CN114010631B - 含笑内酯及其衍生物在创伤性颅脑损伤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗创伤性颅脑损伤药物中的用途，具体机制主要是含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐通过抑制创伤性颅脑损伤后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。

Description

含笑内酯及其衍生物在创伤性颅脑损伤治疗中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及含笑内酯及其衍生物在治疗创伤性颅脑损伤疾病中，可通过抑制小胶质细胞的炎症效应，进而减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复中的新应用。
背景技术
天然产物对于新药的发现与设计、合成具有非常重要的意义，也是生物活性物质和创新药物的重要来源，已批准上市的药物例如紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Docetaxel)、长春瑞滨(Vinorelbine)、羟基喜树碱(camptothecin)、青蒿素(Artemisinin)等都是天然产物的衍生物或其类似物。天然产物作为药物来源开发具有独特作用，从中有可能筛选出高效低毒的先导化合物，从而开发出治疗疾病的新型药物，减轻患者痛苦和改善患者生活质量。
含笑内酯(别名：乌心石内酯；MCL，Micheliolide)，是一种从木兰科含笑属黄兰(Michelia champaca)和台湾含笑(Michelia compressa)根皮中提取分离的愈创木烷型倍半萜内酯类中药单体。在传统中医药理中主要适用于消炎镇痛，治疗发热、偏头痛以及类风湿性关节炎等疾病。含笑内酯的化学结构式为：
近年来，含笑内酯及其衍生物是如何抑制炎症反应的深入机制，也得到了进一步的研究。有证据显示，其可以通过阻止IκB的降解及磷酸化，扭转NF-κB二聚体的活化裂解及核内转移，导致炎症小体的形成受阻，从而最终抑制炎症进展。
而随着祖国中医药学基础研究的不断发展，含笑内酯(MCL)在癌症治疗中的作用逐渐显现。已有研究证实，MCL可通过抑制NF-κB信号通路并调控细胞ROS水平来诱导肿瘤细胞凋亡，对急性骨髓性白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肠癌以及胰腺癌等疾病具有显著的治疗作用。医用化学技术的长足进步也为MCL开辟了更为广阔的应用前景，MCL的二甲氨基迈克尔加成化合物(Dimethylamino Michael adduct of MCL,ACT001，DMAMCL)具有比MCL更高的血浆药物动力学稳定性(其结构式如下所示)，更持久的药物释放作用时间以及更强的水溶性，在中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病治疗当中，因其可高效通过血脑屏障且对神经细胞毒副作用小，而逐渐受到关注，且已在众多CNS相关疾病治疗领域当中初见成效。
在一份关于神经胶质瘤细胞药物治疗的基础研究报告中显示，含笑内酯(MCL)及其衍生物(ACT001)的脑/血浆药物蓄积浓度比(Cbrain/Cplasma)是替莫唑胺(TMZ，Temozolomide)的4.5倍，可高效诱导胶质瘤细胞死亡，最终抑制肿瘤细胞生长，而被认为是恶性胶质瘤的潜在治疗药物。MCL已在中国(ID:2017L04073)及澳大利亚(ID:ACTRN12616000228482)进入临床I期实验。而在帕金森以及强制性脊柱炎的相关疾病治疗中也同样显示，含笑内酯(MCL)及其衍生物(ACT001)对炎症性反应的抑制作用，可有效缓解疾病的进展及预后情况。然而，含笑内酯(MCL)及其衍生物(ACT001)对于创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)介导的神经炎症反应的治疗作用则尚无报道。
创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)以高发生率、高死亡率和高致残率业已成为世界诸多国家突出的公共健康和社会经济问题，并且是公认的45岁以下青壮年死亡的首位病因。目前重度TBI的死亡率可高达35％，而伤后的神经功能障碍发生率更是居高不下，给伤者及其家庭带来长期的经济负担和严重的精神压力。
TBI是一个复杂的病理转变过程,大体可分为以下两个阶段：①原发性损伤：即受到直接创伤性打击瞬间所出现的脑实质机械性损伤。其损伤类型和严重程度，则主要取决于受伤瞬间机械性外力因素的性质，打击部位及方向等。②继发性损伤：即是由原发性损伤所诱导的一系列细胞组织病理性代谢改变。其中，尤以神经炎症性反应最为突出。其可加速血脑屏障的破坏，引发神经元的凋亡坏死，进而加重原有损伤或引起新的病理变化，这一过程可持续数天、数月乃至数年之久。临床上表现为：原发性脑实质损伤的进一步加重、进展性颅内出血、创伤性脑梗塞、创伤性脑积水、脑水肿及颅内压增高等。
虽然，近年来神经影像学技术有了长足的发展、加之多模态监护应用的普及，使得外科手术治疗在时机选择、术式及入路等方面更趋于合理，最大程度的延续了TBI患者的总体生存时间。但以上这些努力，仅仅是针对原发性损伤所致恶果所采取的补救性治疗措施，对中枢神经系统损伤所引发的一系列病理转变过程(继发性损伤)，尤其是对TBI所介导的神经炎症反应的治疗，则大多选择姑息性支持疗法，无法从根源上对其进行有效扼制，这一直是TBI救治策略上的阿喀琉斯之踵，也是近年来TBI治疗道路上亟待解决的热点问题之一。因此，深入探究TBI后神经炎症反应的发病机制，寻找神经炎症反应的关键调控因素，发现新的保护与治疗策略，将有助于降低TBI患者死亡率和致残率，对改善患者生存预后具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述问题，发明人意外发现含笑内酯及其衍生物可以通过抑制创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。
一方面，本发明涉及一种下列通式所示的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗创伤性颅脑损伤药物中的用途，其中含笑内酯或其衍生物选自如下的化合物：
其中：
R1为氢或C1-8酰基，四氢吡咯甲酰基，四氢呋喃甲酰基，Ar-C1-4酰基，Ar-O-C1-4酰基，Ar-S-C1-4酰基，Y-N-C1-4酰基；其中C1-8酰基优选自直链或支链烷酰基、烯酰基和炔酰基；
Ar为芳基或取代芳基；Y为杂环芳基或取代杂环芳基；Ar优选自苯基、苯甲酰基、萘基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、异恶唑基、异噻唑基、吡唑基、恶唑基、噻唑基、咪唑基、哒嗪基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基、苯并恶唑基、苯并噻唑基等；Y优选自尿嘧啶基、四氢异喹啉基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基。R2为C1-7酰基，C1-6烷基；其中，C1-7酰基优选自于乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基，氯乙酰基，苯甲酰基等；C1-6烷基优选自于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，环戊基，环己基等；或者R1＝R2；
R3、R4合并为双键，或者R3为氢，R4为-CH2NR5R6，其中R5和R6分别为C1-4烃基。
在本发明的另一实施方案中，本发明涉及如上所示的含笑内酯或其衍生物药学上可接受的盐在制备用于治疗创伤性颅脑损伤药物中的用途，其中所述的含笑内酯或其衍生物为盐酸盐、硫酸盐、溴酸盐、富马酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐等。
在另一优选的实施方案中，含笑内酯或其衍生物成盐化合物中的含笑内酯或其衍生物的结构如式(I)或式(II)所示。其中，式(I)所示的化合物为含笑内酯(MCL)，而式(II)所示的化合物为含笑内酯(MCL)二甲氨基迈克尔加成化合物ACT001。
在另一更优选的实施方案中，所述用途中的含笑内酯或其衍生物为盐酸盐或富马酸盐化合物，其结构式如下所示：
其中，ACT001的成盐化合物例如ACT001富马酸盐(式V)可在正常生理环境下缓慢而稳定的释放ACT001(式II)，ACT001进一步释放药物活性成分MCL(式I)。
另一方面，本发明意外发现含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗创伤性颅脑损伤药物中的用途，具体机制主要是含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐通过抑制创伤性颅脑损伤后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。
小胶质细胞(microglia，MG)作为CNS中固有的一类免疫细胞成分，约占成年人CNS细胞总数的10％。MG自身具有显著的表型异质性，其可通过表面分子蛋白构象的改变，不断感知周遭微环境的变化，迅速做出自身功能调整，参与调控CNS的发育成熟及内环境稳态。有研究显示，MG在TBI后的神经炎症和继发性损伤中发挥着极其重要的作用，而神经炎症反应也是许多神经退行性病变的“罪魁祸首”。TBI可以导致受损颅脑组织区域内的MG急剧扩增，并从“静息态”(Resting State)向“激活态”(Activated State)转变，分泌大量炎症趋化因子。而这种短时期内“骤变”能确保MG在损伤早期高效地清除被破坏的髓鞘及轴突碎片，诱导损伤神经元进入细胞凋亡程序，促进血脑屏障的通透性并趋化外周血中的单核及巨噬细胞进入受损组织，行使其神经功能保护的关键作用。然而，有关人类及哺乳动物TBI损伤后瘢痕组织的研究提出这种由于颅脑损伤所产生的“反应性”MG甚至在伤后的第17年依然持续存在并作用于周遭神经系统微环境，这种“不受控制”且“持续性”激活的MG在TBI中后期具有显著的负性影响，极易进一步加重血脑屏障的破坏并延缓神经功能的修复。
而在众多参与MG炎症性激活的调控信号通路中，NF-κB具有着“举足轻重”的关键作用。在“静息态”MG中，NF-κB以P50和P65双亚基二聚体形式，与抑制小体IκB一同，以复合物的形式存在于细胞胞浆中。在TBI的刺激作用下，IκB抑制小体被磷酸化激活，并从NF-κB二聚体上脱落，导致NF-κB被活化裂解后向核内转移，介导炎症相关蛋白的转录翻译并诱导NLRP3炎症小体的形成，进一步促进MG炎症性反应的激活。因此，有效抑制NF-κB的活化成为缓解TBI后神经炎症反应的主要治疗靶点。
发明人通过脑外伤控制性皮层撞击(CCI，Controlled Cortical Impact)模型来构建小鼠TBI损伤模型，观察TBI造模后服用ACT001药物组小鼠颅脑皮层损伤愈合情况。ACT001药物服用时间为TBI造模后0.5h至造模后第六天，每天一次，一共七次，口饲药物(100mg/kg)。结果发现，ACT001可有效促进TBI后皮层的愈合情况，缩小损伤面积，显著改善小鼠TBI后神经行为功能评估情况。动物在体实验结果证明了ACT001可促进小鼠TBI后的神经功能修复，缓解血脑屏障破坏并减轻伤后运动功能的缺损(附图1)。此外，免疫荧光实验从细胞层面进一步证实，ACT001可缓解TBI后小鼠颅脑损伤区域小胶质细胞的过度激活，减少神经元细胞的凋亡并缓解血脑屏障的破坏；透射电镜结果显示，ACT001可促进TBI后小鼠颅脑损伤区域血脑屏障结构的恢复，改善细胞间紧密连接蛋白的功能及完整程度(附图2)。而采用集落刺激因子1受体抑制剂(CSF1R inhibitor，colony stimulating factor1receptor inhibitor，PLX5622)特异性抑制小胶质细胞的增殖，最终达到清除小鼠脑内99％以上的小胶质细胞后，ACT001在小鼠TBI模型颅脑神经功能恢复中的治疗作用受到显著抑制，这一结论更是从侧面证实，TBI后ACT001的药物作用是靶向于小胶质细胞(附图3)。
为了进一步探讨ACT001对小胶质细胞治疗作用的深入机制。发明人在体外分离培养大鼠原代小胶质细胞(Rat源)以及小鼠小胶质细胞体外稳定传代细胞株BV2(Mouse源)，并采用脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)激活以上两种小胶质细胞，使其从“静息态”向“激活态”转变。其后，再采用不同浓度ACT001药物处理24h，收集细胞蛋白进行免疫印迹实验。其结果显示，ACT001可有效抑制AKT/NFκB/NLRP3信号通路的激活，缓解小胶质细胞的“炎症激活”情况。紧接着，发明者使用活性ACT001-biotin探针和失活性ACT001-S-biotin探针对小胶细胞内探针结合蛋白复合物进行免疫共沉淀实验，对所收集的蛋白复合物进行银染及免疫印迹实验，通过对AKT/NFκB/NLRP3信号通路在这一分子量区域的蛋白进行检测后发现，ACT001可能与AKT蛋白具有较强的结合作用，而AKT正是NFκB活化并向核内转移的上游信号调控蛋白(图4)。此外，在分离培养的原代小胶质细胞中进行免疫荧光实验，其结果进一步证实，ACT001可有效逆转小胶质细胞内NFκB蛋白的核转位，进而抑制NFκB进入细胞核后介导下游炎症相关通路的激活，最终缓解小胶质细胞的炎症反应(图5)。根据以上数据结果，发明人认为含笑内酯衍生物ACT001可通过抑制AKT/NFκB/NLRP3信号通路来抑制小胶质细胞的炎症性激活。
基于上述的实验结果，本发明首次发现含笑内酯或其衍生物在制备用于治疗TBI药物中的用途，其通过抑制TBI后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。
在本发明另一优选的实施方案中，本申请公开了含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐在制备用于治疗TBI药物中的用途，其中所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐选自式(I)、式(II)、式(V)、式(VI)所示的化合物或其任意的组合，或包含式(I)、式(II)、式(V)或式(VI)化合物的中药提取物。
在本发明另一实施方案中，本发明提供了一种制备含笑内酯或其衍生物ACT001的方法(参考实施例1和2)，另外还可参考中国专利申请201010153701.0和201010153685.5等。式(III、IV)所示的含笑内酯衍生物的制备方法可参考中国专利申请CN201711285215.2。式(V、VI)所示的含笑内酯衍生物盐的制备方法可参考文献YinghongAn et al，Micheliolide Derivative DMAMCL Inhibits Glioma Cell Growth In Vitroand In Vivo；PLoS One.2015；10(2):e0116202。式(V)所示的含笑内酯衍生物ACT001富马酸盐的制备还可进一步参考CN201410071673.6。
本发明还提供了一种包含上述含笑内酯或其衍生物的药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
含笑内酯或其衍生物及其药学上可接受的盐用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物形式使用。该药物组合物含有0.1％-99％，优选为0.5％-90％、1％-80％或5％-50％的含笑内酯或其衍生物及其药学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
本发明的药物组合物可以制备成胶囊剂，片剂，粉剂，粒剂，糖浆或类似剂型形式口服给药，或通过注射，软膏，栓剂或类似剂型非肠胃给药。这些药物制剂可通过使用本领域熟知的辅助剂，如粘合剂，赋形剂，稳定剂，崩解剂，矫味剂，润滑剂等等以普通方法生成，也可以制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
虽然剂量随症状和病人的年龄，疾病或失调的性质及严重性和给药的途径和方式而变，但对成年病人口服给药的情况来说，含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐正常给药为每天总剂量1至1000mg，优选为5至500mg，更优选为50-150mg，可以为单剂量或者为分剂量形式给药；例如每日一次、二次或三次；对于静脉注射的情况，每天可以分一至三次给用0.1至100mg，优选为0.5至50mg的剂量。
本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐给予需要治疗的受试者。术语“受试者”包括人类和非人哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马等，优选的受试者为人类患者。
本发明首次发现含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐可用于治疗TBI，通过抑制TBI后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。含笑内酯或其衍生物能够对TBI后神经炎症反应从根源上对其进行有效扼制，这将有助于降低TBI患者死亡率和致残率，对改善患者生存预后，具有十分重要的意义。
附图说明
附图1：ACT001可促进小鼠TBI后的神经功能修复，缓解血脑屏障破坏并减轻伤后运动功能的缺损。其中：
(A)TBI后小鼠体内实验和行为测试的时间安排。ACT001药物服用时间为TBI造模后0.5h至造模后第六天，每天一次，一共七次，口饲药物(100mg/kg)。对小鼠恢复情况观察检测时间为造模后第一天至第十四天。
(B)脑外伤控制性皮层撞击(CCI，Controlled Cortical Impact)模型的造模过程。小鼠CCI模型造模装置(左)。CCI造模后局部颅骨缺损予以无菌骨蜡封闭，模拟造模后完整颅骨状态(中，箭头为无菌骨蜡)。造模14天后颅骨局部创面愈合情况(右)。
(C)不同时间点，假手术组(sham)，单纯TBI造模组(TBI)及TBI造模后服用ACT001药物组(TBI+ACT001)小鼠颅脑皮层损伤愈合情况。发明人发现，ACT001可有效促进TBI后皮层的愈合情况，缩小损伤面积。
(D)TBI造模后，不同时间点小鼠脑组织切片焦油紫染色实验结果。发明人发现，TBI+ACT001组小鼠颅脑皮层缺损情况较单纯TBI组有所缓解，ACT001可促进伤后皮层的修复。
(E)TBI造模后，不同时间点小鼠伤后脑组织Evens Blue染色实验结果。通过对损伤灶周边Evens Blue染料渗漏情况，评估血脑屏障破坏情况。发明人发现，ACT001可显著促进TBI后血脑屏障的修复效率及程度。
(F-I)TBI造模后，不同时间点小鼠运动功能缺损程度检测评分结果。发明人发现，ACT001可显著降低小鼠TBI后改良型神经缺损严重程度评分(F，mNSS，NeurologicalSeverity Score)情况、提高小鼠颅脑损伤后对侧肢体运动协调能力的恢复(G，小鼠网格实验，Grid-Walking Test)，促进伤后小鼠感觉运动协调和运动学习能力的提升(H，转棒实验，Rotarod Test)，改善伤后小鼠肢体肌肉运动及协调功能的缺失(I，悬吊实验，HangingWire Test)。*P<0.05。
附图2：ACT001可减轻TBI后小鼠颅脑损伤区域小胶质细胞的过度激活，减少神经元细胞的凋亡并缓解血脑屏障的破坏。其中：
(A)免疫荧光检测结果显示，ACT001可减轻TBI后小鼠颅脑损伤区域小胶质细胞(Iba+细胞)的过度激活(CD68+细胞)。
(B)免疫荧光检测结果显示，ACT001可减少TBI后小鼠颅脑损伤区域神经元细胞(Neun+细胞)的凋亡情况(Tunel+细胞)。
(C)免疫荧光检测结果显示，ACT001可缓解TBI后小鼠颅脑损伤区域血管内皮细胞(CD31+细胞)的破坏情况，促进血脑屏障结构中紧密连接蛋白的恢复情况(ZO-1+细胞及Occludin+细胞)。
(A)透射电镜结果显示，ACT001可促进TBI后小鼠颅脑损伤区域血脑屏障结构的恢复，改善细胞间紧密连接蛋白的功能及完整程度。
附图3：采用集落刺激因子1受体抑制剂(CSF1R inhibitor，colony stimulatingfactor1receptor inhibitor)PLX5622去除正常小鼠脑内的小胶质细胞，可明显阻碍ACT001在TBI后小鼠颅脑组织中的治疗作用。其中：
(A)TBI后小鼠体内实验和行为测试的时间安排。PLX5622的药物服用周期为：TBI造模前14天(有效去除小鼠颅脑内小胶质细胞)至造模后14天(有效抑制TBI损伤后小胶质细胞的增生)。ACT001药物服用时间为TBI造模后0.5h至造模后第六天，每天一次，一共七次，口饲药物(100mg/kg)。对小鼠恢复情况观察检测时间为造模后第一天至第十四天。
(B)免疫荧光检测结果显示，TBI造模前，服用PLX5622药物14天可有效减少小鼠脑内小胶质细胞数量(B，上)。TBI造模三天后，服用PLX5622药物可有效抑制小胶质细胞的应激性增殖(中，Iba+细胞)及炎症性激活(中，CD68+细胞)。TBI造模三天后，持续服用PLX5622药物可致ACT001对小胶质细胞作用的明显减弱。
(C)TBI造模后，不同时间点，单纯TBI造模组(Control)，服用ACT001药物组(Veh+ACT001)及服用PLX5622及ACT001药物组(PLX+ACT001)小鼠颅脑皮层损伤愈合情况。发明人发现，服用PLX5622药物去除小鼠颅脑小胶质细胞后，ACT001对TBI后皮层的愈合治疗作用明显减弱，皮层损伤面积较Control组未见明显好转。
(D-G)TBI造模后，服用PLX5622及ACT001药物对小鼠运动功能缺损程度检测评分结果。发明人发现，服用PLX5622药物去除小鼠颅脑小胶质细胞后，ACT001对小鼠TBI后运动功能恢复的治疗促进作用受到显著抑制。*P<0.05。
附图4：ACT001可通过抑制AKT/NFκB/NLRP3信号通路来抑制小胶质细胞的炎症性激活。其中：
(A-B)发明人采用脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)激活原代大鼠小胶质细胞(A)及小鼠小胶质细胞体外稳定传代细胞株BV2(B)后，采用不同浓度ACT001处理24h，可有效抑制AKT/NFκB/NLRP3信号通路的激活。
(C-F)为进一步确认ACT001抑制AKT/NFκB/NLRP3信号通路激活的结合蛋白位点，发明人采用免疫共沉淀实验对ACT001结合蛋白进行深入分析。免疫共沉淀实验示意图如C所示，活性ACT001-biotin探针和失活性ACT001-S-biotin探针结构示意图如D所示。银染结果显示ACT001所结合蛋白在55-70kDa分子量区域丰度较高(E)。发明人针对AKT/NFκB/NLRP3信号通路在这一分子量区域的蛋白进行检测后发现，ACT001可能与AKT蛋白具有较强的结合作用(F)。而AKT正是NFκB活化并向核内转移的上游信号调控蛋白。
附图5：ACT001可抑制小胶质细胞内NFκB的核转位。其中：
(A)发明人采用脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)激活原代大鼠小胶质细胞(A)后，采用不同浓度ACT001处理24h，可有效抑制小胶质细胞内NFκB的核内转移情况。
具体实施方式
实施例1含笑内酯(MCL)的制备
以台湾含笑为原料，粉碎20-40目，加入萃取釜中，以无水甲醇为夹带剂，采用超临界CO2萃取，收集萃取液，回收甲醇，得萃取物，用石油醚回流脱除脂溶性杂质，再将脱脂物用低碳醇热溶，加入活性炭回流脱色，脱色液回收溶剂至适量体积，经制备液相ODS RP-C18反相柱进行纯化，以甲醇和水的混合溶液进行洗脱，浓缩对应组分，石油醚-丙酮(2:1，V/V)重结晶，得MCL产品。所述超临界CO2萃取条件为萃取温度为45-60℃，萃取压力为23-34MPa，分离釜I温度为40-50℃，压力为8-10MPa，分离釜II温度为35-40℃，压力为4-6MPa，萃取时间为2-6h。所述石油醚脱脂，加入2-5倍萃取物体积量的石油醚加热回流脱脂1-3次，离心，分离固液，得脱脂物。所述低碳醇为C1-C4醇，优选乙醇、甲醇或异丙醇。所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇体积百分比为83％，水的体积百分比为17％的混合溶液。本实验中所用MCL药物为重结晶后溶入二甲基亚砜(DMSO)，形成20mM原液分装后，储存于-80℃冰箱备用。
实施例2含笑内酯衍生物(ACT001)的制备
含笑内酯衍生物(ACT001)的制备方式：将Me2NH·HCl(1.5g,18mmol),K2CO3(5.0g,36mmol)以及CH2Cl2(100ml)室温下进行混合并形成均质溶解液。然后将MCL(300mg,1.2mmol)与均质溶解液混合，室温下混合搅拌3h。将以上反应液使用CH2Cl2进行浓缩和重悬后，利用去离子水层析分离，将所得分离液采用Na2SO4滤干。将滤干后物质用CH2Cl2(5ml)溶解并予以延胡索酸酯(0.1N)处理，使溶液pH调整至4。最后用CH2Cl2(10ml)萃取水相，经冻干得到化合物ACT001。本实验中所wwACT001药物溶于去离子水中，形成400mg/ml原液分装后，储存于-80℃冰箱备用。
实施例3小鼠控制性脑皮质撞击(CCI，Controlled Cortical Impact)模型的创建
雄性C57BL/6J小鼠(由上海斯莱克实验动物有限公司提供，8～10周龄，体重20-25g)。0.6％戊巴比妥溶液，80mg/kg，腹腔注射麻醉小鼠；将小鼠固定于脑立体定向仪(Stoeling Inc.USA)；在相当于人字缝与矢状缝交界处75％酒精后作正中切口，分开头皮，剥离骨膜；在右侧冠状缝和人字缝之间、中线旁开1.5-2mm处颅骨钻孔，骨窗直径约4mm，暴露完整硬脑膜；应用PinPointTMPCI3000精细颅脑撞击仪(Hatteras Instruments Inc.USA)设定打击参数，使用直径为3mm的打击头精确撞击小鼠脑皮质。其中，实验打击深度为1.5mm；打击时间均为100ms；打击速度均为1.5m/s。致伤后棉球止血，骨蜡封闭颅骨缺损，6-0丝线缝合头皮。37℃温控毯保温至小鼠完全苏醒。假手术组麻醉后暴露骨窗，不打击脑皮质，随即还纳骨瓣，缝合头皮(附图1A-B)。
实施例4含笑内酯衍生物(ACT001)给药方式及小鼠颅脑组织样本收集
TBI模型完成后0.5h，予以ACT001水溶液口饲，使用剂量要求为100mg/kg，每天服用一次，连续口饲7天(TBI后第0天至第6天)。对照组小鼠予以口饲同等量去离子水(附图1A)。完成实验后取脑流程：小鼠麻醉后开胸，暴露充分以利于心脏穿刺及剪开右心耳。心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。先灌注生理盐水约100ml，待小鼠两前肢及两肺变白，改灌注4％多聚甲醛。灌注成功的标志为：刚开始灌注时小鼠前肢剧烈抽动，前肢及颈部僵硬。灌注完成后，剪开皮肤暴露头及颈段，从颈椎处剪断颈髓；分离除去后颈部肌肉；用弯钳仔细剔除颅骨，分离颅骨时注意硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织；取脑时从延髓开始，慢慢分离颅底组织，以减少对大脑的损伤。取脑后在4％多聚甲醛中4℃过夜，然后转至30％蔗糖溶液中脱水至脑组织完全沉入液体底部，-80℃储存冻硬(附图1C及3C)。于前囟后1.5至1.9mm间做层厚30μm切片，-80℃储存备用。
实施例5焦油紫染色及Evens Blue染色
焦油紫染色：通过焦油紫染色评估TBI后，颅脑皮层受损情况评估。称取1g焦油紫粉末，加去离子水至1000ml，充分混均溶解后，冰醋酸调节pH至3.7，备用。取出-80℃储存备用的冰冻切片，置于架子上充分吹干，然后将脑片浸入焦油紫染色液中染色(具体时间根据实际情况进行调整)。完成染色后，回收焦油紫染色液，流水冲洗脑片1h左右(冲洗时间根据脑片染色程度进行调整)去除多余染色液残留。最后，取出脑片吹干，扫描仪扫描图片成像，设置分辨率为600dpi(附图1D)。
Evens Blue染色：通过测量Evens Blue染料的渗出量来评价TBI后微血管通透性的变化。将待检测小鼠予以5％水合氯醛麻醉，从颈静脉注射4ml/kg的2％Evens Blue染料，麻醉状态下体内循环2h后开胸，充分暴露心脏，止血钳夹闭主动脉，心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血，灌注40ml预冷的PBS溶液。灌注成功后取脑，以皮层损伤灶为界，做层厚2mm脑片(附图1E)。
实施例6神经行为功能评估检测
在TBI造模前及造模后1、3、5、7、14天，由研究人员采用双盲法对小鼠神经行为功能改变进行评估，评估项目及方法如下：
A、改良神经严重程度评分(mNSS，modified Neurological Severity Score，附图1F及3D)，用以评估TBI后小鼠神经行为功能综合评价系统。(评分范围从0到12，0代表正常，12代表最严重的神经缺陷)。细则如下：
/>
B、网格行走实验(Grid-Walking Test，附图1G及3E)
用于评估TBI后小鼠肢体感觉运动功能和协调性的改变。一般造模前1天进行适应训练，5min/次，重复1次。将小鼠放置于网格中央，下方放置摄像头使整个网格在视野内，计时5min/只。当肢体不提供支撑或从网洞中滑落，则被记录为一个“肢体摆放错误”。查看影像，记录小鼠步行总数，以及同侧和患侧肢体的错误次数，算出百分比。测试下一只小鼠前，需酒精擦拭网格。没有大脑损伤小鼠会把爪子精确地放在线架上，以便沿着网格移动时保持自身平衡，即便出现错误时，两侧肢体的表现是非常对称的。
C、转棒试验(Rotarod Test，附图1H及3F)
用于评估TBI后小鼠感觉运动协调和运动学习能力的改变。该测试要求小鼠在匀速旋转杆上保持平衡，并记录其在转棒上的运动时间及跌落时转棒旋转速度。在造模前连续3天训练，每天训练3次。将小鼠放在转棒上适应1min，然后开始转棒，20转/min匀速转动，训练5min。如小鼠掉下，重新放回转棒直至运动时间达到5min。训练的第3天，2次训练后做基线测试，转棒从0开始加速，直到40转/min后匀速转动，记录动物掉下的时间。若小鼠抱住转棒2圈不动，也视为掉落。造模后小鼠测试同基线测试。训练或测试后用酒精清洁仪器，擦干。
D、高空悬钢丝试验(Hanging Wire Test，附图1I及3G)
用于评估TBI后小鼠神经肌肉损伤和运动协调能力的改变。钢丝中央作为起点，当小鼠仅两前肢握住钢丝时开始计时。整个试验进行180s。小鼠爬行至钢丝任何一端末尾，或从钢丝掉落，即记录下时间。重新将小鼠悬至钢丝中央开始试验。试验中需记录小鼠每一次到达或掉落及其时间点。【通过后肢站立，面朝下；在钢丝上保持平衡——需要放回原始位置，继续开始】结果计算：①“掉落”分从10分开始记，每掉落一次减一分；“到达”分从0分开始记，每到达末端一次加一分。最终记录“掉落”与“到达”的平均分数。②记录小鼠最长悬挂时间或平均悬挂时间。
实施例7免疫荧光染色。
将-80℃储存备用的脑片予以抗原修复，100％冰甲醇预处理10min后，1％牛血清白蛋白(BSA)抗原封闭1h。然后，一抗4℃共孵育过夜，荧光二抗37℃孵育1h，最后DAPI进行细胞核染色，荧光显微镜下拍摄。抗体试剂使用如下(附图2A-C、附图3B、附图5A)：
试剂名称 公司 货号
Rat Anti-CD68 for IF Bio-RAD,USA MCA1957
Mouse Anti-CD68for IF Bio-RAD,USA MCA341
Goat Anti-Iba1 for IF Novusbio,USA NB100-1028
Rabbit Anti-Neun for IF Abcam,USA ab177487
Goat Anti-CD31for IF Bio-RAD,USA AF3628
Rabbit Anti-ZO-1for IF Thermo Fisher,USA 61-7300
Rabbit Anti-Occludin for IF Thermo Fisher,USA 40-4700
Mouse Anti-NFκB for IF Cell Signaling Technology,USA 6956
DAPI Thermo Fisher,USA D1306
AF488Donkey anti-Rat Thermo Fisher,USA SA5-10026
AF488Donkey anti-Mouse Thermo Fisher,USA A-21202
AF555Donkey anti-Goat Thermo Fisher,USA A-21432
AF488Donkey anti-Rabbit Thermo Fisher,USA A-21206
AF555Donkey anti-Goat Thermo Fisher,USA A-21432
实施例8TUNEL细胞凋亡评估实验。
采用一步法TUNEL细胞凋亡试剂盒对TBI后小鼠脑组织内凋亡细胞进行检测。具体实验方法同免疫荧光类似。将-80℃储存备用的脑片予以抗原修复，100％冰甲醇预处理10min后，1％牛血清白蛋白(BSA)抗原封闭1h。然后与TUNEL细胞凋亡试剂混合液37℃孵育1h，最后DAPI进行细胞核染色，荧光显微镜下拍摄(附图2B)。
实施例9透射电镜分析评估TBI后小鼠血脑屏障改变。
切取不同时间点小鼠损伤灶周边及中心区域新鲜脑组织，用2.5％戊二醛在PBS中固定过夜，然后用1％四氧化锇(pH 7.4)在室温下固定2小时。然后将组织颗粒在分级乙醇系列中脱水，并用Spurr树脂浸润以嵌入组织。然后样品在60℃下聚合48小时，在切片机上切成60纳米厚的切片，放置在200网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜下，120kV加速电压下进行透射电镜观察并获取图像(附图2D)。
实施例10集落刺激因子1受体抑制剂PLX5622的给药方法。
为了进一步明确ACT001的药物作用是否靶向小胶质细胞，发明者拟采用清除颅脑小胶质细胞后的小鼠TBI模型予以ACT001药物治疗，观察其治疗效果。
根据以往文献报道的结果，集落刺激因子1受体抑制剂PLX5622能特异性抑制小胶质细胞的增殖，连续服用14后可达到清除脑内95％以上的小胶质细胞。采用小胶质细胞缺失的小鼠予以TBI造模后，服用ACT001药物治疗，观察ACT001的疗效是否会因小胶质细胞的缺失而受到影响。
PLX5622药物从Plexxikon Inc.公司购买后，与啮齿类动物专用饲料AIN-76A进行预混，使PLX5622药物浓度含量保持在1200ppm。将饲料保存在4℃避光环境中。在TBI造模前，小鼠连续饲养含PLX5622药物的饲料14天以清除颅脑内小胶质细胞，单纯AIN-76A饲料作为对照。TBI造模后，继续予以含PLX5622药物的饲料进行饲养，直至实验结束(附图3A)。
实施例11小鼠小胶质细胞株BV2的培养及大鼠原代小胶质细胞的获取。
从出生1-3天的Sprague-Dawley大鼠的皮质中分离获取大鼠原代小胶质细胞。首先，将大鼠脑组织从颅骨中取出，在显微镜下剥离脑膜后，将皮层组织分离出来。再用0.25％胰酶在37℃下消化20min，然后放入0.01％聚的培养瓶中培养2周(配方同BV2细胞株培养方案)。分离原代后1天更换培养基，随后每2-3天更换一次。待细胞进入对数生长期后，在37℃旋转摇床上180rpm摇晃30分钟分离小胶质细胞，将上清液移出，继续予以培养过夜，让细胞充分贴壁后经Iba1染色，纯度大于97％则予以LPS处理后诱导激活，收集细胞，进行后续实验(附图4A)。
将小鼠小胶质细胞株BV2培养在含有10％热灭活胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素/链霉素的完全Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)中，置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中培养，待细胞进入对数生长期后，予以LPS处理后诱导激活，收集细胞，进行后续实验(附图4B)。
实施例12蛋白免疫印迹实验检测相关蛋白表达。
用细胞裂解缓冲液提取细胞裂解液，并用增强BCA蛋白分析试剂盒对裂解液中的蛋白浓度进行定量。每孔上样量约为30-50ug蛋白，并用彩色预染蛋白质分子量标准以判断分子量大小。电泳仪80V冰上电泳30min，待样品到达分离胶时再将电压调至120V60min，至溴酚蓝到达胶的底部，停止电泳并将分离胶切下，根据凝胶大小剪一块PVDF膜(预先用甲醇浸泡15s至半透明状)和两张滤纸，将其浸入转膜缓冲液中，制作排列为(-)极/海绵垫/滤纸/凝胶/PVDF膜/滤纸/海绵垫(+)的三明治结构，放入转膜槽中，恒流170mA电转120min。转膜结束后，将PVDF膜浸入封闭液中(含5％脱脂牛奶的TBST)，室温孵育2h，然后用TBST洗涤3遍，每次l0min，之后用5％BSA以适当比例稀释的一抗4℃孵育过夜；次日，抗体回收，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；加入二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次l0min，而后进行ECL显色反应。抗体试剂使用如下(附图4A-B及4F)：
实施例13免疫共沉淀实验检测ACT001结合蛋白。
细胞裂解，离心，收集上清液(1.5mg/mL)，平均分为3个样品，用于免疫共沉淀试验(附图4C)。其中一个上清样品作为input组进行标准化参照。其余两种样品分别用活性ACT001-biotin探针和失活性ACT001-S-biotin探针(浓度为100μM)在RIPA缓冲液中4℃孵育过夜(附图4D)。然后采用磁珠分选获取结合蛋白，SDS-PAGE分离蛋白，采用银染和Western blot观察结合蛋白的分子量并初步探索可能的靶向蛋白(附图4E)。

Claims (23)

1.含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备用于治疗创伤性颅脑损伤药物中的用途，其中含笑内酯如式(I)所示，含笑内酯衍生物如式(II)所示，
其中：式(I)所示的化合物为含笑内酯(MCL)，而式(II)所示的化合物为含笑内酯(MCL)二甲氨基迈克尔加成化合物ACT001。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物的盐为盐酸盐、硫酸盐、溴酸盐、富马酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物的盐为盐酸盐或富马酸盐化合物，其结构式如下所示：
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯衍生物DMAMCL富马酸盐(式V)可在正常生理环境下缓慢而稳定的释放ACT001(式II)，ACT001进一步释放药物活性成分MCL(式I)。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐通过抑制创伤性颅脑损伤后小胶质细胞的炎症效应，减轻血脑屏障的破坏及神经元的凋亡坏死，最终达到缓解创伤后颅内进展性出血，促进神经功能修复的作用。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐选自式(I)、式(II)、式(V)、式(VI)所示的化合物或其任意的组合，或包含式(I)、式(II)、式(V)或式(VI)化合物的中药提取物。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物为药物组合物，其包括治疗有效量的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物含有0.1％-99％的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物含有0.5％-90％含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物含有1％-80％的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物含有5％-50％的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
12.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物制备成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂或糖浆剂型形式口服给药，或通过注射、软膏或栓剂剂型非肠胃给药。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物通过辅助剂粘合剂、赋形剂、稳定剂、崩解剂、矫味剂或润滑剂以普通方法生成，或制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐正常给药为每天总剂量1至1000mg。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐正常给药为每天总剂量5至500mg。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐正常给药为每天总剂量50-150mg。
17.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐为单剂量或者为分剂量形式给药。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐给药形式为每日一次、每日二次或三次。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐给药形式为静脉注射，每天分一至三次给药0.1至100mg。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于：所述的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐给药形式为静脉注射，每天分一至三次给药0.5至50mg的剂量。
21.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：将治疗有效量的含笑内酯或其衍生物、或其药学上可接受的盐给予需要治疗的受试者，所述的受试者包括人类和非人哺乳动物。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物为非人灵长类。
23.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物为绵羊、犬、猫、牛和马。
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