CN103217491A - 一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途 - Google Patents
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Abstract
一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途,它涉及一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。本发明方法为:一、制备供试品溶液;二、制作指纹图谱,将供试品溶液注入高效液相色谱仪;本发明青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱有4个共有特征峰,这些共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。本发明青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指青龙衣抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于青龙衣质量控制中。本发明应用于医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。
背景技术
人体在氧化代谢的过程中会产生了大量含氧自由基,自由基通过细胞运输过程会破坏其他分子的结构,导致细胞受损,使人体各预防细胞机能下降、衰老,可诱发癌症、糖尿病、心血管疾病、肾脏病、动脉硬化、缺血性心脏病、神经系统疾病、眼睛疾病等百余种疾病。研究表明,通过补充抗氧化物质能够保持机体自由基的产生与消除的平衡,从而防止自由基对细胞和组织的损伤,是预防各疾病的有效措施之一,通过食用功能性的抗氧化食品也是一种即方便又有效的补充抗氧化剂的方法。
青龙衣,即胡桃科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.的新鲜未成熟果皮,主要含有黄酮类化合物、萘醌类化合物、二芳基庚烷类化合物,同时还含有甾体、萜类、脂肪酸等成分。青龙衣在中医临床上主要用于治疗皮肤病、子宫脱垂、白细胞减少等症。现代研究发现青龙衣具有细胞毒性、抑菌抗炎、镇痛作用以及显著的抗癌活性,而其抗氧化活性目前还未见报道,另外,由于中药的产地、来源、采收季节等情况复杂,如何采用科学、合理的方法控制其质量并与其活性紧密相关,是目前质量控制研究方法的新的思路和趋势,对保证临床用药的安全有效是十分必要的。而指纹图谱作为从整体上对中药进行质量控制的一种技术目前已载入2010版中国药典,其优势比起单一组分甚至多组分定性定量更加明显,关于青龙衣的指纹图谱研究目前有少量文献报道,现在没有方法可以建立青龙衣抗氧化提取物的指纹图谱,因此没有青龙衣抗氧化提取物的标准指纹图谱。
发明内容
本发明是要提供一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。
本发明一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,是按以下步骤进行:
一、供试品溶液的制备:a、取青龙衣药材,加10倍质量的质量百分含量为95%乙醇,浸泡72h,过滤,分别收集固相物A和液相物A,将固相物A加入10倍质量的质量百分 含量为95%乙醇中浸泡48h,过滤,分别收集固相物B和液相物B,将固相物B加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡24h,过滤,收集液相物C,然后将液相物A、B和C混合,得到浸提液;
b、将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10~1.14,得到浓缩液,再将浓缩液和水按体积比1∶1混合,然后用质量百分含量为10%的盐酸调节pH值至2,得到稀释后的浓缩液;
c、用与稀释后的浓缩液等体积的乙酸乙酯溶液对稀释后的浓缩液进行萃取,收集有机相,重复萃取2次,然后合并有机相,再减压浓缩至干,得到干燥的固体为青龙衣抗氧化活性提取物;
d、将步骤c得到的青龙衣抗氧化活性提取物,用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液,用微孔滤膜进行过滤,滤液即为供试品溶液;
二、指纹图谱的制作:将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪,以甲醇为A相,质量百分含量为0.2%的磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱;
其中,高效液相色谱条件为:
色谱柱填料Thermo C18,规格为250×4.6mm,5μm;柱温为35℃;流动相为A相甲醇和B相质量百分含量为0.2%磷酸水溶液,流速0.8mL/min,检测波长250nm,进样量20μL;
在此条件下分析供试品溶液,得到青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱。
本发明采用一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱。
本发明青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指青龙衣抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于青龙衣质量控制中。
本发明提取了青龙衣中具有抗氧化作用的提取物,通过对DPPH自由基清除试验,证明了该提取物具有优良的抗氧化活性,本发明青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法具有可重复性好、精密度好和稳定可靠的优点。本发明的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱有4个共有特征峰,这些共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。本发明的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱作为标准指纹图谱经多批样品验证后可用于青龙衣质量控制中,用于从整体上评价和控制青龙衣药材的质量,既避免了因只测定一、二个化学成分而判定青龙衣整体质量的片面性,又减少了为质量达标而人为添加对照成分的可能性。
附图说明
图1为试验1建立的11批青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱;
图2为试验1提供的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱;其中1至4为青龙衣抗氧化活性提取物的4个共有特征峰。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,是按以下步骤进行:
一、供试品溶液的制备:a、取青龙衣药材,加10倍质量的质量百分含量为95%乙醇,浸泡72h,过滤,分别收集固相物A和液相物A,将固相物A加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡48h,过滤,分别收集固相物B和液相物B,将固相物B加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡24h,过滤,收集液相物C,然后将液相物A、B和C混合,得到浸提液;
b、将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10~1.14,得到浓缩液,再将浓缩液和水按体积比1∶1混合,然后用质量百分含量为10%的盐酸调节pH值至2,得到稀释后的浓缩液;
c、用与稀释后的浓缩液等体积的乙酸乙酯溶液对稀释后的浓缩液进行萃取,收集有机相,重复萃取2次,然后合并有机相,再减压浓缩至干,得到干燥的固体为青龙衣抗氧化活性提取物;
d、将步骤c得到的青龙衣抗氧化活性提取物,用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液,用微孔滤膜进行过滤,滤液即为供试品溶液;
二、指纹图谱的制作:将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪,以甲醇为A相,质量百分含量为0.2%的磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱;
其中,高效液相色谱条件为:
色谱柱填料Thermo C18,规格为250×4.6mm,5μm;柱温为35℃;流动相为A相甲醇溶液和B相质量百分含量为0.2%磷酸水溶液,流速0.8mL/min,检测波长250nm,进样量20μL;
在此条件下分析供试品溶液,得到青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱。
本实施方式提取了青龙衣中具有抗氧化作用的提取物,通过对DPPH自由基清除试验,证明了该提取物具有优良的抗氧化活性,本实施方式青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法具有可重复性好、精密度好和稳定可靠的优点。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:梯度洗脱顺序为:0min→10min→30min→36min,甲醇35%→45%→60%→60%。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一中的微孔滤膜 过滤是采用0.45μm微孔滤膜进行过滤的。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式采用一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱。
本实施方式的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱有4个共有特征峰,这些共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式四不同的是:青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱有4个共有特征峰,以3号峰为对照峰,共有特征峰的相对保留时间分别为0.717~0.719min、0.819min,1.000min和1.189min,这些共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式四或五不同的是:青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱的4个共有特征峰,以3号峰为对照峰,共有特征峰的相对保留时间分别为0.717~0.719min、0.819±0.01%min、1.000min和1.189±0.02%min。其它与具体实施方式四或五相同。
具体实施方式七:本实施方式青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指青龙衣抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于青龙衣质量控制中。
本实施方式的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱作为标准指纹图谱经多批样品验证后可用于青龙衣质量控制中,用于从整体上评价和控制青龙衣药材的质量,既避免了因只测定一、二个化学成分而判定青龙衣整体质量的片面性,又减少了为质量达标而人为添加对照成分的可能性。
通过以下试验验证本发明的有益效果:
试验1:
1、试验方法:本试验青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,是按以下步骤进行:
一、供试品溶液的制备:a、取青龙衣药材250g,加10倍质量的质量百分含量为95%乙醇,浸泡72h,过滤,分别收集固相物A和液相物A,将固相物A加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡48h,过滤,分别收集固相物B和液相物B,将固相物B加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡24h,过滤,收集液相物C,然后将液相物A、B和C混合,得到浸提液;
b、将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10~1.14,得到浓缩液,再将浓缩液和水按体积比1∶1混合,然后用质量百分含量为10%的盐酸调节pH值至2,得到稀释后的浓缩液;
c、用与稀释后的浓缩液等体积的乙酸乙酯溶液对稀释后的浓缩液进行萃取,收集有机相,重复萃取2次,然后合并有机相,再减压浓缩至干,得到干燥的固体为青龙衣抗氧化活性提取物;
d、将10mg步骤c得到的青龙衣抗氧化活性提取物,用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液,用0.45μm的微孔滤膜进行过滤,滤液即为供试品溶液;
二、指纹图谱的制作:将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪,以甲醇为A相,质量百分含量为0.2%的磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱;
其中,高效液相色谱条件为:
1、色谱柱填料Thermo C18,规格为250×4.6mm,5μm;柱温为35℃;流动相为A相甲醇和B相质量百分含量为0.2%磷酸水溶液,采用梯度洗脱方式0min→10min→30min→36min,甲醇35%→45%→60%→60%;流速0.8mL/min,检测波长250nm,进样量20μL;
2、试验仪器:HITACHI L-2000高效液相色谱仪;HITACHI L-2400紫外检测器;AT-130色谱柱柱温箱;HITACHI D-2000色谱工作站。
3、试验材料:11批青龙衣药材采自黑龙江、吉林两地。
用质量百分含量为95%的乙醇溶液分别将本试验制备的11组的青龙衣抗氧化活性提取物溶解成浓度为1mg/mL的溶液,用0.22μm的微孔滤膜过滤,将所得的续滤液用于DPPH自由基清除法测定抗氧化活性。每组实验重复三次,根据抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%计算;A0为不含提取物的对照吸光度;A1为含提取物的吸光度;A2是不含DPPH的吸光度,试验结果如表1所示。从表1中可知,青龙衣抗氧化活性提取物对DPPH自由基有不同程度的抑制作用。为比较青龙衣抗氧化活性提取物与Vc的抗氧化能力大小,对11批青龙衣活性提取物的EC50值进行了测定,即:清除50%原始DPPH·浓度所需抗氧化剂量的大小。EC50值越小,样品清除自由基能力越强,抗氧化能力越强。具体操作如下:分别移取1.0mg/mL的样品溶液1.60mL、0.80mL、0.40mL、0.20mL、0.10mL与2mL DPPH溶液混合,再用乙醇溶液补至4mL,充分混合,暗处反应30min,517nm下测定吸光度值(A1),同时将上述5个浓度的样品溶液分别用乙醇溶液补至4mL,测混合液吸光值(A2),2mL DPPH与2mL乙醇混合液的吸光值(A3),按公式计算抑制率。运用GraphPad Prim软件进行曲线拟合得出11批青龙衣抗氧化活性提取物的EC50值。同方法测定Vc的EC50值 做阳性对照。
结果如表2所示:青龙衣抗氧化提取物的EC50在0.043~0.125mg/mL之间,作用最强的药材的提取物抗氧化能力约为Vc的五分之一,显示了较强的抗氧化能力。
其中本试验的DPPH溶液的制备方法:称取8mg的DPPH粉末,用质量百分含量为95%乙醇定容至100mL,得初始浓度为2×10-4mol/L的DPPH溶液,放置于4℃下冷藏备用。
按照本试验的青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,对11批青龙衣抗氧化活性提取物建立了高效液相色谱指纹图谱(见图1),得到的谱图导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件(中华人民共和国药典委员会,2004年版),确定了4个共有特征峰,以3号峰为对照峰,共有特征峰的相对保留时间分别为;1号共有特征峰相对保留时间为0.718±0.16%,2号峰相对保留时间为0.819±0.01%,3号峰相对保留时间为1.000,4号峰相对保留时间为1189±0.02%,上述共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。
本试验得到的青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱如图2所示。由图2可以看出,通过本方法可以清晰地得到具有4个共有特征峰的青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱,为整体评价青龙衣的质量提供了良好的依据。
4、方法学考察
4.1方法重现性试验
取同一批青龙衣药材6份,按照试验方法中青龙衣抗氧化活性提取物供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,进行指纹图谱测定,分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计,结果如表3所示,RSD%均不超过3%,显示本发明的方法重现性良好。
4.2指纹图谱精密度试验
取方法重现性试验用的供试品溶液一份,连续进样5次,分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计,RSD%均不超过3%(表4),结果显示本发明的方法精密度良好。
4.3指纹图谱稳定性试验
取方法重现性试验用的供试品溶液一份,进行指纹图谱测定,考察供试品溶液48小时内的稳定性,分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计,RSD%均不超过3%(表5),结果显示供试品溶液在48小时内稳定。
以上试验结果显示,该测定方法稳定可靠,指纹图谱相对稳定。
表1批青龙衣抗氧化活性提取物的抑制率
注:每组实验重复3次,结果用平均值±标准差表示
表211批北青龙衣抗氧化提取物的EC50值
表3重现性试验结果(n=6)
表4精密度试验结果(n=5)
表5稳定性试验结果(n=5)
Claims (6)
1.一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,其特征在于青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法是按以下步骤进行:
一、供试品溶液的制备:a、取青龙衣药材,加10倍质量的质量百分含量为95%乙醇,浸泡72h,过滤,分别收集固相物A和液相物A,将固相物A加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡48h,过滤,分别收集固相物B和液相物B,将固相物B加入10倍质量的质量百分含量为95%乙醇中浸泡24h,过滤,收集液相物C,然后将液相物A、B和C混合,得到浸提液;
b、将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10~1.14,得到浓缩液,再将浓缩液和水按体积比1∶1混合,然后用质量百分含量为10%的盐酸调节pH值至2,得到稀释后的浓缩液;
c、用与稀释后的浓缩液等体积的乙酸乙酯溶液对稀释后的浓缩液进行萃取,收集有机相,重复萃取2次,然后合并有机相,再减压浓缩至干,得到干燥的固体为青龙衣抗氧化活性提取物;
d、将步骤c得到的青龙衣抗氧化活性提取物,用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液,用微孔滤膜进行过滤,滤液即为供试品溶液;
二、指纹图谱的制作:将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪,以甲醇为A相,质量百分含量为0.2%的磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱;
其中,高效液相色谱条件为:
色谱柱填料Thermo C18,规格为250×4.6mm,5μm;柱温为35℃;流动相为A相甲醇和B相质量百分含量为0.2%磷酸水溶液,流速0.8mL/min,检测波长250nm,进样量20μL;
在此条件下分析供试品溶液,得到青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,其特征在于梯度洗脱顺序为:0min→10min→30min→36min,甲醇35%→45%→60%→60%。
3.根据权利要求1所述的一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法,其特征在于步骤一中的微孔滤膜过滤是采用0.45μm微孔滤膜进行过滤的。
4.采用权利要求1所述的一种青龙衣抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱。
5.根据权利要求5所述的青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱,其特征在于青龙衣抗氧化活性提取物的指纹图谱有4个共有特征峰,以3号峰为对照峰,共有特征峰的相对保留时间分别为0.717~0.719min、0.819min,1.000min和1.189min,这些共有特征峰构成了青龙衣抗氧化活性提取物的指纹特征,可作为青龙衣抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。
6.青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途,其特征在于青龙衣抗氧化活性提取物标准指纹图谱作为标准指纹图谱用于青龙衣质量控制中。
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