CN107184563A - 大黄素甲醚及其衍生物的微囊、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及大黄素甲醚及其衍生物的微囊、其制备方法和用途。本发明提供一种肠溶制剂，包含作为活性成分的大黄素甲醚或其衍生物，和作为囊材的海藻酸钠‑壳聚糖。本发明制备的大黄素甲醚及其衍生物肠溶制剂，避免了常规口服制剂在通过胃部时，被胃酸水解灭活，同时利用缓释作用，提高了生物利用度，有利于发挥大黄素甲醚及其衍生物的抗肿瘤作用。在制备肠溶制剂的过程中，优化了制备工艺，得出简单易行、安全环保的制备方法，按优化条件制备的多批大黄素甲醚及其衍生物肠溶制剂自然干燥后呈白色颗粒，球形圆整，大小均匀，分散良好，粒径、载药量、包封率均保持稳定，适于在大规模工业化生产中应用。

Description

大黄素甲醚及其衍生物的微囊、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及大黄素甲醚及其衍生物的微囊、其制备方法和用途。

背景技术

中药大黄为蓼科植物药用大黄(Rheum offcinale Baill)、掌叶大黄(Rheumpalmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf)的干燥根和根茎。大黄性寒、味苦，具泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的作用。大黄还可以用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿；、外治烧烫伤等。酒大黄善清上焦血分热毒，熟大黄泻下力缓泻火解毒，大黄炭凉血化瘀止血。

通过现代分离及分析手段，人们发现大黄药理活性的主要成分为蒽醌类衍生物，包括芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚及大黄酸等，其中大黄素甲醚是大黄中的主要有效成分之一。大黄素甲醚别名朱砂莲乙素、非斯酮、1,8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式是C₁₆H₁₂O₅，为金黄色针状结晶，熔点为203℃～207℃，几乎不溶于水，微溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚、丙酮、冰醋酸、氢氧化钠及热碳酸钠溶液，极微溶于石油醚。

大黄素甲醚结构式

大黄素甲醚的药理学活性已引起学者们的广泛关注。据报道，大黄素甲醚能使模型组血清ALT、AST及TNF水平下降，病理组织改变有所减轻，从而起到对大鼠急性肝损伤的保护作用。另有研究表明大黄素甲醚可减轻脑缺血再灌注损伤。此外，大黄素甲醚还对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌和痢疾杆菌等多种细菌均有抑制作用。

大黄素甲醚口服时的生物利用度低，药物吸收差，为此在临床应用上具有一定的局限性。因此，亟需开发患者依从性好、性能稳定且药物特性得以保持的大黄素甲醚药物剂型，从而有利于发挥该药物的疗效，改善治疗效果，并达到降低毒副作用的效果。

发明内容

为改善现有技术中存在的问题，本发明提供一种肠溶制剂，包含作为活性成分的式I所示的大黄素甲醚或其衍生物，和药学上可接受的辅料；

优选地，所述肠溶制剂选自肠溶微囊、肠溶片或肠溶胶囊；

其中，所述微囊包含作为活性成分的式I所示的大黄素甲醚或其衍生物，和作为囊材的海藻酸钠-壳聚糖；

其中，R₁、R₄彼此独立地代表无取代或被一个或多个R_a取代的下列基团：烷基、烷基氧基；

R₂、R₃彼此独立地代表H，无取代或被一个或多个R_a取代的下列基团：烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、烷基磷酰基；

每一个R^a彼此独立地选自卤素、羟基、巯基、硝基、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、-NR^dR^eR^f、-C(O)OR^g、-S(O)₂OR^g；

R^d、R^e、R^f彼此独立地选自H，无取代或被一个或多个R^b取代的下列基团：烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；

R^g独立地选自H，无取代或被一个或多个R^b取代的下列基团：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基；

每一个R^b独立地选自卤素、羟基、巯基、硝基、氨基、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基；

优选地，R₁和R₄为甲基，R₂和R₃为H。

根据本发明，所述微囊的平均粒径可为120～3000μm，例如1000～1800μm，如1400～1800μm，具体实例可以是约1574～1722μm。

根据本发明，所述微囊的载药量可以为5～40μg/g，如10～30μg/g，优选为12-20μg/g。

根据本发明，所述微囊对药物例如大黄素甲醚的包封率可以为60％以上，例如为65％～75％。

根据本发明优选的实施方案，所述肠溶制剂是肠溶微囊。

所述肠溶制剂(例如微囊)可以是具有抗肿瘤活性的肠溶制剂，优选具有广谱抗肿瘤活性的肠溶制剂；

所述肿瘤可以是选自下列的一种或多种癌症：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本发明还提供所述肠溶制剂(例如微囊)的制备方法，包括：

1)将式I所示的大黄素甲醚或其衍生物的油相溶液，与海藻酸钠的水相溶液混合，制备乳液；

2)将步骤1)所得的乳液与CaCl₂溶液混合，搅拌，过滤，洗涤，得到湿微囊；

3)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化，洗涤，干燥，得到所述微囊。

根据本发明的实施方案，优选地，所述制备方法中：

步骤1)中：

大黄素甲醚或其衍生物的油相溶液可通过将大黄素甲醚或其衍生物与鱼肝油混合，超声助溶得到；

海藻酸钠的水相溶液可通过将海藻酸钠与水混合得到；

例如，可以通过将油相溶液加入水相溶液中，搅拌形成乳液；

优选地，所述大黄素甲醚及其衍生物的质量(g)与鱼肝油的体积(mL)比为(50～70):1，优选(55～60):1，例如使用60:1或57:1的大黄素甲醚与鱼肝油；

优选地，所述海藻酸钠水溶液的浓度可以为0.5～10质量％，如1～3质量％，例如2质量％。

根据本发明的实施方案，所述水相溶液与油相溶液的水油相体积比可以为2～50:1，如8～10:1，其实例可以为9:1。

根据本发明，将油相溶液加入水相溶液中时，可以在5～40℃下进行，例如10～30℃下进行，如15～25℃(如室温)下进行。

步骤2)中：

可以将所述乳液加入CaCl₂溶液中，搅拌，平衡，过滤，冲洗，形成湿微囊；

根据本发明，所述CaCl₂溶液的浓度可以为1～10质量％，例如2～4质量％，如3质量％。

根据本发明，所述乳液加入可以使用连续滴注的方式，例如采用40～80滴/min的速度滴注，如采用50～70滴/min(如60滴/min)的速度滴注。

根据本发明，所述平衡时间可以为10～120min，例如30～60min。

步骤3)中：

例如，壳聚糖溶液的pH可以为5.5～6.5，例如pH＝6～6.5；

例如，所述壳聚糖溶液的浓度可以为0.1～10质量％，如0.3～5质量％，如0.5～1质量％；

根据本发明的实施方案，所述孵化时间为10～120min，例如30～60min，如40min。

作为实例，所述肠溶制剂(例如微囊)的制备方法包括如下步骤：

(1)取大黄素甲醚粉末300mg分散溶解在鱼肝油5ml中，超声助溶，作为油相溶液；

(2)采用1～3％的海藻酸钠水溶液作为水相溶液；

(3)室温条件下，将油相溶液缓慢加入水相中，水油相比为8～10:1，磁力搅拌器不断搅拌，直至形成乳液；

(4)用5号针头注射器将乳液以60滴/min的速度连续滴注至2～4％浓度的CaCl₂溶液中，期间磁力搅拌器不断搅拌，平衡30min～2小时，过滤，蒸馏水冲洗2次，形成湿微囊；

(5)0.5～1％壳聚糖溶液调整pH＝6；

(6)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化30min～1小时，蒸馏水冲洗2次，自然干燥，即得大黄素甲醚肠溶微囊。

本发明还提供一种药物组合物，包含所述肠溶制剂(例如微囊)。

根据本发明，所述药物组合物还可以任选地含有或不含有药学上可接受的一种或多种辅料。作为实例，所述辅料可以包括但不限于选自下列的一种或多种：崩解剂、助流剂、润滑剂、稀释剂或填充剂、粘合剂、着色剂。

优选地，所述药物组合物为抗肿瘤药物，特别是广谱抗肿瘤药物。

根据本发明，所述药物组合物任选地含有或不含有另外的抗肿瘤活性成分。

本发明还提供一种制备所述药物组合物的方法，包括将所述肠溶制剂(例如微囊)与其他组分混合。

本发明还提供一种式I所示的大黄素甲醚或其衍生物在制备药物组合物，例如肠溶制剂，如微囊剂中的用途。

所述肠溶制剂可以是抗肿瘤肠溶制剂。

根据本发明，所述肿瘤可以是选自下列的一种或多种癌症：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本发明还提供所述肠溶制剂，例如所述微囊在制备抗肿瘤药物中的用途。

根据本发明，所述抗肿瘤药物优选为广谱抗肿瘤药物，例如可用于预防、抑制或治疗下列一种或多种癌症的药物：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本发明还提供所述肠溶制剂，例如所述微囊用于预防、抑制或治疗肿瘤，例如上述癌症的用途。

术语定义和解释

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请保护的范围内。

本申请说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围仅可为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，碳原子数为“1～10”应当理解为记载了1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数。

本发明使用的“卤素”指氟、氯、溴和碘。

本发明单独使用或用作后缀或前缀的“烷基”意在包括具有1至20个，优选1-6个碳原子(或若提供了碳原子的具体数目，则指该具体数目)的支链和直链饱和脂族烃基。例如，“C_1-6烷基”表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链和支链烷基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。

本发明使用的术语“环烷基”意在包括具有指定数目碳原子的饱和环基。这些术语可包括稠合或桥接的多环系统。环烷基在其环结构中具有3至40个碳原子。在一个实施方案中，环烷基在其环结构中具有3～10个碳原子。例如，“C_3-6环烷基”表示例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团。

本发明使用的术语“芳基”指由5至20个碳原子构成的芳族环结构。例如：包含5、6、7和8个碳原子的芳族环结构可以是单环芳族基团例如苯基；包含8、9、10、11、12、13或14个碳原子的环结构可以是多环的例如萘基。芳环可在一个或多个环位置取代有上述那些取代基。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环环系，其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有(所述环为“稠环”)，其中至少一个环是芳族的且其它环例如可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。多环的实例包括但不限于2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯和2,3-二氢-1-苯并呋喃。

本发明使用的“杂芳基”指具有至少一个环杂原子(例如硫、氧或氮)的杂芳族杂环。杂芳基包括单环系统和多环系统(例如具有2、3或4个稠环)。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡咯基、噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲唑基、1,2,4-噻二唑基、异噻唑基、苯并噻吩基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、氮杂苯并噁唑基、咪唑并噻唑基、苯并[1,4]二氧杂环己烯基、苯并[1,3]二氧杂环戊烯基等。在一些实施方案中，杂芳基具有3至40个碳原子且在其它实施方案中具有3至20个碳原子。在一些实施方案中，杂芳基包含3至14个、4至14个、3至7个或5至6个成环原子。在一些实施方案中，杂芳基具有1至4个、1至3个或1至2个杂原子。在一些实施方案中，杂芳基具有1个杂原子。

除非另有说明，本发明使用的术语“杂环基”指包含3至20个原子的饱和、不饱和或部分饱和的单环、二环或三环，其中1、2、3、4或5个环原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，其可通过碳或氮来连接，其中-CH₂-基团任选被-C(O)-代替；及其中除非另有相反说明，环氮原子或环硫原子任选被氧化以形成N-氧化物或S-氧化物或环氮原子任选被季铵化；其中环中的-NH任选被乙酰基、甲酰基、甲基或甲磺酰基取代；及环任选被一个或多个卤素取代。应该理解的是，当杂环基中S原子和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。若所述杂环基为二环或三环，则至少一个环可任选为杂芳族环或芳族环，条件是至少一个环是非杂芳族的。若所述杂环基为单环，则其一定不是芳族的。杂环基的实例包括但不限于哌啶基、N-乙酰基哌啶基、N-甲基哌啶基、N-甲酰基哌嗪基、N-甲磺酰基哌嗪基、高哌嗪基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吗啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、二氢吲哚基、四氢吡喃基、二氢-2H-吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃-1-氧化物、四氢噻喃-1,1-二氧化物、1H-吡啶-2-酮和2,5-二氧代咪唑烷基。

式I化合物还包括其各自所有可能的立体异构体，其是单一立体异构体或所述立体异构体(例如R-异构体或S-异构体，或者E-异构体或Z-异构体)的任意比例的任意混合物的形式。可通过任意适合的现有技术方法(例如色谱法，特别是例如手性色谱法)实现本发明的化合物的单一立体异构体(例如单一对映异构体或单一非对映异构体)的分离。另外，所述化合物还可以互变异构体的形式存在。本发明式I化合物包括所有可能的互变异构体，其是单一互变异构体或所述互变异构体的任意比例的任意混合物的形式。所有这些异构体及它们的混合物都包括在本发明中。

本发明的式I化合物、其异构体、前药、药学上可接受的盐以及复合物可以分别以溶剂合物如水合物的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。在化学计量溶剂合物(例如水合物)的情况下，可能分别是半溶剂合物、一溶剂合物、倍半溶剂合物、二溶剂合物、三溶剂合物、四溶剂合物、五溶剂合物、半五溶剂合物等。本发明包括所有此类溶剂合物，特别是水合物。

本发明式I化合物的药学上可接受的盐可以是例如在链或环中具有氮原子或其他碱性基团的、具有足够碱性的本发明的化合物的酸加成盐，例如与如下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸，或者与如下有机酸形成的酸加成盐：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。

另外，具有足够酸性的本发明的化合物的另一种适合的药学上可接受的盐是碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐，或与提供生理学可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与如下物质形成的盐：N-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、1-氨基-2,3,4-丁三醇。另外，碱性含氮基团可用如下试剂季铵化：低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。

并且，所述药学上可接受的盐还应当包括部分为内盐形式的化合物的药学上可接受的盐。

术语“有效量”或者“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于如下定义的疾病治疗)的本发明所述化合物的量。治疗有效量可以取决于以下因素而改变：预期应用(体外或者体内)，或者所治疗的受试者和疾病病症如受试者的重量和年龄、疾病病症的严重性和给药方式等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语也适用于可在靶细胞内诱导特定响应(例如减少血小板粘附和/或者细胞迁移)的剂量。具体剂量将取决于以下因素而改变：所选择的特定化合物、所依据的给药方案、是否与其它化合物组合给药、给药的时间安排、所给药的组织和所承载的物理递送系统。

术语“前药”意在表示可以在生理条件下或者通过溶剂分解转化成本发明所述的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”是指可药用的生物活性化合物的前体。当给药至受试者时，前药可以是无活性的，但是例如通过水解在体内转化成活性化合物。前药化合物通常提供以下优点：在哺乳动物生物体中的溶解性、组织相容性或者延迟释放。术语“前药”也意在包括任何共价结合的载体，当将该前药给药哺乳动物受试者时，所述前药在体内释放活性化合物。本发明所述的活性化合物的前药可以如下制备：以下述方式修饰活性化合物中存在的官能团，所述方式使得修饰物在常规操作中或者在体内裂解成母体活性化合物。前药包括这样的化合物，其中羟基、氨基或者巯基与任何基团结合，当将活性化合物的前药给药哺乳动物受试者时，所述任何基团裂解以分别形成游离的羟基、游离的氨基或者游离的巯基。前药的实例包括但不限于活性化合物中羟基官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或者胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。

术语“辅料”是指可药用惰性成分。赋形剂种类的实例非限制性地包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂和稀释剂等。赋形剂能增强药物制剂的操作特性，即通过增加流动性和/或粘着性使制剂更适于直接压缩。适用于上述制剂的典型的药学上可接受的载体的实例为：糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉类，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙类，例如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸碱土金属盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸钙；硬脂酸；植物油类，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和负离子表面活性剂；乙二醇聚合物；β-环糊精；脂肪醇类；和谷物水解固形物以及其它无毒的可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧剂、润滑剂、着色剂等在药物制剂中常用到的辅料。

本发明的有益效果如下：

本发明制备了大黄素甲醚及其衍生物的肠溶制剂及微囊，避免了常规口服制剂在通过胃部时，活性成分被胃酸水解灭活及对胃的刺激作用，同时利用缓释作用，提高了生物利用度，有利于发挥大黄素甲醚及其衍生物的抗肿瘤作用。发明人经过大量工艺和囊材组分研究，通过调节微囊囊材及各组分配比，选择更适于大黄素甲醚的工艺和参数条件，能够改善大黄素甲醚及其衍生物抗肿瘤性能，更适于大黄素甲醚及其衍生物在特定pH值、酶等的作用下，在动物体内高效、稳定地释放和吸收，以使活性成分发挥最佳的效能，从而取得更佳的技术效果。

本发明在微囊的囊材选择上使用了海藻酸钠-壳聚糖微囊，海藻酸钠与氯化钙接触，具有瞬时成囊的性质，而壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负电荷作用形成聚电解质膜，从而提高微囊的稳定性和载药量，并可调节药物释放速度。

海藻酸钠-壳聚糖是天然高分子材料，具有无毒、无刺激性、成膜性能好、稳定性好、具有可生物降解的优势，尤其壳聚糖自身即具有一定的抗菌消炎、促进伤口愈合、降血脂及胆固醇和肿瘤细胞抑制的作用，可对大黄素甲醚及其衍生物抗肿瘤产生辅助效果，从微囊的囊材选择上优于半合成高分子的纤维素衍生物，以及合成高分子的聚酯、聚酸酐等。

以天然高分子材料海藻酸钠-壳聚糖为微囊的囊材，与合成及半合成高分子材料相比，具有无毒、无刺激性、成膜性能好、稳定性好、可生物降解的优势，且壳聚糖本身具有抗菌消炎、促进伤口愈合、降血脂及胆固醇和肿瘤细胞抑制的作用，对大黄素甲醚及其衍生物的抗肿瘤作用具有促进效果，为此取得了优于半合成高分子的纤维素衍生物，以及合成高分子的聚酯、聚酸酐等囊材的良好效果。

使用本发明所述浓度的海藻酸钠水溶液作为水相，可以使后续制备的乳液粘度适中，利于滴制，稳定性好，不易分层。采用本发明的水油相比，既保证了乳剂稳定性，又提高了乳液载药量。

随着CaCl₂溶液浓度增大、平衡时间延长，微囊的硬度增大，但载药量降低，采用本发明浓度的CaCl₂溶液和平衡时间，可以保证微囊具有适当的硬度，且保证了高载药量。

本发明采用浓度为0.5～1％壳聚糖溶液，在此浓度时，微囊粒径较低，孵化得到的微囊圆整度好；壳聚糖溶液的pH值还有利于改善微囊膜的强度。将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化30min～1小时，在微囊粒径减小的同时，保证了微囊的载药量。

在制备微囊的过程中，优化了制备工艺，得出简单易行、安全环保的制备方法，按优化条件制备的多批大黄素甲醚及其衍生物微囊自然干燥后呈白色颗粒，球形圆整，大小均匀，分散良好，粒径、载药量、包封率均保持稳定，表明此工艺下制备的微囊性质稳定，适于在大规模工业化生产中应用。

附图说明

图1为实施例4中受试裸鼠体重的变化图。

图2为实施例4中受试裸鼠肿瘤体积的变化图(**p＜0.01)。

图3为实施例4中受试裸鼠肿瘤的细胞凋亡及HE染色图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的大黄素甲醚及其衍生物微囊的制备方法和应用做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

I.微囊的制备和活性测试实验

实施例1：

(1)取大黄素甲醚粉末300mg分散溶解在鱼肝油5ml中，超声助溶，作为油相溶液；

(2)采用3％的海藻酸钠水溶液作为水相溶液；

(3)水油相比为8:1；

(4)在23℃将油相溶液缓慢加入水相溶液中，磁力搅拌器不断搅拌，直至形成乳液，乳液粘稠度较高，混匀成乳时间延长，滴制难度增加；

(5)用5号针头注射器将乳液以40滴/min的速度连续滴注至4％浓度的CaCl₂溶液中，期间磁力搅拌器不断搅拌，形成漩涡，平衡1小时，过滤，蒸馏水冲洗2次，形成湿微囊；

(6)1％壳聚糖溶液调整pH＝6；

(7)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化1小时，蒸馏水冲洗2次，自然干燥，即得大黄素甲醚肠溶微囊；

所得大黄素甲醚肠溶微囊为白色颗粒，球形圆整，表面光滑，大小均匀，分散良好，平均粒径1574.36μm、载药量14.23μg/g、包封率69.51％。

实施例2：

(1)取大黄素甲醚粉末300mg分散溶解在鱼肝油5ml中，超声助溶，作为油相溶液；

(2)采用2％的海藻酸钠水溶液作为水相溶液；

(3)水油相比为9:1；

(4)在23℃将油相溶液缓慢加入水相溶液中，磁力搅拌器不断搅拌，直至形成乳液；

(5)用5号针头注射器将乳液以60滴/min的速度连续滴注至4％浓度的CaCl₂溶液中，期间磁力搅拌器不断搅拌，形成漩涡，平衡1小时，过滤，蒸馏水冲洗2次，形成湿微囊；

(6)1％壳聚糖溶液调整pH＝6；

(7)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化40min，蒸馏水冲洗2次，自然干燥，即得大黄素甲醚肠溶微囊；

所得大黄素甲醚肠溶微囊为白色颗粒，球形圆整，表面光滑，大小均匀，分散良好，平均粒径1135.41μm、载药量20.14μg/g、包封率72.12％。

实施例3：

(1)取大黄素甲醚粉末2000mg分散溶解在鱼肝油35ml中，超声助溶，作为油相溶液；

(2)采用2％的海藻酸钠水溶液作为水相溶液；

(3)水油相比为10:1；

(4)在25℃将油相溶液缓慢加入水相溶液中，磁力搅拌器不断搅拌，直至形成乳液；

(5)用5号针头注射器将乳液以60滴/min的速度连续滴注至3％浓度的CaCl₂溶液中，期间磁力搅拌器不断搅拌，形成漩涡，平衡1小时，过滤，蒸馏水冲洗2次，形成湿微囊；

(6)1％壳聚糖溶液调整pH＝6；

(7)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化40min，蒸馏水冲洗2次，自然干燥，即得大黄素甲醚肠溶微囊；

所得大黄素甲醚肠溶微囊为白色颗粒，球形圆整，表面光滑，大小均匀，分散良好，经平均粒径1721.78μm、载药量12.58μg/g、包封率65.49％。

实施例4大黄素甲醚肠溶微囊的抗肿瘤的活性评价

1.试验动物：

裸鼠：SPF级BALB/cnu，雌雄各半，中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供。

2.试验方法：

2.1肿瘤模型的建立

将人肝癌HepG2细胞进行常规培养，细胞增殖至所需量后胰酶消化，收集细胞，取细胞悬液置显微镜下计数，调整细胞数，在无菌条件下，接种于裸小鼠右腋皮下，接种量为2.0×10⁷个细胞/0.2ml/只。

2.2分组与给药

自接种瘤细胞后定期用游标卡尺分别测量瘤体积(TV)，测量所得瘤体积达到100mm³时，随机分为空白对照组、大黄素甲醚肠溶微囊20mg/kg/day、40mg/kg/day剂量组，每组10只。各组均每天灌胃给药一次。空白对照组给等体积的灭菌蒸馏水。每周测量各组肿瘤体积2次，同时称量裸鼠体重。

2.3瘤体积测定

经过24天灌胃，末次给药后24小时处死动物，称体重，解剖瘤块，称瘤重。

计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别为瘤体的长、宽径。根据测量结果计算相对肿瘤体积(RTV)。

2.4瘤体切片染色及凋亡测定

动物处死后，分离瘤体，采用常规40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋。包埋后，用石蜡切片机连续切取3μm厚度的切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有APES胶的载玻片上，入40℃左右烤片箱10min烘干。采用TUNEL法检测，操作按照试剂盒说明进行。将切片置于光学显微镜下观察，每张切片选取3个阳性细胞数较多的高倍视野，计算平均每100个瘤体细胞中阳性细胞所占的百分比，即细胞凋亡率。

石蜡切片染色前进行脱蜡，脱蜡完成后，使用HE染色法以苏木精溶液染色20min，1％盐酸酒精浸泡5秒钟，用自来水洗10秒，浸入饱和碳酸锂水溶液中，切片变蓝化10秒钟。以70％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，1％伊红酒精溶液浸泡1min，无水乙醇浸泡两次各5min，无水乙醇：二甲苯为1:1的溶液浸泡5min，二甲苯浸泡两次各5min，完成染色，中性树脂封片，镜下观察。

2.5统计学分析

数据以X±SD表示，单个实验重复至少3次，Graph-pad Prism 5.01软件处理数据，Student’s t test统计学软件进行组间统计，p<0.05代表结果有统计学意义。

3.试验结果

3.1大黄素甲醚肠溶微囊对荷瘤裸鼠体重的影响

当肿瘤接种后瘤体积达到100mm³时，进行分组灌胃，期间裸鼠未发生死亡现象。结果如图1所示，灌胃期间裸鼠体重未发生变化。

3.2大黄素甲醚肠溶微囊对荷瘤裸鼠瘤体积的影响

经过大黄素甲醚肠溶微囊灌胃后，裸鼠肿瘤体积得到抑制，结果如图2所示，且随着大黄素甲醚灌胃剂量的增加，肿瘤体积不断下降。

3.3大黄素甲醚肠溶微囊对荷瘤裸鼠瘤体细胞凋亡的影响

瘤体经过石蜡切片，通过TUNEL法分析肿瘤细胞的凋亡，发现经大黄素甲醚肠溶微囊灌胃，肿瘤细胞的凋亡有所提升，且随着灌胃剂量加大，肿瘤细胞凋亡率不断增加，结果如图3所示，表明大黄素甲醚肠溶微囊具有促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用。

由以上实验结果可知，大黄素甲醚肠溶微囊对裸鼠体重无显著影响，对肝癌荷瘤裸鼠的肿瘤体积具有抑制作用，其肿瘤抑制作用与促进肿瘤凋亡有关。

II.大黄素甲醚活性实验

实验方法：

1.试验细胞及动物：

细胞株：8种人癌细胞株，包括：HepG2(肝癌)、H1299(肺癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、SW620(结肠癌)、CNE2(鼻咽癌)、SGC-7901(胃癌)、KB(口腔上皮细胞癌)、K562(慢性髓系白血病)，以及3种正常细胞株HL-7702(正常肝细胞)、BEAS-2B(正常肺细胞)、NCM460(正常结肠上皮细胞)。上述细胞株由中科院上海细胞所提供。

裸鼠：SPF级BALB/cnu，雌雄各半。SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重为18～22g。SPF级wistar大鼠，体重50～70g，雌雄各半。由中国医学科学院实验动物研究所提供。

2.试验方法：

2.1 CCK-8法

将各种细胞培养在96孔板中，每种细胞随机分为对照组(DMSO组)、大黄素甲醚10μM组、大黄素甲醚20μM组，加入相应的药物孵育24-72小时，更换RPMI 1640培养基，清洗细胞去除药物，向每孔加入10μl CCK-8溶液，将各种细胞重新放入37℃培养箱中孵育3h。用酶标仪于450nm处检测各孔的吸光度，计算各组活细胞百分比。

2.2裸鼠肿瘤模型的建立

HepG2肝癌细胞、H1299肺癌细胞、SW620结肠细胞进行常规培养，细胞增殖至所需量后胰酶消化，收集细胞，取细胞悬液置显微镜下计数，调整细胞数，在无菌条件下，接种于裸小鼠右腋皮下，接种量为2.0×10⁷个细胞/0.2ml/只。

2.3裸鼠瘤体积检测

自接种瘤细胞后定期用游标卡尺分别测量瘤体积(TV)，测量所得瘤体积达到100mm³时，随机分为空白对照组(DMSO组)、大黄素甲醚20mg/kg/day、40mg/kg/day剂量组，每组10只。各组均每天灌胃给药一次。每周测量各组肿瘤体积2次。经过24天灌胃，末次给药后24小时处死动物，称体重，解剖瘤块，称瘤重。

计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别为瘤体的长、宽径。

2.4大黄素甲醚急性毒性试验

按照最大耐受量(MTD)法试验进行。实验前空腹16h备用(不限制饮水)。称取5.0g大黄素甲醚，以DMSO溶解灌胃给予实验动物，灌胃量为0.2ml/10g.bw，染毒剂量为5.0g/kg.bw，观察用药后小鼠有无出现明显的中毒症状及死亡情况，连续观察一周，记录动物的中毒表现及死亡情况，14天后解剖小鼠，肉眼及显微镜观察重要脏器，有无出现明显的病理学改变。

2.5大黄素甲醚亚急性毒性试验

根据药物剂量换算，以换算后抗肿瘤剂量的20、50、100倍为染毒剂量，染毒剂量分别为0.08、0.2、0.4g/kg.bw，3种剂量分别灌胃大鼠，每日一次，对照组给予同体积的DMSO。单笼喂养，自由饮食，观察大鼠的一般表现、行为、中毒体征等，连续观察30天，每周称量体重1次，称量2次食物剩余量和撒食量，计算每周食物摄入量，每周及总食物利用率。第30天尾静脉取血，进行血常规测定。禁食16h后于第31天腹主动脉取血，进行血生化测定。30天后解剖大鼠，肉眼及显微镜观察重要脏器，有无出现明显的病理学改变。

2.6统计学分析

数据以X±SD表示，单个实验重复至少3次，Graph-pad Prism 5.01软件处理数据，Student’s t-test统计学软件进行组间统计，p<0.05代表结果有统计学意义。

实施例5大黄素甲醚对肿瘤细胞及正常细胞存活率的影响

按照如上实验方法，大黄素甲醚对肿瘤细胞及正常细胞存活率的影响测试结果如表1所示：与对照组相比，大黄素甲醚对肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌、慢性髓系白血病细胞的存活率均有显著的抑制作用，且随着大黄素甲醚剂量提升，对以上肿瘤细胞存活率的抑制作用增强。大黄素甲醚的肿瘤抑制作用在肝癌、肺癌、结肠癌细胞中尤其明显。而对于正常肝细胞、正常的支气管上皮细胞、正常结肠上皮细胞的存活率无显著影响。由表1的结果可知，大黄素甲醚能抑制多种肿瘤细胞活性，尤其对肝癌、肺癌、结肠癌有效，但对机体正常细胞的活性无影响。

表1大黄素甲醚对肿瘤细胞及正常细胞存活率的影响

vs对照组*p＜0.05，**p＜0.01。

实施例6大黄素甲醚对荷瘤裸鼠瘤体积的影响

按照如上实验方法，大黄素甲醚对荷瘤裸鼠的瘤体积的影响结果如表2所示，与Day0相比，肝癌、肺癌、结肠癌Day24的肿瘤体积均有显著增长；在Day24，与空白对照组比较，应用大黄素甲醚灌胃的裸鼠瘤体积显著减小，且随着灌胃剂量的增长，瘤体积的抑制作用更加显著。此结果表明：大黄素甲醚能有效抑制肝癌、肺癌、结肠癌荷瘤裸鼠的瘤体积增长，对肿瘤有显著的抑制作用。

表2大黄素甲醚对对荷瘤裸鼠瘤体积的影响

vs Day 0##p＜0.01；vs Day 24对照组**p＜0.01。

实施例7大黄素甲醚的急性、亚急性毒性实验

3.1急性毒性试验：

灌胃给予受试物一周后，动物100％存活率，活动度、毛发光滑度、饮食呼吸正常，鼻、眼、口腔有无异常分泌物，未见明显中毒症状。一周后解剖小鼠，肉眼及显微镜观察重要脏器，未出现明显的病理学改变。最大耐受量(MTD)试验结果如表3所示，大黄素甲醚对两种性别小鼠的MTD均大于5.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，该样品属实际无毒级物质。

表3小鼠急性毒性实验结果

3.2亚急性毒性试验：

试验周期内各实验组动物总体生长状况良好，体重逐周增长，100％存活率，活动度、毛发光滑度、饮食呼吸正常，未见中毒体征及死亡。各实验组动物每周体重(如表4)、进食量、食物利用率无显著性差异。各组大鼠血液学检测各项指标如表5-6所示，无显著性差异。30天后解剖大鼠，肉眼及显微镜观察重要脏器，未出现明显的病理学改变。

表4大鼠30天体重的变化

表5大鼠30天喂养试验末期血液学检查结果

表6 30天喂养对大鼠白细胞的影响

由以上实施例的结果可知，大黄素甲醚作为一种具有广谱抗肿瘤作用的中药有效成分，在体外实验中对肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌、慢性髓系白血病细胞的活性均有明显的抑制作用，尤其对肝癌、肺癌、结肠癌的抑制作用更为显著。在动物实验中，对肝癌、肺癌、结肠癌荷瘤裸鼠的瘤体积均有明显的抑制作用。而且大黄素甲醚本身对正常机体无毒副作用。

并且，本发明的大黄素甲醚及其衍生物微囊，避免了大黄素甲醚及其衍生物在通过胃部时，被胃酸水解灭活及对胃的刺激作用，同时利用缓释作用，提高了生物利用度，有利于发挥大黄素甲醚及其衍生物的抗肿瘤作用，能够改善大黄素甲醚及其衍生物抗肿瘤性能，取得更佳的治疗效果。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肠溶制剂，包含作为活性成分的式I所示的大黄素甲醚或其衍生物，和药学上可接受的辅料；

优选地，所述肠溶制剂选自肠溶微囊、肠溶片或肠溶胶囊；

其中，所述微囊包含作为活性成分的式I所示的大黄素甲醚或其衍生物，和作为囊材的海藻酸钠-壳聚糖；

其中，R₁、R₄彼此独立地代表无取代或被一个或多个R_a取代的下列基团：烷基、烷基氧基；

R₂、R₃彼此独立地代表H，无取代或被一个或多个R_a取代的下列基团：烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、烷基磷酰基；

每一个R^a彼此独立地选自卤素、羟基、巯基、硝基、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、-NR^dR^eR^f、-C(O)OR^g、-S(O)₂OR^g；

R^d、R^e、R^f彼此独立地选自H，无取代或被一个或多个R^b取代的下列基团：烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；

R^g独立地选自H，无取代或被一个或多个R^b取代的下列基团：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基；

每一个R^b独立地选自卤素、羟基、巯基、硝基、氨基、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷基氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基；

优选地，R₁和R₄为甲基，R₂和R₃为H；

优选地，所述微囊的平均粒径可为120～3000μm，例如1000～1800μm，如1400～1800μm，如是约1574～1722μm；

优选地，所述微囊的载药量可以为10～30μg/g，优选为12-20μg/g，例如为14.23μg/g、20.14μg/g或12.58μg/g；

优选地，所述微囊对药物例如大黄素甲醚的包封率可以为60％以上，例如为65％～75％。

2.如权利要求1所述的肠溶制剂，其中所述肠溶制剂是肠溶微囊；

所述肠溶制剂可以是具有抗肿瘤活性的肠溶制剂，优选具有广谱抗肿瘤活性的肠溶制剂；

所述肿瘤可以是选自下列的一种或多种癌症：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

3.如权利要求1或2所述肠溶制剂的制备方法，包括：

1)将式I所示的大黄素甲醚或其衍生物的油相溶液，与海藻酸钠的水相溶液混合，制备乳液；

2)将步骤1)所得的乳液与CaCl₂溶液混合，搅拌，过滤，洗涤，得到湿微囊；

3)将湿微囊投入壳聚糖溶液中孵化，洗涤，干燥，得到所述肠溶制剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其中步骤1)中：

大黄素甲醚或其衍生物的油相溶液可通过将大黄素甲醚或其衍生物与鱼肝油混合，超声助溶得到；

海藻酸钠的水相溶液可通过将海藻酸钠与水混合得到；

例如，可以通过将油相溶液加入水相溶液中，搅拌形成乳液；

优选地，所述大黄素甲醚及其衍生物的质量(g)与鱼肝油的体积(mL)比为(50～70):1，例如(55～60):1；

优选地，所述海藻酸钠水溶液的浓度可以为0.5～10质量％，如1～3质量％，例如2质量％；

优选地，所述水相溶液与油相溶液的水油相体积比可以为2～50:1，如8～10:1，如9:1；

优选地，将油相溶液加入水相溶液中时，可以在5～40℃下进行，例如10～30℃下进行，如15～25℃(如室温)下进行。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其中步骤2)中：

可以将所述乳液加入CaCl₂溶液中，搅拌，平衡，过滤，冲洗，形成湿微囊；

优选地，所述CaCl₂溶液的浓度可以为1～10质量％，例如2～4质量％，如3质量％；

优选地，所述乳液加入可以使用连续滴注的方式，例如采用40～80滴/min的速度滴注，如采用50～70滴/min(如60滴/min)的速度滴注；

优选地，所述平衡时间可以为10～120min，例如30～60min。

6.如权利要求3-5任一项所述的制备方法，其中步骤3)中：

壳聚糖溶液的pH可以为5.5～6.5，例如pH＝6～6.5；

例如，所述壳聚糖溶液的浓度可以为0.1～10质量％，如0.3～5质量％，如0.5～1质量％；

所述孵化时间为10～120min，例如30～60min，如40min。

7.一种药物组合物，包含权利要求1或2所述的肠溶制剂，以及任选地含有或不含有药学上可接受的一种或多种辅料；

优选地，所述药物组合物为抗肿瘤药物，特别是广谱抗肿瘤药物；

所述肿瘤可以是选自下列的一种或多种癌症：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

8.如权利要求7所述药物组合物的制备方法，包括将所述肠溶制剂与其他组分混合。

9.式I所示的大黄素甲醚或其衍生物在制备药物组合物，例如肠溶制剂，优选微囊剂中的用途，其中式I具有权利要求1中的结构和定义；

优选地，所述肠溶制剂可以是抗肿瘤微囊剂；

所述肿瘤可以是选自下列的一种或多种癌症：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

10.权利要求1或2所述的肠溶制剂在制备抗肿瘤药物中的用途；

所述抗肿瘤药物优选为广谱抗肿瘤药物，例如可用于预防、抑制或治疗下列一种或多种癌症的药物：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。