒副作用是临床使用面临的一个重要难题。
红细胞是血液中数量最多的血细胞，它具有极大的变形能力，可使其顺利通过比自身直径还小的毛细血管。研究表明，当红细胞处于轻度低渗(约为血浆渗透压的1/2)的环境中，外界水分可进入红细胞使之发生可逆性膨胀154%～174%，变为椭圆形，当达到溶血临界点时，红细胞膜上一些直径20～50nm的孔隙将短暂开放，外界多肽、蛋白质、酶及药物等均可通过这些孔道进入红细胞腔内。而当红细胞周围环境恢复等渗状态时，红细胞又可缩小恢复原状，膜上孔道亦随之收缩，红细胞的这些特性决定了可以将特定药物包封于红细胞内。此外，红细胞作为药物载体还有合成药物载体无法比拟的优势：1）理想的生物相容性及生物降解性；2）降低外源物质的免疫原性；3）提高药物在体内的稳定性。研究表明，使用红细胞来包埋L-ASPase II可以有效延长L-ASPase II在体内半衰期，减少L-ASPase II用量，增加药物靶向性，从而能够有效降低L-ASPase II的毒副作用。
虽然红细胞药物的研究取得了巨大的进展，但目前生产红细胞药物基本上采用的都是以改变渗透压为基础的制备方法，包括早期的低渗溶血法（hypotonic hemolysis）、低渗稀释法（hypotonic dilution）以及改良后的低渗透析法（hypotonic dialysis）和低渗预涨法（hypotonic preswelling），以上方法都是通过改变渗透压而改变红细胞膜的通透性从而起到包埋药物的目的。改变红细胞膜通透性包埋药物存在如下几个问题：1）载体红细胞存在不同程度的变形性降低；2）载体红细胞存在不同程度膜损伤；3）载体红细胞存在不同程度的形态异常；4）载体红细胞脆性增大；以上这些改变会直接影响载药红细胞在体内的清除时间和药物释放效果。迫切需要生产一种既能够发挥红细胞药物载体优势又能保持红细胞形态功能基本正常的红细胞药物是该领域研究的主要方向之一。
诱导性多能干细胞（IPS细胞）作为一种无限来源的体外多能干细胞，业已证明在体外能够生成形态功能正常的红细胞，我们通过对IPS细胞使用慢病毒载体系统进行基因改造，并将之在体外诱导生成含有L-ASPase II的红细胞，生成的红细胞既能够作为L-ASPase II的缓释载体使用，又能够保持红细胞原有的形态功能，进一步降低了L-ASPase II的毒副作用，为今后的临床应用打下坚实的基础。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）并将其在体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，包括以下步骤：
1）使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）：
Ⅰ.构建pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II质粒；
Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L-ASPase II的病毒颗粒；
Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞（IPS细胞）；
2）体外诱导诱导性多能干细胞（IPS细胞）生成含L-ASPase II的红细胞：
Ⅰ.IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB（Erythroid Body）；
Ⅱ.EB诱导分化成成熟红细胞。
所述步骤2）Ⅰ具体为：传代12～30代的人的IPS细胞（hIPS）（步骤1）Ⅲ制备）使用胶原蛋白酶IV（collagenase IV）消化后，转移到由IMDM（Biochrome）为基础培养液配制的培养液中，培养液中含SCF（Sigma,100ng/mL）TPO（Sigma，100ng/mL),FLT3配体(Sigma,100ng/mL),BMP4（Peprotech，10ng/mL),VEGF-A165（Sigma，5ng/mL),IL-3（Sigma,5ng/mL),IL-6（Peprotech，5ng/mL)以及促红细胞生成素EPO（Sigma，3U/mL)；细胞置于37℃，5%CO2条件下培养20天形成EB；形成EB后，用胶原蛋白酶B（Sigma,0.4U/mL）在37℃消化30分钟后细胞置于缓冲液（Invitrogen）中10分钟。
所述步骤2）Ⅱ具体为：
①消化后EB细胞以5x105/ml铺瓶，培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），INSULIN（sigma公司，50～100ng/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（Sigma公司，5～10μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml），Heparin（sigma公司，2U/ml）以及Transferrin（sigma公司50μg/ml）；置37℃、5%CO2条件下培养；
②培养至第4天，细胞由培养瓶以1X105/ml转入培养袋，培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），INSULIN（sigma公司，50～100ng/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（SIGMA公司，5～10μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；置37℃、5%CO2条件下培养；
③培养至第8天，细胞培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（SIGMA公司，5～10μM）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；置37℃、5%CO2条件下培养；
④培养至第11天，换用以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX（SIGMA公司，5～10μM）和Heparin（sigma公司，2U/ml），细胞密度调整为2x106/ml；置37℃、5%CO2条件下培养；
⑤培养至25天，收集终产物，即为含L-ASPase II的药物红细胞。
所涉及的培养液中的试剂因子具体名称如下：促红细胞生成素（EPO）；白介素6(IL-6)；白介素3（IL-3）；促血小板生成素（TPO）；骨形态发生蛋白4（BMP4）；干细胞刺激因子（SCF）；FLT3配体；血管内皮生长因子（VEGF-A165）；胰岛素（Insulin）；干细胞刺激因子（SCF）；转铁蛋白（Transferrin）；地塞米松（DEX）；肝素（Heparin）。
本发明通过对IPS细胞使用慢病毒载体系统进行基因改造，并将之在体外诱导生成含有L-ASPase II的红细胞，生成的红细胞既能够作为L-ASPase II的缓释载体使用，又能够保持红细胞原有的形态功能，进一步降低了L-ASPase II的毒副作用，为今后的临床应用打下坚实的基础。
附图说明
图1：含目的基因L-ASPase II慢病毒载体（载体pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II）的图谱。
图2：使用慢病毒载体对IPS细胞进行基因改造流程图。
图3：体外诱导IPS细胞生成红细胞不同时期红细胞成熟度比较示意图，其中，（1）：培养当天；（2）培养第8天；（3）培养第11天；（4）培养第15天；（5）培养第20天；（6）培养第25天。
图4：L-ASPase II SDS-PAGE图。（1栏为刻度标记，2，3，4栏为纯化L-ASPase II）
图5：L-ASPase II紫外吸收光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：慢病毒载体构建及包装
从NCBI上查询得到大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因序列（981bp，最后一组为终止子）及氨基酸序列（326aa），如序列表中1、2所示。
慢病毒载体构建实验流程如下（流程如图2所示）：
1）构建克隆载体：目的基因L-天冬酰胺酶II基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，得到目的基因通过BamH I和EcoR I酶切位点连接到pUC57载体上，构建成克隆载体pUC57-L-ASPase II。
2）构建表达载体：质粒pUC57-L-ASPase II和载体质粒pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA（Invitrogen公司）同时使用BamH I和EcoR I酶进行双酶切，酶切体系：10x buffer2μl，BamH I和EcoR I各0.4μl，质粒溶液4μl（质粒浓度为0.35μg/μl），ddH2O13.2μl，总体积10μl。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。回收L-ASPase II基因片段和载体片段pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA，16℃连接，过夜（12h），连接产物转化至E.coli DH5α感受态菌。在琼脂平板上挑取大约10个克隆，每个克隆放入一个试管，每管加入对应抗性LB培养基（含氨苄青霉素100mg/ml）4ml，37℃、250rpm摇床过夜（12h）。将菌液做质粒抽提，并进行双酶切鉴定，确认构建的载体pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II(图1)准确。
3）质粒大抽：利用无内毒素质粒大量提取试剂盒（EndoFree plasmid giga kit，Qiagen公司）抽提正确的重组质粒pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II,并且利用双酶切和测序法鉴定序列的准确性。
4）病毒包装（该步为生物领域常规的慢病毒包装实验操作，所涉及的试剂均为常规试剂，在此不再赘述）：
第一天：
使用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔，确保第二天细胞密度达到80%～90%融合度。
第二天：
用500ul无血清培养基稀释①2ug重组质粒（pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPaseII+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G）；
用500ul无血清培养基稀释②15ul脂质体（lipofectamine2000）；
5分钟后，将质粒溶液和脂质体溶液（①和②）混合，室温静止20min。
从含有293FT细胞的6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml上述质粒和脂质体混合物。
6～10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FBS（从此刻开始算转染时间）。
第三天：
转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上。
第四天、第五天：
转染后72h收获含病毒的上清，3000rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。12000转离心浓缩细胞、分装-80℃贮存，即为含L-ASPase II的病毒颗粒，同时进行病毒滴度测定（测定结果是5x106TU/ml）。
实施例2：使用慢病毒载体对IPS细胞基因改造
1）铺板：将对数生长期的IPS用0.05%胰酶消化重悬于PBS液后，按1*105/ml密度接种于12孔板，生长过夜（12h）。
2）感染：将70～80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液（总共5个梯度，准备5个1.5ml EP管，每管加入90μlPBS，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀，依此类推，做5个稀释度（10～10-4）），混合均匀后放入37℃，5%CO2培养箱中培养。3）培养24h换液，48小时即可看荧光，将细胞置于MEF滋养层细胞上进行低密度培养（1*104/ml），12～14天后挑取克隆，进行下一步的红细胞培养。
实施例3：体外诱导IPS细胞生成含L-ASPase II的红细胞药物
1）IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB（Erythroid Body）
传代12～30代的人的IPS细胞（hIPS）（实施例2制备）使用胶原蛋白酶IV（collagenaseIV）消化后，转移到由IMDM（Biochrome）为基础培养液配制的培养液中，培养液中含SCF（Sigma,100ng/mL）TPO（Sigma，100ng/mL),FLT3配体(Sigma,100ng/mL),BMP4（Peprotech，10ng/mL),VEGF-A165（Sigma，5ng/mL),IL-3（Sigma,5ng/mL),IL-6（Peprotech，5ng/mL)以及促红细胞生成素EPO（Sigma，3U/mL)；细胞置于37℃，5%CO2条件下培养20天形成EB；形成EB后，用胶原蛋白酶B（Sigma,0.4U/mL）在37℃消化30分钟后细胞置于缓冲液（invitrogen）中10分钟。
2）EB诱导分化成成熟红细胞
①消化后EB细胞以5x105/ml铺瓶，培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），INSULIN（sigma公司，75ng/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml），Heparin（sigma公司，2U/ml），以及Transferrin（sigma公司50μg/ml）；置37℃、5%CO2条件下培养；
②培养至第4天，细胞由培养瓶以1X105/ml转入培养袋，培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），INSULIN（sigma公司，75ng/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）。置37℃、5%CO2条件下培养；
③培养至第8天（从①中的培养开始算的），细胞培养液以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；置37℃、5%CO2条件下培养；
④培养至第11天（从①中的培养开始算的），换用以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX（Sigma公司，5μM），以及Heparin（sigma公司，2U/ml）。细胞密度调整为2x106/ml；置37℃、5%CO2条件下培养；
⑤分别收集培养至11、15、20天的产物，进行成熟度比较；培养至25天时，收集终产物，即为含L-ASPase II的红细胞药物，进行红系细胞形态分析（如图3所示）。载药红细胞（终产物）各项血液学参数分析如表1所示，表1检测结果表明载药红细胞在血液学参数指标上与正常红细胞一致，载药未对红细胞正常形态及其他特性产生大的影响。载药红细胞（培养20天的产物，以及培养25天的终产物）表型流式细胞分析如表2所示，表2结果显示在培养末期红细胞高表达红细胞成熟标记包括CD71及CD235a，而低表达分化标记包括CD45，CD133及CD36等，表明最后培养获得的红细胞为成熟红细胞。
表1
表2
| 流式细胞表面标记 | D20红细胞体（%） | D25培养红细胞（%） |
| CD71 | 13 | 97 |
| CD36 | 0.7 | 23 |
| CD235a | 0.4 | 90 |
| CD45 | 11 | 1.2 |
| CD133 | 15 | 2.3 |
不同时期的红细胞成熟度的比较如图3所示，图3显示载药红细胞在体外培养的过程是一个逐渐成熟的过程，红细胞的形态逐步由大变小，且细胞脱核的比例逐步的提高。直至最后获得成熟红细胞。
实施例4：含天冬酰胺酶II的药物红细胞药物活性分析
使用Orsonneau JL描述的裂解红细胞L-ASPase II活性方法（Ann Biol Clin.2004）测量实施例3的含L-ASPase II的红细胞药物的诱导生成L-ASPase II活性。依据的原理：利用L一ASPase II能催化底物L一天冬酞胺水解生成天冬氨酸和氨。因此,可通过对其产物氨的测定来测定L一ASPase II的活性。L-ASPase II的SDS-PAGE图如图4所示，L-ASPaseII的紫外吸收光谱图如图5所示，图4及图5显示体外培养载药红细胞中所含有的L一ASPaseII分子量及吸收光谱与L一ASPase II标准品一致。L-ASPase II活性测定结果如表3所示，表3检测结果显示体外培养药物红细胞中所含的L一ASPase II具有正常的催化底物L一天冬酞胺水解生成天冬氨酸和氨活性。
表3
| L-ASPase II活性参数 | 测量结果 |
| 平均血球水平（IU/109红细胞） | 10+1.2IU/109红细胞 |
| 平均血球浓度（IU/ml红细胞） | 112+11.3IU/ml红细胞 |
Claims (3)
1.体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞：
Ⅰ.构建pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II质粒；
Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L-ASPase II的病毒颗粒；
Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞；
2）体外诱导诱导性多能干细胞生成含L-ASPase II的红细胞：
Ⅰ.IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB；
Ⅱ.EB诱导分化成成熟红细胞。
2.根据权利要求1所述的体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，其特征在于：所述步骤2）Ⅰ具体为：传代12～30代的人的IPS细胞使用胶原蛋白酶IV消化后，转移到由IMDM为基础培养液配制的培养液中，培养液中含SCF100ng/mL，TPO100ng/mL,FLT3配体100ng/mL,BMP410ng/mL,VEGF-A1655ng/mL,IL-35ng/mL,IL-65ng/mL以及促红细胞生成素EPO3U/mL；细胞置于37℃，5%CO2条件下培养20天形成EB；形成EB后，用胶原蛋白酶B在37℃消化30分钟后细胞置于缓冲液中10分钟。
3.根据权利要求1所述的体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，其特征在于：所述步骤2）Ⅱ具体为：
①消化后EB细胞以5x105/ml铺瓶，培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO3～6U/ml，INSULIN50～100ng/ml，SCF50～100ng/ml，DEX5～10μM，IL-35ng/ml，Heparin2U/ml以及Transferrin50μg/ml；置37℃、5%CO2条件下培养；
②培养至第4天，细胞由培养瓶以1X105/ml转入培养袋，培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO3～6U/ml，INSULIN50～100ng/ml，SCF50～100ng/ml，DEX5～10μM，IL～35ng/ml以及Heparin2U/ml，置37℃、5%CO2条件下培养；
③培养至第8天，细胞培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO3～6U/ml，SCF50～100ng/ml，DEX5～10μM以及Heparin2U/ml；
④培养至第11天，换用以IMDM培养基为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX5～10μM和Heparin2U/ml，细胞密度调整为2x106/ml；
⑤培养至25天，收集终产物，即为含L-ASPase II的药物红细胞。
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