CN1032170A - 由松子外壳中提取生理活性物质的方法和以该提取物为主要粗材料制备的抗传染病药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取生理活性物质的方法，其 中粒状酸性多糖是一个主要成分。将松子外壳浸泡 于碱性溶液以进行提取处理。得到的提取物以过滤 来分离不溶物，然后将剩余的溶液浓缩，再调解 pH。其中粒状酸性多糖为其主要成的生理活性物质 通过冷冻干燥处理被提取出来。其中以提取方法所 得酸性多糖为主要成分的抗传染药物提供了一种活 化功能，到目前为止，这种活化功能胜过传统抗肿瘤 多糖对多形核白细胞的活化作用。

Description

本发明涉及由诸如黑松、红松、白松树和松子外壳中提取包括酸性多糖在内的生理活性物质的方法和抗传染病药物，其中上述提取物为一个主要粗提物。

多年以来，就把松子看做为高营养价值的食用坚果而提供为食品。

特别是，由松子中提取的松子油被认为是含生理活性的营养成分。另外某些地区含松子的松果，出于健康的考虑以煎剂形式利用。无论那种情况，众所周知松子或松果都含某些高生理活性的物质。

采用上述物质，本发明的发明者进行了开发和研究工作，以扩大松子和松果的应用范围。例如，发展了提取松子油的技术或由松子坚硬外壳中取出松子的技术。

此外，提取松子油残渣的榨饼及除去松子的外壳通过沸水煎煮，即所谓沸水提取处理，上述提取处理所得的溶液用滤纸过滤，该滤液减压浓缩即看到里面所含的物质。做为这个试验的结果，发明者发现了一种多糖，该多糖有明显高生理活性，特别是活化白血球中的粒性白血球的功能。

由松子外壳中有效地提取有明显活化功能的酸性多糖是本发明的目的之一。为此目的，除去松子外壳的油脂，为进行碱性溶液提取处理将其浸泡于碱性溶液，然后调解提取液的pH度。提取液用离心机处理得到提取物沉淀。上述沉淀提取物通过过滤处理再使其浓缩。浓缩的提取液冷冻干燥后成为粒状酸性多糖。这样，在松子外壳中提取回收一个主要成分。

换言之，本发明的特征为通过去脂处理使松子外壳的油脂和低聚物除去，然后为进行碱性溶液提取向其中加入碱溶液。在提取处理后所得的提取液，调解其pH度，这样，就从松子外壳中提取得到酸性多糖。

多次试验的结果证明，白松子胜过其他黑松和红松子，是最好的一种适用于本发明意图的松子。

另外也证明，11月中采集的白松子外壳是最好的。

松子外壳是非常坚硬的，总是很难由松子中将其有效地分出。然而，本发明者成功的发明了一个特殊的粉碎方法，使之很容易除去松子外壳。也证明，如果根据需要对由松子分离出来的外壳进行干燥，且粉碎成适于提取的程度，本发明的工作效率得到大大提高。

应用于本发明提取处理的碱性溶液选自有机氯化物或无机氯化物的碱性溶液。然而，考虑到提取液和提取物的后处理，氨水可通过加热处理很容易除掉碱性而被认为是最理想的。

碱性溶液的碱化度取决于松子的种类或含量。已证明pH7或者pH7以上是合乎需要的，pH7.5-10之间最适合。

本发明的提取工作开始于将粉碎成要求大小的松子浸入碱性溶液的工序。

应用于提取的碱性溶液的量没有特殊限制，但推荐使用量为松子的五倍。普通温度使用的碱性溶液在高温下也允许使用。

通过过滤或类似的处理由松子分离的提取液，用减压浓缩或类似的处理浓缩到适当的浓度。然后用诸如盐酸或类似的酸调解pH。最后，经过冷冻干燥得到粒状的酸性多糖。

由本发明的方法得到和回收的粒状酸性多糖有一点其本身的气味。粒状物为褐色并很易溶于水。

酸性多糖的提取方法在以下优选实施方案的基础上加以阐明：

制备在中华人民共和国吉林省浑江市11月中旬收集的白松树的松子，用于实施方案。

做为本发明工序的预处理，10kg的松子外壳用大约4升甲醇洗涤。松子中的油脂和低聚物被除掉。

下一步，在上面预处理中洗过的松子浸泡在大约4升沸水中。这种热水提取处理重复做三次，每次6小时。所得粗提物溶液用滤纸过滤，除去不溶物。锰崛∫杭跹古ㄋ酢Ｋ门ㄋ跻河?倍于上述浓缩液的乙醇稀释，所得沉淀物溶于蒸馏水，通过透析处理除去低聚物，最后回收所谓热水提取物。

此外，6升浓度为0.8%的氨水加到上述热水提取处理过的剩余残渣中，在45℃搅拌3小时再分离提取液。残渣再用氨水提取处理。第一次和第二次的提取液混合在一起用滤布过滤。

下一步，9.5升的滤液在40℃减压浓缩至150ml。通过盐酸处理将滤液pH度调至5.4並加以冷冻干燥，即得到4.5g褐色粒状酸性多糖。

在上述处理的提取液中所得粒状多糖有一种其本身独具的味道，其1%（W/V）溶液的pH度为4.5-6.0。

测定了上述酸性粒状多糖的砷和重金属的含量。结果表明，两者的含量分别小于2ppm和30ppm。大肠杆菌群是极少的，一般细菌数小于1000/g。

以下图表说明本发明的提取处理

提取的酸性多糖的活化功能试验叙述如下：

为了确定由碱性提取液得到的酸性多糖的生理化功能，使用了以下的方法。

首先，人外周血做为试验活化功能的靶源以生理盐水液稀释两倍量。稀释液积累于Fiooll-Hypague层（比重为1.077），以离心机在1500转/分处理30分钟。红血球和多型核白细胞部分由混合物低层取出。

上述红血球和多型核白细胞部分用生理盐水洗涤，並用前面离心处理制备的血清稀释。所得到的稀释混合物积累于Mono-Poly    Resolving    Medium    Ficoll-Hypogue层（比重1.114）並在1，500转/分离心处理30分钟。收集含有多形核白细胞的中间层。其次，上述中间层用非血清RPMI1640培养液洗涤两次，得到作为靶源的纯化多形核白细胞部分。多形核白细胞的纯度大于95%。

在上面处理的基础上得到的靶源加入热水提取的多糖（按表Ⅰ）以及用碱溶液提取的酸性多糖Ⅰ和Ⅱ並确定其生理活化功能。做为一个确定的方法，Klebanoff和Clark的方法（J.Lab.Clin.Med.89：675，686，1977）在稍加修改后应用。

即，1×10⁶PCS的多形核白细胞悬浮于0.5ml非血清RPMI1640培养液中，上述培养液含有各种浓度的试验物质（热水提取的多糖，碱溶液提取的酸性多糖Ⅰ和Ⅱ以及作为对照的TAK，CM-TAK）以及8×10^-6M放射活性Na¹²⁵I（IuCi/mL）。

在37℃孵育处理1小时，接着用生理盐水洗涤，然后加5%冰冻的三氯醋酸。放在冰浴上20分钟，然后，3，000转/分离心10分钟，沉淀中的放射活性物质（酸性不溶部分）用γ-射线计数器来测定。

表Ⅰ    由松子外壳提取的酸性多糖对人周血多形核白细胞的活化功能

类别    提取物    多形核白细胞的酸性不溶部分吸收的

放射活性碘（pmol/10⁷细胞/

小时）

浓度（μg/mL）    多型核白细胞

100    231

松子外壳    热水提取多糖    1000    460

松子外壳    碱性溶液提取多    100    451

糖    Ⅰ    1000    279

松子外壳    碱性溶液提取多    100    242

糖    Ⅱ    1000    369

TAK    100    32

1000    89

CM-TAK    100    6

1000    7

生理盐水    -    7

为对照    -    9

注（1）TAK，CM-TAK是日本开发的一种具有强活性功能的抗肿瘤多糖

注（2）TAK……（1→3）β-D-葡聚糖（Cancer    Res    38，379-383，1987）是由粪产碱杆菌产粘液变种（IF013140）分离出来的

CM-TAK……（羧甲基化TAK）（Euqop.J.Cancer.15，211-215，1979）

正如在表-Ⅰ中看到的，按本发明的方法，由碱性提取液得到的酸性多糖强有力的活化多形核白细胞，並证明由本发明得到的酸性多糖可具有远远超过TAK，CM-TAK的活化功能，而TAK，CM-TAK被认为是日本发展的至今最强的抗肿瘤多糖。

其次，为了提供一个抗传染药，其中由前述处理法得到酸性多糖粒剂为主要粗品，应用以下工序（1）和（2）。

（1）松子油加到2克所述酸性多糖粒中，使胶凝並做成胶囊。另一方面，（2）10克酸性多糖加到大约85mL水中，在50-60℃搅拌30分钟使溶。接着加0.7克盐和适量水至上述已溶的溶液中制成100毫升。

上述溶液在10000转/分离心机上离心20分钟，除去不溶物，在高压灭菌器灭菌，最后得到灭菌的安瓿注射剂。

其次，通过以下的试验方法观察由前述处理得到的抗传染药物的活性。

为了测定酸性多糖的抗传染药物的活性使用以下试验（1）和（2）。

（1）试验对抗大肠杆菌感染的效果：

0.25mg多糖粒剂或生理盐水溶液指定给ddy小鼠（5周的雄鼠），每组10-12只小鼠。在第二天4×10⁶大肠杆菌剂移植入上述小鼠的腹部，24小时后记录残存小鼠数。

（2）试验对抗病毒感染疾病的效果：

将上述10克感染液按指定次数注入被病毒感染的狗和猫的大腿肌肉内或脊柱肩胛骨中间部，随着时间的推移观察到一般状态和血液中白血球数目的变化。

对大肠杆菌感染小鼠的阻止活性以及抗病毒感染的猫的松弛病态，被看做抗传染药的指标，观察作用效果。结果如下：

（1）抗大肠杆菌感染的效果：

如表Ⅱ所列，如果小鼠腹部先用氨溶液提取物处理（上述提取物就是溶于生理盐水的颗粒），大肠杆菌的感染受到明显抑制。

表…Ⅱ    松子氨水提取物（粒状酸性多糖）对大肠杆菌感染的保护作用

药物    5天后小鼠存活数

松子的碱性溶液提取物

Ⅰ    7/10（70%）

Ⅱ    5/10（50%）

生理盐水做    对照    1/12（8%）

（2）抗致病病毒感染的效果：

松子外壳的氨水提取物注入猫和狗的脊柱肩胛骨附近的皮下，或者注入两者的股骨部位的肌肉内。结果，病毒性疾病（如杯状病毒性舌炎、口炎、牙炎，细小病毒性猫白细胞减少，疱疹病毒性鼻-支气管炎）都受到强烈抑制，能促进食欲、改善一般状况，其中一些可完全痊愈。相反，药物对非病毒引起的如乳癌或纤维肉瘤等疾病无效。

抗病毒的结果列于表Ⅲ

如前所述，本发明涉及由松子外壳中提取高活性的酸性多糖的方法。本发明者成功的发展了本提取物使用的有效范围。以下为本方法的技术优点。

（1）由至今被忽视的松子外壳中提取高生理活性的物质已变为可能。

（2）碱性溶液用做提取的一个方法。因此就可能无困难的重复这个方法，从而有价值的成分都能有效地被提取。

（3）用本发明提取回收的物质是一种提供了活化多形核白细胞的酸性多糖。这个酸性多糖做为一种促进多形核白细胞活性的物质是不会被取消的。多形核白细胞有防疫感染的功能。使其促活性功能用做药物是有可能的。

特别是，像前面试验所述，大肠杆菌对小鼠的感染受到抑制，猫和狗的病毒性疾病得到有效控制。

此外，做为本发明的抗感染药由天然松子外壳中提取和回收，这个抗感染药没有产生任何强烈的、其他抗病毒药已有的那种不利作用。与其他治疗方法或其他有效的治疗各种病毒性疾病的药物合并使用也是可能的。

Claims (2)

1、一种提取生理活性物质的方法，其中粒状酸性多糖是主要成分，其特征在于，将松子外壳浸泡于碱性溶液，以碱性溶液进行提取处理，不溶物质通过提取液的过滤来加以分离，通过分离处理得到的提取液在浓缩以后调解其PH度，上述提取液进行冷冻干燥，因而就提取到上述生理活性物质，其中粒状酸性多糖为主要成分。

2、一个抗传染药，其中通过权利要求1规定的方法提取得到酸性多糖是有效成分。