CN103217332A

CN103217332A - 一种中药的前处理方法

Info

Publication number: CN103217332A
Application number: CN2013101773322A
Authority: CN
Inventors: 曹君; 胡帅帅; 刘晓娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明公开了一种由纳米分散液用于富集丹参酮胶囊中二萜醌类成分的中药前处理方法，所用纳米液为杂化介孔材料Permanent Confined Micell Arrays-60的分散体系。本发明所用方法富集效果显著，可以更为有效地富集丹参酮胶囊中的二萜醌类化学成分。

Description

一种中药的前处理方法

技术领域

本发明涉及一种中药的前处理方法。具体地涉及由杂化介孔材料Permanent ConfinedMicell Arrays-60(本文以下简称PCMA-60)的纳米分散液作为中药样品前处理中的吸附剂，用来富集丹参酮胶囊中的二萜醌类成分，属于天然药物提取制备领域。

背景技术

丹参为唇形科植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，用于月经不调、腕腹胁痛、胸壁心痛、痛经经闭等症，具有清心除烦、通经止痛、活血祛瘀、凉血消痈的作用。临床上证实丹参具有扩张血管、抑制血小板凝聚及抗血栓形成以及保护心肌、降血脂及抗动脉粥样硬化、增加冠脉流量、抗肿瘤、抗菌消炎等作用。将丹参中的二萜醌类成分经过提取制备成的丹参酮胶囊，除了用药更为便捷之外，还突出了二萜醌类成分的药理活性，具有抗菌消炎之功效，用于骨髓炎、痤疮、扁桃腺炎、外耳道炎、疖痈、外伤感染、烧伤感染、乳腺炎以及蜂窝组织炎等症。丹参酮胶囊中的活性成分主要包括二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA等。

开展仪器分析工作，必不可少地将涉及到样品前处理这一环节。随着现代分析仪器的研究飞速发展，如气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱联用等，对仪器分析的灵敏度要求和检测限要求也越来越高。例如中药制剂丹参酮胶囊的分析，在制备样品这一环节上，大多对药材直接进行成分提取、进样分析，而未经过任何前处理步骤，导致仪器在采集数据时响应较低、灵敏度较差，显然已经不能满足人们对该样品分析方法的要求。

近年来新型有效的样品前处理方法得到迅速发展，目的是为了克服上述方法所存在的缺点，一系列微量富集技术被相继推出，例如固相萃取法、固相微萃取法、膜技术、超临界流体萃取法等。

发明内容

本发明提供了一种由杂化介孔材料PCMA-60的纳米分散液作为吸附剂的中药前处理方法，用于富集丹参酮胶囊所含的二萜醌类成分，具体包括：选取丹参酮胶囊中所含有的四种代表性二萜醌类成分，即二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA，制备成对照品(或样品)溶液，水稀释后经纳米分散液吸附、富集、洗脱后，即得富集后的浓缩液并进样分析。

优选地，本发明所述的纳米分散液为杂化介孔材料PCMA-60的纳米分散体系。

具体地，本发明所述的中药前处理方法是通过下列技术措施来实现的：

a.称取对照品(或样品)，配制成对照品(或样品)溶液；

b.称取杂化介孔材料PCMA-60并制备成纳米分散液；

c.通过最优富集方案，对样品混合液进行富集；

d.过滤富集液，通过最优洗脱方案，对滤膜进行洗脱。

其特征是：

所述对照品，包括四种二萜醌类成分，分别是：二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA。所述样品，为丹参酮胶囊提取液，具体制备方式为取丹参酮胶囊粉末约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取5μL上层清液加入995μL纯水混合成样品溶液。

所述纳米分散液，其特征在于物质配比为每10mL水中加入2mg杂化介孔材料PCMA-60。

所述的最优富集方案，其特征在于富集的时间为2分钟。

所述的最优富集方案，其特征在于富集所使用的仪器为回旋振荡器。

所述的最优富集方案，其特征在于每11mL混合液中纳米分散液的加入体积为1.0mL。

所述的最优洗脱方案，其特征在于洗脱液为微量甲醇。

所述的最优洗脱方案，其特征在于洗脱液的体积为200μL。

具体的实验步骤：

1.取二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制备成每1mL含500μg的溶液，即得。(或取丹参酮胶囊粉末约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取5μL上层清液加入995μL纯水混合成样品溶液。)

2.称取2mg杂化介孔材料PCMA-60加入10mL水，称重，超声直至形成均匀的白色分散体系，取出，静置，再称定重量，用水补足减失的重量，即得纳米分散液。

3.取1只规格为50mL的具塞锥形瓶，加入9mL纯水、1mL杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水，称重，放入回旋振荡器中混合摇晃。2min后取出，静置，再次称重，用水补足减失的重量。

4.取规格为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，分别用1mL甲醇和纯水对滤膜进行活化，吸取混合液，利用活化后的滤膜对混合液进行富集过滤。

5.取微量甲醇200μL于注射器中，对富集后的滤膜进行洗脱，滤液装入进样瓶中。

6.将进样瓶放入HPLC-Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪中进样分析。

本发明的优点在于：

经过富集方法处理之后，仪器的灵敏度大大提高，丹参酮胶囊中每种二萜醌类成分的检测限均比传统方法降低300～500倍左右，使得在测定丹参酮胶囊中的二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA四类二萜醌类成分更加精确有效。

本方法属于分散微固相萃取技术。该技术在传统的领域中，未曾有报道将杂化介孔材料PCMA-60作为纳米分散液进行富集。所以本发明的意义，对分散微固相萃取而言，在于发现了一种新的杂化介孔材料PCMA-60。另外本发明的意义对中药前处理技术领域来讲，又在于发现了一种新的方法，比以往的方法更加快速便捷。

本发明方法具备一系列优异突出的特性：

1.杂化介孔材料PCMA-60化学稳定性和热稳定性良好，不易燃，对人体以及环境无任何毒害作用，使操作环境安全可靠。

2.实验所用材料简单易得，价格低廉；所用仪器快速高效。

3.实验步骤清晰明了、通俗易懂，操作简单。

4.提取效率高、重现性好，能用于天然产物中二萜醌类成分的分离和富集，应用范围广。

附图说明

图1，实验操作步骤流程图

图2，二萜醌类对照品的TIC/EIC图和丹参酮胶囊提取液的TIC/EIC图。其中图2-1A为二氢丹参酮+丹参酮I+隐丹参酮+丹参酮II A混合对照品的TIC图，图2-1B为二氢丹参酮对照品的EIC图，图2-1C为丹参酮I对照品的EIC图，图2-1D为隐丹参酮对照品的EIC图，图2-1E为丹参酮IIA的EIC图；图2-2A为丹参酮胶囊提取液的TIC图，图2-2B为丹参酮胶囊提取液中二氢丹参酮的EIC图、图2-2C为丹参酮胶囊提取液中丹参酮I的EIC图、图2-2D为丹参酮胶囊提取液中隐丹参酮的EIC图，图2-1E为丹参酮胶囊提取液中丹参酮II A的EIC图。其中色谱图峰位置标注的数字代表不同的二萜醌类成分，具体为：1表示二氢丹参酮、2表示丹参酮I、3表示隐丹参酮、4表示丹参酮IIA。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明进行更为详细的描述。

下述事例示意性地对本发明进行描述，该描述没有限制性，在附图中所述的事例也仅仅只是本发明创造的方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，假如本领域的研究人员受到本发明的启示，未经自我创造便设计出与本发明相似的结构体系与具体事例，均应当属于本发明的保护范围。

以下实例中的制备纳米分散液时，可采用任何混合方式将纳米分散液分散即可，并不一定完全按照本发明的方法。实施中未注明具体条件和步骤的称量、混合、超声振荡等方法均为本领域普通技术人员熟知的技术。

具体实例：

实施例1对最优富集时间的考察。具体的操作步骤如下：

1.取二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制备成每1mL含500μg的溶液。

3.取6只规格均为50mL的具塞锥形瓶编号1、2、3、4、5、6，都加入9mL纯水、1mL杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水，称重。并将6只具塞锥形瓶一同放入回旋振荡器中。

4.启动运行回旋振荡器，进行混合摇晃。1号瓶在摇晃1min后取出，2号瓶在摇晃2min后取出，3号瓶在摇晃4min后取出，4号瓶在摇晃8min后取出，5号瓶在摇晃16min后取出，6号瓶在摇晃32min后取出。将1-6号具塞锥形瓶静置，称重，用水补足所减失的重量，即得富集混合液。

5.取规格均为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，对应具塞锥形瓶编号为1-6，分别用1mL甲醇和纯水对6个滤膜进行活化，吸取混合液，利用活化后的滤膜对1-6号具塞锥形瓶中的混合液进行富集过滤。

6.取微量甲醇200μL于注射器中，分别对1-6号注射器相连的滤膜进行洗脱。取6只进样瓶，对应注射器编号为1-6，装入洗脱后的滤液。

7.将1-6号进样瓶放入HPLC-Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪中进样分析。

实验结果如下表所示：

上述数据表面，在相同情况下，混合时间为2min是最优条件。

实施例2最优富集所用仪器的考察。具体实验步骤如下：

3.取3只规格均为50mL的具塞锥形瓶编号1、2、3，都加入9mL纯水、1mL杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮II A以及975μL纯水，称重。

4.将1号具塞锥形瓶放入磁力搅拌器装置中，2号具塞锥形瓶放入超声仪中，3号具塞锥形瓶放入回旋振荡器中。启动仪器，开始混合。1-3号具塞锥形瓶所对应仪器的运行时间均为2min。

5.取规格均为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，对应具塞锥形瓶编号为1-3，分别用1mL甲醇和纯水对3个滤膜进行活化，吸取混合液，利用活化后的滤膜对1-3号具塞锥形瓶中的混合液进行富集过滤。

6.取微量甲醇200μL于注射器中，分别对1-3号注射器相连的滤膜进行洗脱。取3只进样瓶，对应注射器编号为1-3，装入洗脱后的滤液。

7.将1-3号进样瓶放入HPLC-Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪中进样分析。

实验结果如下表所示：

上述实验结果表面，在同样条件下，相比磁力搅拌和超声混合，利用回旋振荡器混合这一方式是最优选择。

实施例3最优纳米浓度的考察。具体实验操作步骤为：

3.取4只规格均为50mL的具塞锥形瓶编号1、2、3、4。1号瓶加入9.5mL纯水、0.5mL的杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水；2号瓶加入9.0mL纯水、1.0mL的杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水；3号瓶加入8.5mL纯水、1.5mL的杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水；4号瓶加入8.0mL纯水、2.0mL的杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水。加完混合液之后均称重。

4.将4只具塞锥形瓶一同放入回旋振荡器，均在摇晃2min后取出，静置，称重，用水补足减失的重量。

5.取规格均为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，对应具塞锥形瓶编号为1-4，分别用1mL甲醇和纯水对4个滤膜进行活化，吸取混合液，利用活化后的滤膜对1-4号具塞锥形瓶中的混合液进行富集过滤。

6.取微量甲醇200μL于注射器中，分别对1-4号注射器相连的滤膜进行洗脱。取4只进样瓶，对应注射器编号为1-4，装入洗脱后的滤液。

7.将1-4号进样瓶放入HPLC-Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪中进样分析。

实验结果如下表所示：

上述实验数据表面，在相同条件下，当纳米液加入体积为1.0mL时，富集效果最显著。

实施例4最优洗脱液种类的考察。具体实验步骤如下：

3.取4只规格均为50mL的具塞锥形瓶编号1、2、3、4，都加入9mL纯水、1mL杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、5μL二氢丹参酮、10μL丹参酮I、5μL隐丹参酮、5μL丹参酮IIA以及975μL纯水，称重。并将4只具塞锥形瓶一同放入回旋振荡器中。

4.将4只具塞锥形瓶一同放入回旋振荡器，启动运行回旋振荡器，进行混合摇晃，均在摇晃2min后取出，静置，称重，用水补足减失的重量。

5.取规格均为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，对应具塞锥形瓶编号为1-5，吸取1mL甲醇并将其用滤膜过滤，对滤膜进行一次活化，后再用同样方法吸取1mL纯水对滤膜进行活化，吸取1号具塞锥形瓶中的富集混合液，利用活化的后的滤膜对富集混合液进行过滤。2-4号具塞锥形瓶也采用同样的方法进行过滤。

6.取200μL正己烷于1号注射器中，对1号注射器相连的滤膜进行洗脱；取200μL乙醇于2号注射器中，对2号注射器相连的滤膜进行洗脱；取200μL乙腈于3号注射器中，对3号注射器相连的滤膜进行洗脱；取200μL甲醇于4号注射器中，对4号注射器相连的滤膜进行洗脱。取4只进样瓶，对应注射器编号为1-4，装入洗脱后的滤液。

实验结果如下表所示：

上述实验数据表面，在相同条件下，甲醇最为洗脱液是最优的选择。

实施例5最优所述的洗脱液体积的考察。具体操作步骤如下：

5.取规格均为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，对应具塞锥形瓶编号为1-4，吸取1mL甲醇并将其用滤膜过滤，对滤膜进行一次活化，后再用同样方法吸取1mL纯水对滤膜进行活化，吸取1号具塞锥形瓶中的富集混合液，利用活化的后的滤膜对富集混合液进行过滤。2-4号具塞锥形瓶也采用同样的方法进行过滤。

6.取100μL甲醇于1号注射器中，对1号注射器相连的滤膜进行洗脱；取200μL甲醇于2号注射器中，对2号注射器相连的滤膜进行洗脱；取300μL甲醇于3号注射器中，对3号注射器相连的滤膜进行洗脱；取400μL甲醇于4号注射器中，对4号注射器相连的滤膜进行洗脱；取4只进样瓶，对应注射器编号为1-4，装入洗脱后的滤液。

实验结果如下表所示：

上述数据表面，在相同条件下，洗脱液甲醇的体积选取200μL是最优选择。

实施例6丹参酮胶囊提取液中原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸含量的测定

1.取丹参酮胶囊粉末约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取5μL上层清液加入995μL纯水混合成样品溶液。

3.取1只规格为50mL的具塞锥形瓶，加入9mL纯水、1mL杂化介孔材料PCMA-60纳米分散液、丹参酮胶囊提取液5μL以及995μL纯水，称重，并将具塞锥形瓶放入回旋振荡器中。

4.启动运行回旋振荡器，进行混合摇晃。具塞锥形瓶在摇晃2min后取出，静置，称重，用水补足减失的重量。

5.取规格为5mL的注射器和0.45μm规格的微孔滤膜，吸取1mL甲醇并将其用滤膜过滤，对滤膜进行一次活化，后再用同样方法吸取1mL纯水对滤膜进行活化，吸取具塞锥形瓶中的富集混合液，利用活化后的滤膜对富集混合液进行过滤。

6.取微量甲醇200μL于注射器中，对注射器相连的滤膜进行洗脱。取1只进样瓶，装入洗脱后的滤液。

7.将进样瓶放入HPLC-Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪中进样分析。

实验结果：在丹参酮胶囊中，4种二萜醌类成分中二氢丹参酮的含量为302.1675mg/g、丹参酮I的含量为172.0531mg/g、隐丹参酮的含量为233.6251mg/g、丹参酮IIA的含量为673.3891mg/g。

Claims

1.一种中药前处理方法，所述方法为：选取丹参酮胶囊中所含有的四种代表性二萜醌类成分，即二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA，制备成对照品(或样品)溶液，水稀释后经纳米分散液吸附、富集、洗脱后，即得富集后的浓缩液并进样分析。

2.根据权利要求1所述的中药前处理方法，其中所述的纳米分散液为杂化介孔材料PCMA-60的纳米分散体系。

3.根据权利要求1和2中任意一权利要求所述的中药前处理方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

a.称取对照品(或样品)，配制成对照品(或样品)溶液；

b.称取杂化介孔材料PCMA-60并制备成纳米分散液；

c.通过最优富集方案，对样品混合液进行富集；

d.过滤富集液，通过最优洗脱方案，对滤膜进行洗脱。

4.根据权利要求3所述的对照品，包括四种二萜醌类成分，分别是：二氢丹参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA。所述样品，为丹参酮胶囊提取液，具体制备方式为取丹参酮胶囊粉末约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取5μL上层清液加入995μL纯水混合成样品溶液。

5.根据权利要求3所述的纳米分散液，其特征在于物质配比为每10mL水中加入2mg杂化介孔材料PCMA-60。

6.根据权利要求3所述的最优富集方案，其特征在于富集的时间为2分钟。

7.根据权利要求3所述的最优富集方案，其特征在于富集所使用的仪器为回旋振荡器。

8.根据权利要求3所述的最优富集方案，其特征在于每11mL混合液中纳米分散液的加入体积为1.0mL。

9.根据权利要求3所述的最优洗脱方案，其特征在于洗脱液为微量甲醇。

10.根据权利要求3所述的最优洗脱方案，其特征在于洗脱液的体积为200μL。