CN103181895A

CN103181895A - 一种提高畜禽免疫功能的甘草次酸纳米脂质体及其制备方法

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Publication number: CN103181895A
Application number: CN2011104483746A
Authority: CN
Inventors: 王德云; 赵晓娟; 胡元亮; 刘家国; 范云鹏; 袁菊
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2013-07-03

Abstract

本发明涉及一种提高畜禽免疫功能的甘草次酸纳米脂质体及其制备方法，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。用薄膜分散法制备甘草次酸纳米脂质体，以包封率为指标，采用响应面法研究了脂药比、膜材比和水浴温度3个因素并对其进行优选，确定最佳制备条件为：脂药比为9.0∶1，膜材比为2.5∶1，水浴温度为31℃，所得甘草次酸纳米脂质体的包封率高，免疫增强活性强。本发明甘草次酸纳米脂质体显著提高了甘草次酸的免疫增强活性。

Description

一种提高畜禽免疫功能的甘草次酸纳米脂质体及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，及其提高畜禽免疫功能的应用，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。

二、背景技术

甘草是一味最常用的补气药，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药等功效，在多种疾病防治中起到重要作用。甘草次酸作为甘草的主要有效成分，主要从甘草的根部或根茎提取而得，属五环三萜皂苷类化合物。现代研究表明甘草次酸具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、肾上腺皮质激素样作用等多种药理作用。但由于甘草次酸难溶于水，常规的给药方式，如口服、皮下注射、静脉注射等，甘草次酸几乎不能被吸收，生物利用度非常低，这样大大降低了甘草次酸的临床应用价值。同时，甘草次酸会产生钠潴留、钾流失、高血压等不良副作用，而且这些副作用可能存在剂量依赖关系。因而，研究甘草次酸新剂型，提高其生物利用度，减小其不良副作用就变得非常必要。

脂质体是由类脂质制备的具有复层或单层单位膜结构的小囊，其结构类似生物膜，在体内能生物降解。由于脂质体成份为磷脂和胆固醇，也是生物细胞膜的主要成分，属机体内源性物质，具有良好的生物相容性和可降解性，无毒、无免疫原性。脂质体的结构和生物细胞相似，易被细胞吸附、融合、脂交换、内吞而被细胞摄取；且具有一定的弹性和变形性，比相同粒径的其他类型的纳米粒容易进入病灶组织。因此，脂质体已成为现代药物载体研究的内容之一。同时脂质体还可用作免疫佐剂，早在1974年由Allison等首次报道脂质体能增强机体的体液和细胞介导的免疫应答，对疫苗的增效作用可达数十倍甚至更高。

脂质体具有靶向释药、缓释、无免疫原性、降低药物毒副作用等优势。脂质体是微米级类脂质双分子层结构，大小于1～100μm之间。如果在脂质体的类脂质双分子层中加入适当表面活性剂，则可形成纳米脂质体。纳米脂质体除粒径小于普通脂质体外，还具有高度的自身变形性，更易于提高其生物利用度。如将甘草次酸包封于脂质体中，脂质体不仅可以避免甘草次酸的不良副作用，而且可以有效维持甘草次酸在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度。因而脂质体可以作为甘草次酸的一种优良载体。

本发明首次将甘草次酸制备成纳米脂质体，并将其和动物疫苗一起应用，建立了甘草次酸纳米脂质体的制备方法，优化了制备条件，发现甘草次酸纳米脂质体能显著提高甘草次酸的免疫增强作用，提高其生物利用度。

三、发明内容

技术问题本发明针对甘草次酸水溶性低、不易被吸收、易产生不良反应，生物利用度低等问题，提供一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，达到显著提高甘草次酸免疫增强作用目的，并应用于畜禽临床。

技术方案

用薄膜分散法及响应面法设计甘草次酸纳米脂质体的制备方法。经优化后甘草次酸纳米脂质体最佳制备方法为：称取大豆磷脂150mg、胆固醇60mg、吐温-80 75mg和甘草次酸16.7mg，加入10mL氯仿振摇使之充分溶解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22μm的微孔滤膜。将脂质体置于-20℃条件下冻结，之后置于31℃水浴中融化，如此反复操作两次。按此方法制备的甘草次酸纳米脂质体，平均包封率为83.46％、粒径在150nm以下。

将甘草次酸纳米脂质体和疫苗一起应用于鸡，能显著提高其细胞免疫功能和体液免疫功能，对提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要应用价值。

有益效果

动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。

甘草次酸是甘草的主要药效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、肾上腺皮质激素样等多种药理作用。但由于甘草次酸难溶于水，常规的给药方式，如口服、皮下注射、静脉注射等，甘草次酸几乎不能被吸收，生物利用度非常低，这样大大降低了甘草次酸的临床应用价值。利用脂质体包封甘草次酸，不仅可以有效维持甘草次酸在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度，而且可以避免甘草次酸的不良副作用。

本发明采用卵磷脂、胆固醇及表面活性剂吐温-80将甘草次酸制备成纳米脂质体，包封率较高、粒径小，不仅便于药物的吸收，而且可以使药物缓慢地的释放，有效地延长了药效，能显著提高动物细胞免疫功能和体液免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.甘草次酸纳米脂质体的制备国内外未见报道，本发明提供了一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白。

2.甘草次酸纳米脂质体的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明甘草次酸的免疫增强作用弱，通过制备成纳米脂质体后能够显著提高其免疫增强活性，表现为明显提高抗体效价、淋巴细胞增殖、IgG和IgM含量、淋巴细胞亚群CD4+和CD8+比率，与甘草次酸比，在免疫后期效果更好，具有较强的缓释作用，从而增强动物体液免疫和细胞免疫。因此，甘草次酸纳米脂质体可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。

四、具体实施方式

1.甘草次酸纳米脂质体的制备

采用薄膜分散法制备甘草次酸脂质体。精密称取大豆磷脂、胆固醇、吐温-80和甘草次酸，加入10mL氯仿振摇使之充分溶解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22μm的微孔滤膜。将脂质体置于-20℃条件下冻结，之后置于水浴中融化，如此反复操作两次，以提高包封率。

在单因素试验的基础上，选出对脂质体包封率有较显著影响的三个因素：脂药比(大豆磷脂与甘草次酸质量比，A)、膜材比(大豆磷脂与胆固醇质量比，B)和水浴温度(℃)。再根据脂药比、膜材比和水浴温度3个单因素试验所确定的水平范围，采用Design-Expert 7.0软件设计响应面试验，选用BBD模型，以脂质体的包封率为响应值，做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表1。由表1可见，包封率从44.32％到81.00％变化。对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得出Y与影响因素x_i之间关系的拟合方程式如下：

Y＝80.33-7.83x₁+5.25x₂+0.76x₃-1.32x₁x₂-7.29x₁x₃+3.06x₂x₃-9.81x₁ ²-6.46x₂-12.40x₃ ²

表1Box-Behnken试验设计表及结果

从该模型的方差分析表2可知，本试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(Pmodel＜0.0001)，失拟项的P＝0.0623＞0.05不显著；模型中的x₁(脂药比)、x₂(膜材比)、x₁x₃(脂药比和水浴温度交互作用)、x₂x₃(膜材比和水浴温度交互作用)的“P”值均小于0.05，说明其对脂质体包封率有显著影响；相关性R²＝0.9960，校正决定系数R_Adj ²＝0.9909，仅有约1％的脂质体包封率总变异不能由此模型进行解释。综上表明，此模型拟合度好。

表2响应面模型方差分析表

注：P表示大于F值的概率。P＜0.05，说明对应的因素对响应值的影响显著，用*表示；P＜0.01，说明对应的因素对响应值的影响显著，用**表示；P＜0.0001，说明对应的因素对响应值的影响极显著，用***表示。

对脂药比、膜材比和水浴温度3个因素单独作用以及两两交互作用对脂质体包封率的影响进行研究后，由Design-Expert软件对制备条件做进一步优化，得到最佳制备条件组合：脂药比为8.950∶1，膜材比为2.520∶1，水浴温度为31.250℃，包封率可获得83.85％的预测值。考虑到工业生产的需要，简化最佳制备条件为：脂药比为9.0∶1，膜材比为2.5∶1，水浴温度为31℃。在最佳制备条件下制备的甘草次酸纳米脂质体平均包封率为83.46±0.55％，与理论值83.85％仅有0.47％的相对误差。说明该回归方程与实际情况拟合较好，表明用响应面法对甘草次酸脂质体制备的研究是合理可行的。

2.甘草次酸纳米脂质体免疫增强活性比较

以根据最佳制备条件制备的甘草次酸纳米脂质体(GAL)为研究对象，以甘草次酸(GA)和空白纳米脂质体(BL)作为对照，测定了它们对鸡新城疫(ND)疫苗免疫后机体抗体效价、淋巴细胞增殖、IgG和IgM含量、淋巴细胞亚群CD4+和CD8+比率的影响。

(1)动物分组及处理

350只14日龄雏鸡随机均分为7组，分别为GAL的高、中、低剂量组、GA组、BL组、疫苗组(VC)和空白对照组(BC)。14日龄时，除空白对照组外均用NDV-IV系疫苗免疫，28日龄二免。在首次免疫的同时，1～5组分别肌肉注射相应药物，0.5mL/只，疫苗组和空白对照组注射等量生理盐水。分别于首免前和首免后7、14、21、28、35、42d检测外周血T淋巴细胞增殖的动态变化、血清HI抗体效价和IgG和IgM含量，于首免后21、28、35、42d检测淋巴细胞亚群CD4+和CD8+比率的变化。

(2)甘草次酸纳米脂质体对抗体效价的影响

首次免疫后第7天，GAL_H，GAL_M和GA组的抗体效价均显著高于GAL_L，BL和VC组(P＜0.05)。首免后第14天，GAL_H和GAL_M组的抗体效价除VC组外，均显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第21天，GAL_M组的抗体效价均显著高于其他组(P＜0.05)；同时，GAL_H组的抗体效价除VC组外，均显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第28天，GAL_M组的抗体效价显著高于其他组(P＜0.05)；同时，GAL_H组的抗体效价除GAL_M和GAL_L组外，也显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第35天，GAL_H和GAL_M组的抗体效价均显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第42天，GAL_H和GAL_M组的抗体效价均显著高于其他组(P＜0.05)；同时，GAL_L和GA组的抗体效价均显著高于BL和VC组(P＜0.05)(表3)。

表3免疫反应试验中抗体效价的动态变化(Log2)

^a-d同列数据没有相同字母者差异显著(P＜0.05)；H：high dose，高剂量组；M：medium dose，中剂量组；L：low dose，低剂量组。下同。

(3)甘草次酸纳米脂质体对IgG和IgM浓度的影响

首次免疫后第14天，GAL_M，GAL_L和GA组的IgG浓度均显著大于BL，VC和BC组(P＜0.05)。首免后第21天，GAL_H，GAL_M和GA组的IgG浓度均显著大于VC组(P＜0.05)。免疫后第28和35天，GAL_H和GAL_M组的Ig_G浓度均显著大于其他组(P＜0.05)。免疫后第42天，GAL_H和GAL_M组的IgG浓度均显著大于GA，BL和VC组(P＜0.05)(表4)。

表4免疫反应试验中IgG浓度的动态变化(μg·mL^-1)

首次免疫后第14天，GAL_M和GA组的IgM浓度均显著大于BL和VC组(P＜0.05)。首免后第21天，GAL_M组的IgM浓度除GAL_H外，均显著大于其他组(P＜0.05)。首免后第28和35天，GAL_H和GAL_M组的IgM浓度均显著大于其他组(P＜0.05)。首免后第42天，GAL_H，GAL_M和GAL_L组的IgM浓度均显著大于其他组(P＜0.05)(表5)。

表5免疫反应试验中IgM浓度的动态变化(μg·mL^-1)

(4)甘草次酸纳米脂质体对淋巴细胞增殖的影响

首次免疫后第7天，GAL三个剂量组和GA组的A₅₇₀值均显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第14天，GAL_M和GA组的A₅₇₀值均显著高于其他组(P＜0.05)，同时，GAL_H和GAL_L的A₅₇₀值均显著高于VC组(P＜0.05)。首免后第21天，GAL_M组的A₅₇₀值均显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第28天，GAL三个剂量组的A₅₇₀值均显著高于GA，VC和BC组(P＜0.05)。首免后第35天，GAL_M组的A₅₇₀值均显著高于其他组(P＜0.05)，同时，GAL_H，GA和BL组的A₅₇₀值均显著高于VC组(P＜0.05)。首免后第42天，GAL_M组的A₅₇₀值除均GAL_H和GAL_L外，显著高于其他组(P＜0.05)(表6)。

表6免疫反应试验中淋巴细胞增殖的动态变化(A₅₇₀ value).

(5)甘草次酸纳米脂质体对CD4+和CD4+T淋巴细胞亚群的影响

首次免疫后第21天，GAL_H组的CD4⁺T淋巴细胞的百分含量最高且显著高于GA和BC组(P＜0.05)。首免后第28天，GAL_M组的CD4⁺T淋巴细胞的百分含量最高且显著高于GAL_L，BL和VC组(P＜0.05)。首免后第35天，GAL_M组的CD4⁺T淋巴细胞的百分含量最高且显著高于GA和VC组(P＜0.05)。首免后第42天，GAL_H和GAL_M组的CD4⁺T淋巴细胞的百分含量显著高于其他组(P＜0.05)(表7)。

表7免疫反应试验中CD4+T淋巴细胞亚群的动态变化(％)

首次免疫后第21天，GAL_H组的CD8⁺T淋巴细胞的百分含量最高且显著高于GAL_L，BL和VC组(P＜0.05)。首免后第35天，GAL_M组的CD8⁺T淋巴细胞的百分含量显著高于其他组(P＜0.05)。首免后第42天，GAL_H和GAL_M组的CD8⁺T淋巴细胞的百分含量显著高于其他组(P＜0.05)(表8)。

表8免疫反应试验中CD8+T淋巴细胞亚群的动态变化(％)

根据动物试验结果可以得出甘草次酸纳米脂质体不仅可以提高鸡淋巴细胞增殖和淋巴细胞亚群CD4+、CD8+比率，从而提高细胞免疫功能，而且可以提高抗体效价和IgG、IgM含量，从而提高体液免疫功能。说明本发明涉及的甘草次酸纳米脂质体可用于提高畜禽机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。

Claims

1.一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法及响应面法设计优化制备甘草次酸纳米脂质。

(1)采用薄膜分散法制备甘草次酸纳米脂质体。精密称取大豆磷脂150mg、胆固醇60mg、吐温-80 75mg和甘草次酸16.7mg，加入10mL氯仿振摇使之充分溶解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22μm的微孔滤膜。将脂质体置于-20℃条件下冻结，之后置于31℃水浴中融化，反复2次。

(2)按照上述方法制备甘草次酸纳米脂质体的条件为：脂药比为9.0∶1，膜材比为2.5∶1，水浴温度为31℃。

(3)在最佳条件下制备的甘草次酸纳米脂质体，包封率平均值为83.46±0.55％。

2.权利要求1所述方法获得的甘草次酸纳米脂质体能够显著提高动物体液免疫和细胞免疫功能，具有较好免疫增强功能。