CN103191103A - 乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，尤其是指一种乙醛脱氢酶激活物alda-1的制备工艺及其应用；本发明的乙醛脱氢酶激活物alda-1可用于治疗脑组织神经病，尤其是对脑缺血再灌注的保护作用。本发明的乙醛脱氢酶激活物alda-1可与药用辅料一定比例混合后制成任何一种内服制剂，每单位制剂单位的剂量为5～500mg。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域；本发明提供一种乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成工艺；本发明还提供了该化合物的新用途和给药方式，包括对脑缺血再灌注的保护作用，扩大了alda-1适应症范围。通过药代特点，改善该化合物的给药途径。
背景技术
脑血管病是严重危害人类健康的常见和多发病，在全球已成为第一致残和第三致死的原因，缺血性脑血管病的发病率约占脑血管病的75%。目前公认有效的方法是溶栓治疗，但受溶栓治疗的时间窗和治疗条件所限，仅约3%的患者能进行该项治疗，而且溶栓治疗虽然可以建立缺血区的血流再灌注，但不能解决缺血引起的脑组织再灌注损伤。因此寻找有效的干预脑缺血损伤的主要环节，减轻缺血区的神经损伤、恢复受损神经的功能是人们研究的热点问题。
血脑屏障是大脑中将脑细胞和脑脊液与血液隔离的一层屏障,虽然这道屏障保护着大脑,但它也同样阻止了大多数药物达到脑细胞。alda-1是一类全新的化合物，化学名N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide）分子式：C15H11C12NO3，分子量为324.16。Chen及其同事在研究啮齿类心肌梗塞动物模型时发现，如果Alda-1的小分子物质在缺血性事件发生之前应用于大鼠，其梗塞的面积减少了60%；
（Chen CH,Budas GR,Churchill EN,Disatnik MH,Hurley TD,Mochly-Rosen D.Activationof aldehyde dehydrogenase-2reduces ischemic damage to the heart.Science.2008Sep12;321(5895):1493-5.）最近有学者在糖尿病心肌病中发现，小分子alda-1对链脲佐菌素造模的糖尿病大鼠心肌细胞具有重要的保护作用，阻止心肌病的发生。
（Zhang Y,Babcock SA,Hu N,Maris JR,Wang H,Ren J.Mitochondrial aldehydedehydrogenase(ALDH2)protects against steptozotocin-induced diabetic cardiomyopathy:role ofGSK3beta and mitochondrial function.BMC Med.2012;10(1):40.）
目前adla-1的心脏保护作用的动物实验已有报道，但几乎所有大分子和95%小分子药物很难透过血脑屏障，不能有效地进入大脑及中枢神经系统，adla-1能否用于保护脑血管损伤的研究尚未见文献报道。此外，新化合物alda-1报道极少，主要研究alda-1抗氧化作用与心肌保护有关，内服制剂药能否通过血脑屏障到达脑内，尚未有研究。
本发明通过合成小分子物质alda-1，在获得该化合物基础上，开发内服制剂，观察alda-1在体内的分布代谢，及对脑缺血-再灌注损伤的保护作用，扩大其适应症范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法及其用途，并通过药代特点，口服途径给药，观察其对脑缺血再灌注损伤的保护作用，扩大alda-1的治疗领域和用途。
所述乙醛脱氢酶激活物alda-1的化学名：N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide）；分子式：C15H11C12NO3，
所述乙醛脱氢酶激活物alda-1的分子量：324.16。
所述乙醛脱氢酶激活物alda-1的结构式为：
乙醛脱氢酶激活物alda-1的用途，用于制备减轻脑缺血再灌注损伤的口服药。
所述的口服药由乙醛脱氢酶激活物alda-1与药用辅料混合后制成。
所述的口服药每单位制剂单位的剂量为5～500mg。
乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法，在装有磁力搅拌的500ml圆底烧瓶中加入胡椒基胺8.50g，加入N，N’—二甲基甲酰胺100ml，冰水浴冷却搅拌10分钟，加入2,6-二氯苯甲酸11.77g，二环己基碳二亚胺12.95g，1-羟基苯并三唑1.52g，继续搅拌30分钟，撤去冰水浴，室温搅拌12小时；薄层色谱检测2,6-二氯苯甲酸转化完毕，冰水浴冷却搅拌1小时，过滤，滤饼用冰冷的DMF20ml洗涤，合并滤液和洗液，转移到1000ml带机械搅拌的三口圆底烧瓶中，在2小时内滴入去离子水600ml，滴加完毕，继续搅拌1小时，过滤，滤饼用去离子水500ml分5次洗涤，然后在60℃烘箱干燥5小时，即可。
本发明的有益之处是：（1）简化了alda-1的合成路径；（2）扩大了alda-1的适应症，可适用于脑缺血再灌注损伤；（3）与注射给药方式相比，本发明采用口服给药，操作简单，刺激性小，增强病人的依从性。
附图说明
图1为alda-1核磁共振结构确证图；
图2，A-大鼠神经学功能评分，B-生存/死亡；C-梗死面积D-大鼠脑组织TTC染色
图3，A-乙醛脱氢酶(ALDH2)的活性统计图，B-ALDH2的western blot结果图；
C-aldaalda-1对ALDH2酶活性影响检测结果比较；
图4，A-ELISA法测定alda-1对4-HNE含量影响比较,B-比色法测定alda-1对MDA含量影响比较；
图5，alda-1对凋亡相关指标caspase-3活性影响比较。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：alda-1的合成
在装有磁力搅拌的500ml圆底烧瓶中加入胡椒基胺8.50g（56.2mmol），加入N，N’—二甲基甲酰胺（DMF）100ml，冰水浴冷却搅拌10分钟，加入2,6-二氯苯甲酸11.77g（61.6mmol），二环己基碳二亚胺（DCC）12.95g（62.8mmol），1-羟基苯并三唑HOBT）1.52g（11.3mmol），继续搅拌30分钟，撤去冰水浴，室温搅拌12小时。薄层色谱检测2,6-二氯苯甲酸转化完毕，冰水浴冷却搅拌1小时，过滤，滤饼用冰冷的DMF20ml洗涤，合并滤液和洗液，转移到1000ml带机械搅拌的三口圆底烧瓶中，在2小时内滴入去离子水600ml，滴加完毕，继续搅拌1小时，过滤，滤饼用去离子水500ml分5次洗涤，然后在60℃烘箱干燥5小时，得类白色结晶粉末18.56g。熔点172.8-174.0度。
图1alda-1核磁共振结构确证。’H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.59(d,2H),5.95(S,2H),6.77(d,J=8Hz,1H),6.84(dd,J1=8Hz,J2=0.8Hz,1H),6.90(d,J=0.8Hz,1H),7.26(dd,1H),7.30～7.33(m,2H)。
实施例2alda-1压片制备
表1制备alda-1压片所用原料及压制1000片所用的剂量
制备工艺：将alda-1、微晶纤维素、交联聚维酮和硬脂酸镁混合均匀后压片即得。
实施例3：动物实验
大鼠灌胃alda-1后不同时间全身组织的分布
表2大鼠灌胃alda-1后不同时间各组织药物含量的变化
(ng当量/g或mL，平均数±SD,n=5)
大鼠灌胃alda-1后不同时间总放射性的分布见表2。灌胃alda-1后不同时间血浆与几种重要组织总放射性的分布，按含量排序由大到小依次为：血浆，肾，心脏，肝、脑。脾脏、肌肉、脂肪和骨髓较少。
Alda-1对脑缺血再灌注损伤的保护作用
实施药品：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购于上海山浦化工有限公司。
实施例1制备的alda-1化合物，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作为溶媒制成混悬液。
实验动物：体重250～300g的健康雄性SD大鼠48只。
建模方法：用脑中动脉阻塞（MCAO）法制备大鼠脑缺血再灌注模型。步骤如下：(1)分离颈外动脉(CCA),向上分离右颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA)；(2)用眼科镊暂时夹闭ECA和ICA，并结扎CCA近心端；(3)于CCA远心端放置一打好结的备用丝线，在此线下端剪一小口,将栓线插入至颈内动脉，收紧丝线，放开ECA和ICA上的动脉夹，顺ICA将栓线送至颅内；(4)遇阻力而止,从CCA分叉处算起，插入深度约为18～20mm；(5)缺血120min后，将栓线拔出，缝好皮肤，再灌注24h后处理动物。
模型成功评判标准采用Longa“5分法”对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～4分为有效模型。
大鼠脑TTC染色和梗死体积测定。大鼠麻醉后，迅速将脑取出，去掉嗅球及后脑，从额极开始切取4张冠状脑片，厚约2.0mm，立刻置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30min。然后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死区呈现白色，非梗死区呈现红色。将每组脑片排列整齐后进行扫描。再应用ImageJ测出各脑片的梗塞面积，根据公式：梗死体积=[（各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和）/2]×每片厚度,同样方法计算出全脑体积。
实验分组：将实验动物随机分为6组，即：
对照组（control组）：不做任何处理。
假手术组（sham组）：将栓线插到脑中动脉分叉处即停。
脑缺血再灌注模型组（CI/R组）：脑缺血2h，再灌注24h。
低剂量alda-1+脑缺血再灌注模型组（alda(L)+CI/R）：手术前1h和手术后4h灌胃aldaalda-1(alda-1用0.5%羧甲基纤维素钠做成混悬液，alda-1用量：1mg/kg)。
高剂量alda-1+脑缺血再灌注模型组（alda(H)+CI/R）：手术前1h和手术后4h灌胃alda-1(alda-1用0.5%羧甲基纤维素钠做成混悬液，alda-1用量：5mg/kg)。
溶媒+脑缺血再灌注模型组(vehicle+CI/R)：手术前1h和手术后4h灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（10ml/kg）。
试验方法：将实验动物在温度25℃、相对湿度60%、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后按实验各分组要求口服给药。收集脑组织并测定以下指标：（1）大鼠神经功能评分和梗死体积测定；（3）ALDH2酶活性检测（比色法）及蛋白表达（western blot法）；（4）测定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）和4-羟基壬烯酸（4-Hydroxynonenal，HNE）的水平；（5）凋亡相关指标caspase-3活性测定。
实验结果
alda-1对大鼠脑梗死体积及神经功能的影响
如图2中的A所示，脑缺血模型组（CI/R）大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而alda-1低剂量和高剂量给药组可以明显改善神经功能缺损症状，有统计学差异(p<0.01)，同时alda-1低剂量和高剂量组可明显降低脑缺血引起大鼠的死亡（图2-B）。图2-C和2-D所示，CI/R组有明显的白色梗死灶，而alda-1(L)和alda-1(H)组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤。
alda-1对ALDH2活性及蛋白表达的影响
图3所示，给予alda-1后，可以显著提高ALDH2的活性（图3-A），而alda-1(L)和alda-1(H)对ALDH2的蛋白表达却没有影响（图3-B），说明alda-1是通过提高ALDH2的活性发挥作用的。
alda-1对4-HNE和MDA的影响
CI/R组大鼠脑组织的4-HNE和MDA水平明显升高（图4-A和4-B），而用alda-1干预后，不论是alda-1(L)还是alda-1(H)都可以显著下调4-HNE和MDA的水平，从而减弱脂质过氧化水平，缓解脑缺血再灌注损伤。
Alda-1对凋亡相关酶caspase-3的影响。
图5所示，alda-1(L)和alda-1(H)都可以显著减弱由CI/R引起的caspase-3活性的增强，从而减少缺血引起的神经元的凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤。
上述实施例发现alda-1通过提高ALDH2的活性而减轻脑缺血再灌注损伤，改善神经功能缺损症状，同时调控与凋亡、脂质过氧化相关的一些因子的含量和水平，控制损伤的进一步恶化，为治疗脑缺血再灌注损伤提供新的思路。
Claims (7)
1.一种乙醛脱氢酶激活物alda-1的用途，其特征在于，用于制备减轻脑缺血再灌注损伤的口服药。
2.根据权利要求1所述的乙醛脱氢酶激活物alda-1的用途，其特征在于，所述的口服药由乙醛脱氢酶激活物alda-1与药用辅料混合后制成。
3.根据权利要求2所述的乙醛脱氢酶激活物alda-1的用途，其特征在于，所述的口服药每单位制剂单位的剂量为5～500mg。
4.一种用于减轻缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，是含有乙醛脱氢酶激活物alda-1的口服药。
5.根据权利要求4所述的一种用于减轻缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，所述的口服药由乙醛脱氢酶激活物alda-1与药用辅料混合后制成。
6.根据权利要求4所述的一种用于减轻缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，所述的口服药每单位制剂单位的剂量为5～500mg。
7.乙醛脱氢酶激活物alda-1的合成方法，其特征在于，在装有磁力搅拌的500ml圆底烧瓶中加入胡椒基胺8.50g，加入N，N’—二甲基甲酰胺100ml，冰水浴冷却搅拌10分钟，加入2,6-二氯苯甲酸11.77g，二环己基碳二亚胺12.95g，1-羟基苯并三唑1.52g，继续搅拌30分钟，撤去冰水浴，室温搅拌12小时；薄层色谱检测2,6-二氯苯甲酸转化完毕，冰水浴冷却搅拌1小时，过滤，滤饼用冰冷的DMF20ml洗涤，合并滤液和洗液，转移到1000ml带机械搅拌的三口圆底烧瓶中，在2小时内滴入去离子水600ml，滴加完毕，继续搅拌1小时，过滤，滤饼用去离子水500ml分5次洗涤，然后在60℃烘箱干燥5小时，即可。
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