CN103202231A - 灰杨组培体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了灰杨组培体系的建立方法，以灰杨茎段为外植体材料，通过诱导生根，移栽等步骤，为灰杨生产走上工厂化、产业化之路提供依据。通过本发明的方法，达到了无性系建立、快速繁殖、工厂化育苗的目的。

Description

灰杨组培体系的建立方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种灰杨组培体系的建立方法。

背景技术

灰杨(Populus×canescens＝Populus tremula×P.alba)为杨柳科(Salicales)杨属(Populus)植物，是荒漠河岸林的主要组成树种。在自然条件下，前人主要通过灰杨种子和根蘖繁殖来扩大种群范围的研究报道，但迄今为止，尚未见到有关灰杨遗传转化再生体系的研究文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰杨组培体系的建立方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及灰杨组培体系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选取健壮灰杨植株，将灰杨的叶片垂直于主脉剪伤，接种于包含或组成为MS+Kinetin0.08-0.12mg/L+NAA0.2-0.4mg/L+2，4-D0.4-0.6mg/L的培养基，暗室培养，每16-24天继代一次；

(2)取约疏松、生长旺盛的愈伤组织，转入液体培养基，所述培养基为步骤(1)的培养基基础上加入25-35g/L的蔗糖，在20-30℃条件下避光振荡培养，转速为100-200r/min；继代培养前，将悬浮液用150-250目钢网过滤，除去大量损伤细胞的残存碎片，再转入新鲜培养基，继续悬浮培养，继代3～4从而建立体系；

(3)从继代培养的组培苗中选取健壮、生长整齐的组培苗，剪成1.5-2.5cm左右的茎尖茎段，植入生根培养基中，所述生根培养基为包含或组成为1/2MS+AgNO₃3-5mg/L+NAA0.04-0.06mg/L的培养基；

(4)选择生长旺盛、根系发达的健壮组培苗，将瓶口的包扎物逐渐打开，使组培苗逐步适应外界环境，由开小口到完全敞开约需6-10天，在开瓶口后加入少量的水，使用玻璃罩扣住在阳光下驯化6-8天后移栽到花盆，移栽前把附着于幼苗根部的培养基冲洗干净，任选地，使用一定浓度的多菌灵溶液泡洗；移栽到花盆后仍然用玻璃罩扣养，逐步揭开玻璃罩，直到苗木在花盆中发芽生长再移入大田；灰杨组培苗移栽时，幼苗期空气相对湿度控制在80％以上，温度为18～25℃，以及适宜的光照强度。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤(1)的培养基为MS+Kinetin0.1mg/L+NAA0.3mg/L+2，4-D0.5mg/L。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的步骤(2)的培养基为1/2MS+AgNO₃4mg/L+NAA0.05mg/L。

本发明的方法达到了无性系建立、快速繁殖、工厂化育苗的目的，不仅为灰杨的工厂化繁殖和未来转基因研究提供了技术基础，且证明灰杨的非分生组织细胞也具有全能性。

具体实施方式

实施例1：

(1)选取健壮灰杨植株，将灰杨的叶片垂直于主脉剪伤，接种于多种脱分化培养基上，摸索最优良的配方(见表1)，暗室培养，每20天继代一次。

表1灰杨愈伤组织诱导所用培养基(mg/L)

灰杨在4～9号培养基上诱导的愈伤组织为浅褐色，水浸状，生长慢，再生能力差，容易死亡；1、2、3号培养基上诱导的愈伤组织为淡黄色，生长快，质地疏松，3号培养基上诱导的愈伤组织在培养25～28天后开始褐化，但是1、2号愈伤组织比3号更快褐化和停止生长，在培养18天后就开始褐化。因此MS+Kinetin0.1mg/L+NAA0.3mg/L+2，4-D0.5mg/L是灰杨的最佳培养基。

(2)取约3g疏松、生长旺盛的愈伤组织，转入约50mL液体培养基中，在约25℃条件下避光振荡培养，转速为150r/min。继代培养前，将悬浮液用200目钢网过滤，除去大量损伤细胞的残存碎片，再转入新鲜培养基，继续悬浮培养。

表2灰杨悬浮培养所用液体培养基(mg/L)

悬浮培养初期，3～4天继代一次，瓶壁上有残留物，为非胚性愈伤及细胞碎片。一周左右，悬浮物中逐渐有大量细胞散出。两周左右，散出的细胞聚集，形成小块的新鲜愈伤。但此时细胞大小不一，形状各异，随着培养时间的延长，圆形细胞逐渐增多，细胞内含物越来越丰富。有的悬浮系在悬浮过程中一直未增殖，两周之后开始褐化，不适合悬浮，弃掉。悬浮培养液逐渐变清，瓶壁上残留物减少，每两周继代一次，继代3～4，体系建立。培养物颜色淡黄、大小均一、增殖快。

(3)从继代培养的组培苗中选取健壮、生长整齐的组培苗，剪成2cm左右的茎尖茎段，植入生根培养基中。为筛选最佳生根培养基，本发明采用了4种供试生根培养基(见表3)。

表3 灰杨诱导生根所用培养基(mg/L)

R1号培养基中的组培苗生长一个月时仍无任何生根迹象；R2号培养基中的组培苗一周时没有生根，两周时生根率1/4，3周时生根率3/4，但根系不发达；R3号培养基中的组培苗1周时生根率1/3，3周时生根率达100％，且根系发达，侧根少，组培苗生长快速；R4号培养基中的组培苗1周时生根率1/10，3周时生根率3/10，根系粗壮，但侧根少，下部幼叶枯黑。因此1/2MS+AgNO₃4mg/L+NAA0.05mg/L是诱导灰杨组培苗生根理想的培养基。

(4)选择生长旺盛、根系发达的健壮组培苗，将瓶口的包扎物逐渐打开，使组培苗逐步适应外界环境，由开小口到完全敞开约需8天，即开瓶口后立即加入少量的水，玻璃罩扣住在阳光下驯化一周左右后移栽到花盆，移栽前须把附着于幼苗根部的培养基冲洗干净，可用一定浓度的多菌灵溶液泡洗，以免病菌繁殖污染，导致幼苗腐烂死亡。移栽到花盆后仍然用玻璃罩扣养，逐步揭开玻璃罩，直到苗木在花盆中发芽生长再移入大田。移植后的幼苗，温、湿度的调控十分重要。生长在高湿度培养瓶内的组培苗，一旦移植田间或温室内，空气相对湿度降低，小苗容易干枯，需控制湿度。温度高，空气相对湿度大，但是，高温、高湿，易滋生病菌，导致烂苗。调节适宜的温度、湿度，是提高成活率的一个重要前提。灰杨组培苗移栽时，幼苗期空气相对湿度一直控制在80％以上，温度为18～25℃，以及适宜的光照强度，移栽成活，在大田中长势良好，具体统计数据如表4-6所示。

表4：灰杨株高和茎粗统计数据

表5：灰杨植株的成活率统计数据

表6：灰杨根茎叶的生长速率统计数据

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.灰杨组培体系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选取健壮灰杨植株，将灰杨的叶片垂直于主脉剪伤，接种于包含或组成为MS+Kinetin0.08-0.12mg/L+NAA0.2-0.4mg/L+2，4-D0.4-0.6mg/L的培养基，暗室培养，每16-24天继代一次；

(2)取疏松、生长旺盛的愈伤组织，转入液体培养基，所述培养基为步骤(1)的培养基基础上加入25-35g/L的蔗糖，在20-30℃条件下避光振荡培养，转速为100-200r/min；继代培养前，将悬浮液用150-250目钢网过滤，除去大量损伤细胞的残存碎片，再转入新鲜培养基，继续悬浮培养，继代3～4从而建立体系；

(3)从继代培养的组培苗中选取健壮、生长整齐的组培苗，剪成1.5-2.5cm左右的茎尖茎段，植入生根培养基中，所述生根培养基为包含或组成为1/2MS+AgNO₃3-5mg/L+NAA0.04-0.06mg/L的培养基；

(4)选择生长旺盛、根系发达的健壮组培苗，将瓶口的包扎物逐渐打开，使组培苗逐步适应外界环境，由开小口到完全敞开约需6-10天，在开瓶口后加入少量的水，使用玻璃罩扣住在阳光下驯化6-8天后移栽到花盆，移栽前把附着于幼苗根部的培养基冲洗干净；任选地，在移栽到花盆之前使用一定浓度的多菌灵溶液泡洗；移栽到花盆后仍然用玻璃罩扣养，逐步揭开玻璃罩，直到苗木在花盆中发芽生长再移入大田；灰杨组培苗移栽时，幼苗期空气相对湿度控制在80％以上，温度为18～25℃，以及适宜的光照强度。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(1)的培养基为MS+Kinetin0.1mg/L+NAA0.3mg/L+2，4-D0.5mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(2)的培养基为1/2MS+AgNO₃4mg/L+NAA0.05mg/L。