CN103193642B - 香芹酚衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结构式（I）所示的一类防治心脑血管疾病的香芹酚衍生物。相对于原有药物而言，具有增加脂溶性，改变吸收性能，增加稳定性，提高药效，降低毒副作用等特点。

Description

香芹酚衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及香芹酚衍生物及其合成方法，属于医药技术领域，该化合物可用于防治心脑血管疾病。

背景技术

世界卫生组织调查显示：心脑血管疾病已经成为影响人类健康的头号杀手，是死亡率最高的疾病，研究开发此类疾病的保护性药物具有重要的临床意义。

香芹酚（图1）是一种天然植物提取物，来源于唇形科牛至属和百里香属植物中。研究显示，香芹酚作为食品添加剂具有杀菌及杀虫活性；在医药领域中，香芹酚具有抗肿瘤活性、抗抑郁症活性，对脂多糖诱导的炎症反应和自身免疫性疾病都具有防治作用，在缺血/再灌注过程中具有明显的保护作用，香芹酚还具有抗抑郁和抗焦虑的作用。香芹酚潜在的脑保护作用可能是由于它分子量小（150克/摩尔），亲脂性好，容易迅速透过血脑屏障。

丹参在我国用于中风的治疗历史悠久。丹参素（图1）为中药丹参的水溶性成分，是丹参主要活性成分之一。大量国内外文献报道其对心肌和脑组织均具有保护作用。在临床上广泛应用于治疗心脑血管病。但是，丹参素结构中含有的酚羟基，容易氧化变质；羟基和羧基易于葡萄糖醛酸等键合随尿液排出体外半衰期短，难以维持有效血药浓度，限制了临床的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型的香芹酚衍生物。

本发明的另一目的是提供上述香芹酚衍生物的合成方法。

本发明还有一个目的是提供上述香芹酚衍生物在防治心脑血管疾病中的应用。

本发明实现过程如下：

结构通式（I）所示的化合物， 

。

结构通式（I）所示化合物的合成方法1

。

结构通式（I）所示化合物的合成方法2

。

结构通式（I）所示化合物的合成方法3

。

结构通式（I）所示化合物的合成方法4

。

以上酯化过程均可采用DMAP，缩合剂存在下酯化方法，或者先制酰卤再在碱存在下脱卤化氢进行酯化。缩合剂为1,3-二环己基碳二亚胺（DCC），1,3-二异丙基碳二亚胺（DIC）或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)。

本发明研究了所述结构通式（I）所示化合物对心脑损伤的保护作用，结果发现，结构通式（I）所示化合物的活性不劣于临床使用的丹红注射液及依达拉奉注射液。

结构通式（I）所示化合物可制成药物组合物，包括有效量的结构式（I）所示化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，该组合物是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂或乳剂。

本发明的化合物可用于制备用于预防或治疗心脑血管疾病及其并发症，包括心律失常、心室纤维化、心肌梗死、冠心病、心绞痛、心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌缺血、心肌缺血/再灌注、恶病质、心肌炎、动脉粥样硬化、外周组织器官或四肢缺血、休克、缺血或再灌注引起的组织器官急慢性损伤、失调或间接后遗症，还包括脑中风、创伤、癫痫、帕金森症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、阿耳茨海默病、缺氧缺血脑损伤、痴呆、多发性硬化症、外周或中枢神经系统缺血症状、中风的缺血症状、慢性痛类脑疾病。

本发明公开了一类能有效防治心脑血管疾病的香芹酚衍生物, 相对于原有药物而言，具有增加脂溶性，改变吸收性能，增加稳定性，提高药效，降低毒副作用等特点。

附图说明

图1为香芹酚和丹参素的结构图；

图2 对MI/R损伤大鼠心肌梗死面积的影响（, n=10）

注：Sham：假手术组；MI/R：心肌缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；DHI：丹红注射液。# P < 0.05与Sham组相比; * P < 0.05, ** P < 0.01与MI/R组相比；

图3 心肌细胞不同处理后体外存活率的测定（, n=5）

注：Control：对照组；SI/R：模拟缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；DHI：丹红注射液。## P < 0.01与Control组相比; ** P < 0.01与SI/R组相比；

图4 心肌细胞不同处理后细胞上清LDH的测定（, n=5）

注：Control：对照组；SI/R：模拟缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；DHI：丹红注射液。## P < 0.01 与Control组相比; * P < 0.05, ** P < 0.01与SI/R组相比；

图5 大鼠CI/R模型再灌注24h后各组神经功能学评分（n=8）

注：Sham：假手术组；CI/R：脑缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；Eda：依达拉奉注射液。# P < 0.05与Sham组相比;* P < 0.05与CI/R组相比；

图 6 再灌注24h后各组脑梗死面积比较（, n=8）

注：Sham：假手术组；CI/R：脑缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；Eda：依达拉奉注射液。# P < 0.05与Sham组相比; * P < 0.05, ** P < 0.01与CI/R组相比；

图7 大鼠MI/R 3h血清中NSE活性（, n=8）

注：Sham：假手术组；CI/R：脑缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；Eda：依达拉奉注射液。# P < 0.05与Sham组相比, * P < 0.05, ** P < 0.01与CI/R组相比；

图8 神经元细胞不同处理后体外存活率的测定（, n=5）

注：Control：对照组；SI/R：模拟缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；Eda：依达拉奉注射液。## P < 0.01与Control组相比; * P < 0.05, ** P < 0.01与SI/R组相比；

图9 神经元细胞不同处理后细胞上清LDH的测定（, n=5）

注：Control：对照组；SI/R：模拟缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；Eda：依达拉奉注射液。## P < 0.01与Control组相比; * P < 0.05, ** P < 0.01与SI/R组相比。

具体实施方式

下面的实施例用来对本发明的内容和实施作进一步的说明，但不应当解释为对本发明范围进行任何限制。以下进行实施例说明。

实施例1：化合物1的合成（采取方法1）

在氮气保护下将丹参素钠6.6 g和Ac₂O 30 ml加入到250ml的单烧瓶中，冰浴下搅拌30 min，滴加入1.5 ml的HClO₄，室温搅拌5 h，反应结束后，将反应液倾入碎冰中，用乙酸乙酯40 ml萃取，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥。柱层析纯化，得乙酰化丹参素。白色粉末状固体8.26 g，产率85.0%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=323.20。在单口瓶中加入乙酰化丹参素 6.4 g,  20 ml 新蒸SOCl₂, 回流10 h。蒸出过剩的SOCl₂。向反应瓶中内加入20 ml 无水CH₂Cl₂, 搅拌30 min, 将溶液冷却至0℃，缓慢滴加香芹酚5.0 ml, 回流10 h。反应液冷却至室温，过滤得粗产物。 柱层析纯化，得白色至无色透明蜡状物。真空干燥后成白色粉末4.68 g，产率52%。¹HNMR(DMSO-d₆, 500MHz): δ7.44-6.91(m,6H), δ5.16(t,1H), δ2.94-3.20(M,2H), δ2.90(m,1H), δ2.23(S,9H), δ2.21(s,3H), δ1.22(d,6H). MS (ESI): [M+H]⁺m/z=457.19。

实施例2：化合物2的合成（采取方法2）

在单口瓶中加入丹参素钠6.6 g和香芹酚5.0 ml溶于20 ml 无水CH₂Cl₂, 搅拌30 min, 将溶液冷却至0℃，反应液冷却至室温，加入DCC 和催化量DMAP，0℃ 搅拌15 min, 待反应结束时，加入二氯甲烷稀释，抽滤，柱层析纯化得白色至无色透明蜡状物。真空干燥后成白色粉末6.34 g，产率64%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=509.20。在氮气保护下将丹参素香芹酚酯3.3 g、苯甲酸10 ml、EDC盐酸盐1.2 g、催化剂量的DMAP、20 ml二氯甲烷加入到250 ml的单口烧瓶中，室温搅拌4 h，反应结束后，加水50 ml搅拌，分液、水洗有机相两次，有机相去除溶剂后快速柱层析得化合物。为白色粉末状化合物固体4.6 g，产率73%。¹HNMR：δ8.23-6.91 (m,21H), δ5.18(t,1H), δ3.10-3.38(M,2H), δ2.89(m,1H), δ2.20(s,3H), δ1.22(d,6H). MS (ESI): [M+H]⁺m/z=643.33。

实施例3：化合物3的合成（采取方法3）

取丹参素钠6.6 g，加入10 ml 丙酮溶解，此后向其中加入适量K₂CO₃, 室温搅拌，然后向反应体系加入苄溴10 ml，65℃回流反应24小时，待反应结束后用乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄ 干燥。柱层析纯化，得邻二酚墙基及羧基保护的丹参素7.4 g，产率52.6%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=467.09。 取上一步化合物5.0 g，向其中加入干燥10 ml THF溶解，加入10% DMAP 0.5 g，室温下搅拌，缓慢加入乙酰水杨酸。反应过夜后，由乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄干燥，得粗产物。柱层析纯化，得目标化合物5.2 g，产率77.3%。MS (ESI): [M+H]⁺m/z=631.41。向单口瓶中加入上一步化合物3.0 g，用乙醇溶解，向其中加入钯碳0.3 g，小心通入氢气，室温反应4小时，反应结束后。用乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄干燥，柱层析纯化，得到乙酰水杨酸取代的丹参素1.45 g, 产率84.8%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=459.19。在氮气保护下将乙酰水杨酸取代的丹参素1.0 g和Ac₂O 15 ml加入到250ml的单烧瓶中，冰浴下搅拌30 min，滴加入0.5 ml的HClO₄，室温搅拌5 h，反应结束后，将反应液倾入碎冰中，用乙酸乙酯20 ml萃取，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥。柱层析纯化得粉末状固体0.98 g，产率79.7%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=443.19。 在单口瓶中加入上步产物0.9 g和无水CH₂Cl₂ 10 ml，搅拌30 min, 将溶液冷却至0℃，缓慢滴加香芹酚1.0 ml, 回流10 h。反应液冷却至室温，过滤，柱层析纯化。真空干燥后成白色粉末0.61 g，产率52.1%。¹HNMR：δ7.98-6.95 (m,10H), δ5.17(t,1H), δ3.12-3.41(M,2H), δ2.92(m,1H), δ2.26(S,9H), δ2.17(s,3H), δ1.23(d,6H). MS (ESI): [M+H]⁺m/z=577.47。

实施例4：化合物4的合成（采取方法4）

取丹参素钠6.6 g，加入10 ml 丙酮溶解，此后向其中加入K₂CO₃, 室温搅拌，然后向反应体系加入苄溴10 ml，65℃回流反应24小时，待反应结束后。用乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄ 干燥。柱层析纯化，得邻二酚墙基及羧基保护的丹参素7.4 g，产率52.6%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=467.09。 取上一步化合物5.0 g，向其中加入干燥10 ml THF溶解，加入10% DMAP 0.5 g，室温下搅拌，缓慢加入乙酰水杨酸。反应过夜，由乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄干燥。柱层析纯化，得目标化合物5.2 g，产率77.3%。MS (ESI): [M+H]⁺m/z=631.41。向单口瓶中加入上一步化合物3.0 g，用乙醇溶解，向其中加入钯碳0.3 g，小心通入氢气，室温反应4小时，反应结束后。用乙酸乙酯萃取，Na₂SO₄干燥，柱层析纯化，得到乙酰水杨酸取代的丹参素1.45 g, 产率84.8%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=459.19。在单口瓶中将乙酰水杨酸取代的丹参素1.0 g和 香芹酚1.0 ml溶于20 ml 无水CH₂Cl₂, 搅拌30 min, 加入DCC 和催化量DMAP, 待反应结束时，加入10 min 二氯甲烷稀释，抽滤，快速柱层析得白色至无色透明蜡状物。真空干燥后成白色粉末0.84 g，产率61.4%。MS (ESI): [M-H]⁺m/z=491.32。在氮气保护下将丹参素香芹酚酯0.80 g、苯甲酸10 ml、EDC盐酸盐1.2 g、催化剂量的DMAP、15 ml二氯甲烷加入到单口烧瓶中，室温搅拌4 h，反应结束后，加水50 ml搅拌，分液、水洗有机相两次，有机相去除溶剂后柱层析。得白色粉末状化合物固体0.85 g，产率74.7%。¹HNMR：δ8.25-6.97 (m,20H), δ5.17(t,1H), δ3.11-3.39(M,2H), δ2.88(m,1H), δ2.26(S,3H), δ2.18(s,3H), δ1.21(d,6H). MS (ESI): [M+H]⁺m/z=701.49。

实施例5：乙酰丹参素(Ac-DS）及乙酰化丹参素香芹酚酯(Ac-DSCAR)对大鼠心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的保护作用

(1)   试验材料

 实验动物

雄性健康SD大鼠60只，质量250-270 g，购自第四军医大学动物中心。动物分笼饲养（环境温度24℃，湿度60%-70%），术前1 h禁食，自由饮水。

 主要药品与试剂

肌酸激酶同工酶（CK-MB）（上海西唐生物科技有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）和考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝（TTC）染色剂（中国医药集团上海化学试剂公司）；伊文思蓝（EB）（美国Sigma-Aldrich公司）。

主要仪器  

HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；BL-420S 多道生理记录仪（成都泰盟科技有限公司）；5417型低温高速离心机（Eppendorf公司）；COOLPIX S1型照相机（Nikon公司，日本）；680型酶标仪（BIO-RAD公司）。

(2)   实验方案及结果

 大鼠MI/R损伤模型的制备

将60只大鼠随机分为6组：假手术组（Sham）, 模型组（MI/R）,香芹酚组（CAR，30 mg/kg），乙酰丹参素组(Ac-DS，30 mg/kg)，乙酰丹参素香芹酚酯组（Ac-DSCAR, 30 mg/kg），丹红阳性对照组 (DHI，浓缩后8 ml/kg)。各组进行MI/R模型制备后（Sham组大鼠除了不结扎冠状动脉前降支血管，其他手术操作与模型制备组相同），于再灌注即刻分别注射生理盐水或相应剂量的药物(剂量根据药品说明书和新药的药效曲线确定)。 大鼠称重后，2 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠，仰卧位固定，连接心电图监测，气管插管并接呼吸机（频率：75次/min；潮气量：8-9 mL；吸：呼=1:2），胸骨左缘旁纵行切开第3-5肋间做横行切口，剪开并挑起心包，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状动脉前降支(Left anterior descending coronary aery，LAD)为标志，于左心耳下方1-2 mm处进针、穿线（横跨左冠状动脉前降支），将一小硅胶管从丝线两端穿入，稳定10 min后结扎，缺血30 min后，再灌注3 h结束。成功标准：结扎LAD后心电图II导联ST段出现弓背向上抬高，T波高耸等为缺血成功；放松结扎线后，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功。

 心肌梗死面积测定

再灌注3 h后，再次结扎各组大鼠左冠状动脉前降支，从颈动脉迅速注入3% EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮肤蓝染后迅速摘除心脏，滤纸吸除心室腔中残余染液，-20℃冻至变硬。取出后自心尖向心底平行房室沟方向将其切成相等厚度的5片，2% TTC溶液（pH = 7.4）37℃孵育10 min，4%多聚甲醛固定过夜。染色后白色代表梗死区（area of necrosis，AN），红色代表缺血但未梗死区，蓝色代表正常区，危险区（area at risk，AAR）为红色和白色面积之和。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。梗死程度采用梗死区面积（AN）与危险区面积（AAR）的比值表示。大鼠缺血30 min再灌注3 h后，模型组动物心肌出现明显的梗死，梗死区面积与危险区面积的比为（42.1 ± 5.5）%。与sham组比较，模型组动物心肌梗死面积显著增加（P＜0.05），提示MI/R损伤模型制作成功。与模型组相比较，Ac-DS和Ac-DSCAR治疗后能明显降低大鼠MI/R损伤后心肌梗死面积（P＜0.05），且与阳性对照药的治疗效果相当（P＞0.05），见图 2。

 血清生化指标测定

再灌注3 h后，腹主动脉取血，离心（4000 r/min）12 min，分离血清，试剂盒检测CK-MB和LDH的活性，按照说明书操作。与假手术组相比，模型组大鼠血清CK-MB和LDH水平明显增加（P＜0.05）。Ac-DS治疗组大鼠血清CK-MB和LDH水平明显下降，与模型组相比有统计学差异（P＜0.05），见表1。

注：Sham：假手术组；MI/R：心肌缺血/再灌注组；CAR：香芹酚；Ac-DS：乙酰丹参素；Ac-DSCAR：乙酰丹参素香芹酚酯；DHI：丹红注射液。^#  P < 0.05与Sham组相比, ^*  P < 0.05与MI/R组相比。

实施例6：Ac-DS及Ac-DSCAR对大鼠原代心肌细胞模拟缺血/再灌注(SI/R)损伤的保护作用

(1)   试验材料

 实验动物

新生 SD 大鼠，雌雄不拘，1-2 天，由第四军医大学实验动物中心提供。

 主要药品与试剂

乳酸脱氢酶（LDH）定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM培养基（美国Gibco公司）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、胰蛋白酶、小牛血清（美国Sigma-Aldrich公司）。

主要仪器

超净工作台（苏州净化设备公司）；倒置显微镜（Olympus, Japan）；细胞培养孵箱（Hera, USA）；5417型低温高速离心机（Eppendorf公司）；C680型酶标仪（BIO-RAD公司）。

(2)   实验方案及结果

①心肌细胞的原代培养

取出生1-2天SD乳鼠用于实验，消毒后移入超净工作台。沿胸骨左缘剪开胸壁取出心脏，用灭菌的PBS洗涤去除残留的血液后放入培养皿中。剪碎心肌组织，加入0.125%胰蛋白酶消化液，37℃水浴消化5 min，弃上清，再加入消化液，重复上述操作5次。加入含血清的DMEM培养基终止消化，离心后弃上清，加入含10%小牛血清的DMEM培养基重悬，混合均匀后将细胞种入培养板中，差速贴壁法纯化心肌细胞，加入适量BrdU，使其终浓度为0.01 mM，37℃ CO₂培养箱中培养。24 h后换培养基。

心肌细胞SI/R模型建立

实验前24 h将培养基更换成无血清的DMEM培养基，快速换入经95% N₂-5% CO₂混合气饱和的低糖无血清DMEM培养基，并迅速移入该混合气充分平衡的缺氧装置中，2 h后放入常规培养箱中孵育24 h，造成心肌细胞缺氧/复氧损伤。实验共分为6组：空白对照组（Control），模拟缺血/再灌注组（SI/R），香芹酚组（CAR），乙酰丹参素组（Ac-DS）、乙酰丹参素香芹酚酯组（Ac-DSCAR）和丹红注射液阳性对照组（DHI）。

心肌细胞存活率测定

原代心肌细胞再灌注结束后，各组分别加入20 μL 5 mg/ml的MTT，孵育4 h，弃去培养液，再各自加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），待结晶充分溶解后用酶标仪于490 nm处检测。结果如图3所示，经模拟缺血再灌注损伤处理后，心肌细胞存活率显著降低(P < 0.01)，给予Ac-DS和Ac-DSCAR 10 μM后，能明显增强心肌细胞的存活率(P < 0.01)，效果与阳性对照药2%的DHI相当(P > 0.05）。

心肌细胞上清LDH释放量测定

原代心肌细胞再灌注结束后，各组细胞取上清培养液，严格按照试剂盒的说明书操作检测细胞上清LDH的活性，结果如图4所示，经缺血再灌注损伤处理后，心肌细胞LDH释放量显著增加(P < 0.01)，给予Ac-DS和Ac-DSCAR 10 μM后，能明显降低细胞上清LDH的含量(P < 0.05, P < 0.01)，效果与阳性对照药2%的DHI相当(P > 0.05）。

实施例 7：Ac-DS及Ac-DSCAR对大鼠脑缺血再灌注(CI/R)损伤的保护作用

(1)     试验材料

SD雄性大鼠48只，质量280 ± 20 g，由第四军医大学实验动物中心提供；阳性药：依达拉奉（Eda），规格30 mg/20ml。昆明积大制药有限公司提供，批号：H20080466。神经元特异性烯醇酶（NSE）试剂盒为上海江莱生物科技有限公司提供。

(2)     试验方案及结果

①大鼠CI/R损伤模型的制备 

将大鼠随机分为6组：假手术组（Sham）; 模型组(CI/R);  香芹酚组（CAR，30 mg/kg）；乙酰丹参素组 (Ac-DS, 30 mg/kg); 乙酰丹参素香芹酚酯（Ac-DSCAR, 30 mg/kg）；依达拉奉阳性对照组 (Eda，3 mg/kg)，每组8只大鼠。各给药组均于再灌注即刻给药（尾静脉注射），剂量根据药品说明书和新药的药效曲线确定。

动物术前禁食12 h，自由饮水。参考Longa等所报道的方法，采用经颈内动脉尼龙线线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性脑缺血再灌注模型：3％戊巴比妥钠(30 mg/kg，腹腔注射)麻醉动物，仰卧位固定，于颈正中位切口，暴露颈右侧总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及翼腭动脉，在颈总动脉分叉处下方剪一纵形小切口，将一根预先用酒精灯将两端烧成圆头的尼龙线（3-0，美国）置入颈内动脉内约17~18 mm，直到有轻微阻力感为止。阻闭血流2 h后小心抽出线栓，即形成再灌注。Sham组只是不插入尼龙线，其余步骤同手术组。在缺血期间及再灌注后2 h保持体温在(37 ± 0.5)℃。模型成功标志为以大鼠术后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。 

 神经功能学评分

将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。脑缺血再灌注24 h后，按Longa评分法随机评估并记录各组动物神经功能缺损评分：0分为无功能障碍；1分为不能伸展左侧前肢；2分为向左侧旋转；3分为向左侧倾倒；4分为无自主活动伴意识障碍；分数越高，表示动物神经功能损伤越大。

从行为学方面评价脑损伤的严重程度是评价抗脑缺血再灌注损伤的关键药效指标之一。再灌注24 h结束后，对各组大鼠分别评分，结果如图5，结果显示，与CI/R组相比Ac-DS及Ac-DSCAR治疗能够显著改善神经功能（P < 0.05，n = 8），其效果与阳性对照药Eda相当（P > 0.05，n = 8）。

 脑梗死面积测定

再灌注结束后断头处死大鼠，剪开颅骨取出大脑用4℃的生理盐水冲洗干净。使用脑切片模具切成2 mm厚的冠状切片，置于2%的 TTC染色剂中37℃孵育约5-10 min，待显色完全后置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，然后拍照并用图片分析软件（photoshop）计算脑梗死面积，其中脑切片红色区域为正常组织，白色区域为梗死区。 

脑梗死面积是评价药物脑保护作用的最直接指标。实验结果如图6所示：经Ac-DS, Ac-DSCAR治疗后，大鼠脑梗死面积较CI/R组显著减小（24 ± 6 %, 25 ± 4 % vs44 ± 5 %, n = 8, P < 0.05）。与阳性药Eda效果相当（25 ± 5 %，n = 8, P > 0.05）。

 血清中神经元特异性烯醇化酶（NSE）的测定

各组8只再灌注结束后腹主动脉取血2 ml，血液于4000转低速离心15 min，取血清，严格按照试剂盒说明书操作检测NSE的活性。

神经元特异性烯醇化酶(NSE)大量存在于脑组织神经元细胞和神经内分泌细胞中,脑梗死时脑组织受损,NSE由神经元细胞中漏出进入脑脊液和血液,由于其在正常情况下外周血中仅有微量,因此脑脊液和血液中NSE水平可作为脑组织中神经元坏死的客观指标,判断脑梗死面积大小、评价治疗效果和估测预后的手段。为进一步验证Ac-DS和Ac-DSCAR脑保护药效，我们还检测了大鼠再灌24 h后血清中NSE的水平。结果显示，CI/R组血清中NSE活性较Sham组明显增加（n = 8, P < 0.01），与CI/R组比，Ac-DS、 Ac-DSCAR治疗组血清中NSE活性明显降低，与Eda治疗组相比无显著差异（n = 8, P < 0.01）。不同处理组大血清中NSE活性见图7。

实施例8：Ac-DS及Ac-DSCAR对大鼠原代神经元细胞SI/R损伤的保护作用

(1)   试验材料

 实验动物

清洁级怀孕14-15天的 SD 大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供。

 主要药品与试剂  

乳酸脱氢酶（LDH）定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM培养基（美国Gibco公司）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、胰蛋白酶、小牛血清（美国Sigma-Aldrich公司）。

主要仪器  

超净工作台（苏州净化设备公司）；倒置显微镜（Olympus, Japan）；细胞培养孵箱（Hera, USA）；5417型低温高速离心机（Eppendorf公司）；C680型酶标仪（BIO-RAD公司）。

(2)   实验方案及结果

①神经元的原代培养

用多聚赖氨酸（PLL）预先包被24孔板，37℃孵育1 h，回收PLL后晾干，再用无菌去离子水洗，再晾干；取怀孕14-15天的SD大鼠腹腔注射10%乌拉坦麻醉；75%乙醇对孕鼠腹部进行消毒，剪开腹腔，将胎鼠取出，放入预冷的分离液中；从耳后剪下胎鼠头颅，放入预冷的分离液中，左手用精细镊从其双眼插入固定，右手持另一精细镊撕去头皮与颅骨，暴露出大脑，将大脑全部取出，放入预冷的分离液中；在解剖显微镜下用精细镊小心剥去脑膜、四叠体、髓质等，将大脑皮层转移到预冷的eppendorf管中；加入胰酶500 μl，于37℃消化10 min，每5 min吹打一次；加入200 μl FBS终止消化，然后继续吹打重悬；加入3 ml 10% media，吹打，然后用strainer (40 μm)过滤到离心管中；离心弃上清，加入2 ml 10% media＋B27(50×) 40 μl，吹打重悬；计数后以2.5×10⁵个/孔的密度种入预先包被了PLL的24孔板中；2 h后，将培养基换成culture medium，37℃ 5% CO₂培养箱中培养，此时贴壁的为纯度较高的神经元。

神经元SI/R模型建立

方法同心肌细胞SI/R模型的建立。

实验共分为6组：空白对照组（Control），模拟缺血/再灌注组（SI/R），香芹酚组（CAR），乙酰丹参素组（Ac-DS）、乙酰丹参素香芹酚酯组（Ac-DSCAR）和依达拉奉阳性对照组（Eda）。

神经元细胞存活率测定：

　原代神经元细胞再灌注结束后，各组分别加入20 μL 5 mg/ml的MTT，孵育4 h，弃去培养液，再各自加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），待结晶充分溶解后用酶标仪于490 nm处检测。结果如图8所示，经模拟缺血再灌注损伤处理后，神经元细胞存活率显著降低(P < 0.01)，给予Ac-DS和Ac-DSCAR 10 μＭ后，能明显增强神经元细胞的存活率(P < 0.01)，效果与阳性对照药5%的Eda相当(P > 0.05）。

神经元细胞上清LDH释放量测定

　原代神经元细胞再灌注结束后，各组细胞取上清培养液，严格按照试剂盒的说明书操作检测细胞上清LDH的活性，结果如图9所示，经缺血再灌注损伤处理后，神经元细胞LDH释放量显著增加(P < 0.01)，给予Ac-DS和Ac-DSCAR 10 μＭ后，能明显降低细胞上清LDH的含量(P < 0.01)，效果与阳性对照药5%的Eda相当(P > 0.05）。

在取得上述研究结果的基础上，发明人继续开展了化合物2-4的实施例5-8的相关实验，得到与乙酰丹参素香芹酚酯相同的研究结果。表明结构式（I）所示化合物可有效防治心脑血管疾病, 相对于原有药物而言，具有增加脂溶性，改变吸收性能，增加稳定性，提高药效，降低毒副作用等效果。

Claims (10)

1.结构通式（I）所示的化合物， 

。

2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

3.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

4.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

5.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

6.根据权利要求2-5任意之一所述的合成方法，其特征在于：酯化反应采用DMAP催化剂，选用缩合剂1,3-二环己基碳二亚胺、1,3-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

7.权利要求1所述化合物在制备预防和治疗心、脑血管疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述心、脑血管疾病为心律失常、心室纤维化、心肌梗死、冠心病、心绞痛、心力衰竭、心肌缺血、心肌缺血/再灌注、恶病质、心肌炎、动脉粥样硬化、外周组织器官或四肢缺血、休克、缺血或再灌注引起的组织器官急慢性损伤、失调或间接后遗症。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述心、脑血管疾病为脑中风、创伤、癫痫、帕金森症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、阿耳茨海默病、缺氧缺血脑损伤、痴呆、多发性硬化症、外周或中枢神经系统缺血症状、中风的缺血症状或慢性痛类脑疾病。

10.组合物，包括有效量的权利要求1中结构式（I）所示化合物和药学上可接受的载体或者赋形剂。