CN102106889A - 雪莲和雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用及其雪莲提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种雪莲和雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用及其雪莲提取物的制备方法。所述雪莲选自大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲中的一种;所述雪莲提取物为大苞雪莲提取物、水母雪莲提取物或苞叶雪莲提取物中的一种;所述雪莲提取物为雪莲的水提物或雪莲的乙醇提取物及其经系统溶剂法萃取和大孔吸附树脂法提取所得的抗缺氧有效部位。本发明通过实验发现并证明了雪莲和雪莲提取物用于抗缺氧药物的制备中,制备所得的药物具有明显的抗缺氧作用,本发明的制备方法简单,能够有效提取雪莲中的有效成份。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种以雪莲生药粉、雪莲提取物在制药中的应用。
背景技术
我国是世界上高原地域最辽阔、居住人口最多、高原边境线最长的国家。高原特有的低压缺氧环境使初到高原的人受缺氧环境的影响,出现头晕、胸闷、恶心呕吐、失眠、记忆力下降等急性高原病症状。随着西部高原经济的日益发展和军事斗争的需要,将会有越来越多的人进入高原,但高原缺氧反应严重影响人的健康和工作能力,甚至会危及生命。此外,在应对高原地区地震等自然灾情的救助行动中,高原反应也会严重影响来自军队和全国各地的救灾人员。目前临床上有效的抗缺氧药物严重不足,乙酰唑胺是迄今为止美国FDA批准的唯一用于预防急性高原反应的药物。大量研究表明,该药可明显改善大多数人的气体交换和运动效率,减轻急性高原反应,并有效治疗高原睡眠障碍,维持较高血氧饱和度。但乙酰唑胺的毒副作用十分明显,可引起四肢及面部麻木感、嗜睡等,甚至可导致肾衰。因此尚需研制副作用小的抗高原病新药。高原缺氧、寒冷和干旱的特殊环境为多种中药材的生长创造了特有环境,尤其是那些生长在海拔3000米以上的青藏高原植物,通过千百万年的进化选择,应具有特殊的基因支持,使其适应了高原缺氧、寒冷和干燥的气候环境,这种大自然生物进化的特殊产物可能对人体耐缺氧、抗疲劳和寒冷有重要的医用价值,可望从中筛选出抗高原病新药。基于上述思想,本发明人采用小鼠密闭缺氧模型从三十多种青藏高原特色植物中筛选具有抗缺氧活性的高原植物,最后确定雪莲生药粉及其提取物具有显著抗缺氧作用,活性接近或超过乙酰唑胺,可应用于制备抗高原缺氧药物。
雪莲为菊科植物绵头雪莲花Saussurea Laniceps Hand.-Mazz.、大苞雪莲又名新疆雪莲花Saussurea involucrata Kar.et.Kin、水母雪莲花Saussurea medusa Maxim.等的带花全株。雪莲作为药用始载于8世纪藏族古代药物文献《月王药珍》,其后古典《西北域记》、《西部医典》以及清代《 本草纲目拾遗》中均有记载。雪莲性温、味微苦、具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收缩子宫等功能,可治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、阳痿抗衰老及抑制癌细胞增生等症。近年来,国内对雪莲药理的研究主要集中于提高机体免疫力、祛风除湿和终止妊娠等作用,而关于其抗缺氧作用的研究较少,以其主要成分研制的抗高原缺氧药物则未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雪莲及其雪莲提取物的新用途,从而增加了雪莲的应用领域。
本发明的技术方案为雪莲及其雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用。
所述雪莲选自大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲等常被用作中药的所有雪莲原植物。
所述雪莲可以是雪莲植物的任何部位,包括雪莲植物全草或根或地上部分。
所述雪莲提取物为雪莲水提物、雪莲乙醇提取物及其经系统溶剂法萃取和大孔吸附树脂法提取所得的抗缺氧有效部位。
所述雪莲乙醇提取物是以10—100%乙醇为溶媒提取得到雪莲乙醇提取物。
本发明的雪莲提取物的制备方法如下所述:
1.系统溶剂法:①取雪莲干燥药材,粉碎,加10-15倍量浓度为0-95%(体积浓度)的乙醇溶液,在20-70℃下温浸提取,提取液过滤,减压浓缩至比重约1.40g/ml,得醇提浸膏。②将浸膏用3倍量水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/3-1倍体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,分别合并进多次萃取的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压浓缩,冷冻干燥分别得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位。
步骤①中所述的温浸提取可反复多次,至提取液颜色变淡为止。
2.大孔吸附树脂法:①将干燥、粉碎的雪莲用10-15倍量、浓度为0-95%(体积浓度)的乙醇溶液在20-70℃下温浸提取,过滤、浓缩至浸膏状;②用10-15倍量、温度为30-90℃的热水溶解上述浸膏状物,冷却、过滤除去脂溶性成分得提取液;③将提取液缓慢流过经乙醇洗脱处理过的大孔树脂柱;④ 先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂柱,再用浓度为10-95%(体积浓度)的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱,收集乙醇洗脱液、减压浓缩、真空干燥得雪莲提取物。
步骤①中所述的温浸提取可反复多次。
步骤③中,提取液流过聚酰胺柱后,用蒸馏水冲洗聚酰胺柱,并将洗脱液与所述母液混合后,再上所述大孔树脂柱。
所述雪莲提取物作为抗缺氧成分在医药上的应用:以雪莲提取物为活性成分,配以药用铺料,用公知的方法制备成药剂学上的任何一种剂型。
动物实验
1.小鼠常压密闭缺氧耐受力实验
(1)实验目的:以小鼠在常压密闭缺氧条件下呼吸停止死亡为指标,研究雪莲的耐缺氧作用。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级昆明种小白鼠,雌雄各半,8周龄,体重(20 ± 2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:红景天、大苞雪莲、水母雪莲和苞叶雪莲原药材均购自青海西宁三江宝商贸有限公司,并经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定;乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114); 250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为300 ± 3 ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产)。
(5)供试品的制备:红景天、大苞雪莲、水母雪莲和苞叶雪莲原药材碾碎,过120目筛,临用前用蒸馏水配制成50 mg/ml的混悬液浓度。
(6)实验方法与结果
①雪莲对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响
取健康小鼠60只,雌雄各半,饲养适应3d后随机分成6组:缺氧模型组、乙酰唑胺对照组、红景天对照组、大苞雪莲组、水母雪莲组、苞叶雪莲组,每组10只。灌胃给药,给药组剂量均为1g·kg-1 ·d-1,给药体积为0.4 mL·20g-1,缺氧模型组给相应量的蒸馏水,每天1次,共7 d。末次给药后1 h,将小鼠分别放入盛有5 g钠石灰的250 mL广口瓶内(每瓶只放1只小鼠),用凡士林涂抹瓶口,密封,使之不漏气,立即计时,直至呼吸停止。以小鼠在密闭广口瓶内存活时间为指标,比较各药物组耐缺氧时间。结果见表1。
表1 不同药物对密闭缺氧小鼠存活时间的影响
注:b P﹤0.05,bb P﹤0.01,与缺氧模型组相比;
c P﹤0.05,cc P﹤0.01,与红景天组相比
结果:如表1结果所示,与缺氧模型组相比,各给药组均能延长小鼠在常压密闭缺氧环境中的存活时间,且与乙酰唑胺和红景天阳性对照组的小鼠存活时间无显著性差异(P >0.05)。
②雪莲对密闭缺氧小鼠乳酸活力的影响。
同上述操作。待小鼠呼吸停止后,立即取出,摘眼球取血0.3 ml, 3500 r/m离心5 min。取血浆测定乳酸含量,测定方法参见LD试剂盒说明书,结果以mmol/L表示。结果见表2。
注:a P﹤0.05,aa P﹤0.01,与正常对照组相比;
b P﹤0.05,bb P﹤0.01,与缺氧模型组相比;
c P﹤0.05,cc P﹤0.01,与乙酰唑胺组相比;
d P﹤0.05,dd P﹤0.01,与红景天组相比
结果:如表2结果所示,与正常对照组相比,缺氧模型组小鼠血浆中乳酸含量显著升高;与缺氧模型组比较,各给药组小鼠血浆中乳酸含量均有降低趋势,其中大苞雪莲组最为明显,且与乙酰唑胺阳性对照组相比具有显著性差异(P <0.01),与正常对照组和红景天阳性对照组小鼠血浆中乳酸含量接近(P >0.05)。
(7)结论:
实验结果表明,各给药组均能延长小鼠常压密闭缺氧存活时间,且大苞雪莲组的存活时间与红景天和乙酰唑胺阳性对照组无显著性差异。在缺氧或低氧条件下,为满足机体正常的能量消耗,体内无氧呼吸会大大增强,产生大量的乳酸。如果长时间的缺氧会造成机体乳酸的大量堆积,造成代谢性酸中毒,影响机体内环境的稳定和细胞的正常代谢.由表2可见,各给药组可以明显降低绝对氧供缺乏小鼠血浆乳酸含量,且大苞雪莲组明显低于红景天和乙酰唑胺对照组。综合比较,无论是缺氧存活时间还是小鼠血清乳酸含量,均以大苞雪莲最为明显,水母雪莲和苞叶雪莲次之,说明3种雪莲具有良好的耐缺氧作用,具有较高的开发利用价值。
单因素正交试验考察雪莲提取溶剂
(1)实验目的:应用小鼠常压密闭缺氧模型确定雪莲的最佳提取溶剂。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级昆明种小白鼠,雌雄各半,8周龄,体重(22 ± 2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:红景天、大苞雪莲原药材均购自青海西宁三江宝商贸有限公司,并经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定;乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为250 ±2.5 ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产)。
(5)供试品的制备:按李仪奎主编的《中药药理实验方法学》制备红景天水提物、大苞雪莲水提物、大苞雪莲95%乙醇提取物、大苞雪莲70%乙醇提取物和大苞雪莲50%乙醇提取物,临用前用蒸馏水配制成50 mg/ml的混悬液浓度。
(6)实验方法与结果:取健康昆明小鼠70只,雌雄各半,适应饲养3d后随机分成7组:缺氧模型组、乙酰唑胺对照组、红景天水提物对照组、大苞雪莲水提物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物组,每组10只。给药时间和缺氧方法同前述方法。结果见表3。
注:bP﹤0.05,bbP﹤0.01,与缺氧模型组相比
结果:与缺氧模型组和阳性对照组相比,各给药组均能明显延长小鼠在常压密闭缺氧环境中的存活时间(P <0.01),延长率依次为大苞雪莲水提物>70%乙醇提取物>50%乙醇提取物组>95%乙醇提取物,但各组之间无显著性差异(P >0.05)。
(7)结论:大苞雪莲抗缺氧成分在各提取物中均存在,对小鼠常压密闭存活时间的影响各组间没有明显差异。当采用系统溶剂法富集抗缺氧活性部位时,考虑到可操作性,选择70%乙醇提取物做进一步有效部位的分离研究;当采用大孔吸附树脂法富集抗缺氧活性部位时,考虑到得率问题,选取更为方便实惠的大苞雪莲水提物做进一步的有效部位分离研究。
雪莲抗缺氧有效部位的筛选
(1)实验目的:应用常压密闭缺氧模型筛选雪莲抗缺氧有效部位。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级昆明种小白鼠,雌雄各半,8周龄,体重(20 ± 2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:红景天、大苞雪莲原药材购自青海西宁三江宝商贸有限公司,并经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定;乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为250 ± 2.5 ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产)。
(5)供试品的制备:
系统溶剂萃取法:取雪莲粗粉,加15倍量70%乙醇,加热回流3次,每次1h,合并提取液,过滤,减压浓缩至浸膏状,将浸膏用3倍量水分散,依次用相当于水分散体系1/3体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取至萃取液近无色,合并各萃取液,CO2冷冻干燥,得石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇部位。临用前用蒸馏水配制成50 mg/ml的混悬液浓度(石油醚部位脂溶性成分较多可先加适量吐温80助溶,然后边研边加蒸馏水至刻度)。
大孔吸附树脂法:取雪莲粗粉,加15倍量水浸泡30min,加热煮沸后文火煎煮1h,过滤取滤液。残渣继续按上述方法提取两次,弃去药渣,合并三次滤液静置过夜。于第二日轻轻倾取上层清液,下层混浊部分1000 rpm离心10 min,取上清,合并入已取出的上层清液,弃沉淀。将上层清液缓慢流过经乙醇洗脱处理过的大孔树脂柱,先用水洗至流出液为无色,然后换用95%的乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、真空干燥得水洗脱物和95%的乙醇洗脱物。临用前用蒸馏水配成500 mg·mL-1的药液。
(6)实验方法与结果:取健康昆明小鼠120只,雌雄各半,饲养适应3d后随机分成12组:缺氧模型组、乙酰唑胺对照组、红景天水提物对照组、大苞雪莲9个活性部位组,每组10只。给药时间和缺氧方法同述前方法。结果见表4。
注:bP﹤0.05, bbP﹤0.01,与缺氧模型组相比;
c P﹤0.05, cc P﹤0.01,与乙酰唑胺组比较;
d P﹤0.05,dd P﹤0.01,与红景天胶囊组相比
结果:口服灌胃用两种不同提取分离方法得到的活性部位,结果表明,与缺氧模型组相比大苞雪莲不同活性部位均能明显延长小鼠在常压密闭缺氧环境中的存活时间(P <0.01);与乙酰唑胺和红景天水提物组相比,石油醚部位给药组和95%乙醇洗脱物组能明显延长小鼠在常压密闭缺氧环境中的存活时间(P <0.05)。
(7)结论:本实验研究了大苞雪莲不同极性部位的抗缺氧活性,结果显示各活性部位均能延长常压缺氧状态下小鼠的存活时间,其中以石油醚部位给药组和95%乙醇洗脱物组最为明显。
4. 不同剂量大苞雪莲石油醚部位对常压密闭小鼠存活时间的影响
(1)实验目的:应用常压密闭缺氧模型考察大苞雪莲石油醚部位抗缺氧的量效关系。
(2)实验条件:三级动物实验室,室温20~25℃,空调恒温。
(3)实验对象:清洁级BALB/C小鼠,雄性,8周龄,体重(20±2 g),由兰州生物制品研究所实验动物中心提供,饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。
(4)试药与仪器:乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司,100114);250 mL广口瓶(统一用注水法校准,容积为250 ± 2.5ml);凡士林(包头黄河石化有限责任公司,批号 050521);钠石灰(英国Molecular Products Limited公司产品);BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司生产)。
(5)供试品的制备:称取上述实验制备的大苞雪莲石油醚部位适量,先加适量吐温-80助溶,然后边研磨边加蒸馏水至刻度,配制成80、40、20 mg/ml的混悬液。
(6)实验方法与结果:取健康BALB/C小50只,雌性,饲养适应3d后随机分成5组:缺氧模型组、乙酰唑胺对照组、大苞雪莲石油醚部位高(800 mg·kg-1)、中(400 mg·kg-1)、低(200 mg·kg-1)剂量组,每组10只。单次腹腔注射给药,给药体积为0.2mL·20g-1,给药后30min,按前述缺氧方法操作。结果见表5。
表5 不同剂量大苞雪莲石油醚部位对常压密闭小鼠存活时间的影响
注:bb P﹤0.01,与缺氧模型组相比
结果:与缺氧模型组相比,大苞雪莲石油醚部位高、中、低三个剂量均可延长小鼠常压密闭缺氧存活时间(P﹤0.01),具有良好的线性关系,与乙酰唑胺对照组无显著性差异(P >0.05)。
(7)结论:腹腔注射不同剂量大苞雪莲石油醚部位与前述口服灌胃给药结果一致。腹腔注射大苞雪莲石油醚部位200、400、800 mg·kg-1剂量的小鼠,在常压密闭缺氧环境中生存时间与药物剂量呈现良好的线性关系,与乙酰唑胺对照组无显著性差异。
综合以上研究结果可以得出这样的结论:大苞雪莲具有良好的耐缺氧作用,其抗缺氧作用可能并非仅仅源于其中某一种或某一类成分,而很可能是多种成分的综合作用。
具体实施方式
实施例1
①取干燥雪莲,粉碎,加13倍量体积浓度为50%的乙醇溶液,在50℃下温浸提取,提取液过滤,减压浓缩至比重约1.40g/ml,得醇提浸膏;
②将浸膏用3倍量水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/2体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,分别合并经多次萃取的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压浓缩,冷冻干燥分别得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位;
实施例2
①将干燥、粉碎的雪莲用13倍量、体积浓度为0.01-95%的乙醇溶液在20-70℃下温浸提取,过滤、浓缩至浸膏状;②用15倍量、温度为60℃的热水溶解上述浸膏状物,冷却、过滤除去脂溶性成分得提取液;③将提取液缓慢流过经乙醇洗脱处理过的大孔树脂柱;④ 先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂柱,再用体积浓度为80%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱,收集乙醇洗脱液、减压浓缩、真空干燥得雪莲提取物。
步骤①中所述的温浸提取可反复3次。
步骤③中,提取液流过聚酰胺柱后,用蒸馏水冲洗聚酰胺柱,并将洗脱液与所述母液混合后,再上所述大孔树脂柱。
Claims (5)
1.雪莲及其雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的雪莲及其雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用,其特征在于:所述雪莲选自大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲中的一种;所述雪莲提取物为大苞雪莲提取物、水母雪莲提取物或苞叶雪莲提取物中的一种。
3.根据权利要求2所述的雪莲及其雪莲提取物在制备抗缺氧药物中的应用,其特征在于:所述雪莲提取物为雪莲的水提物或雪莲的乙醇提取物及其经系统溶剂法萃取和大孔吸附树脂法提取所得的抗缺氧有效部位。
4.权利要求1或2或3所述的雪莲提取物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
①取干燥雪莲,粉碎,加10-15倍量体积浓度为0.01-95%的乙醇溶液,在20-70℃下温浸提取,提取液过滤,减压浓缩至比重约1.40g/ml,得醇提浸膏;
②将浸膏用3倍量水分散得水分散体系,依次用相当于水分散体系1/3-1倍体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次,至萃取液颜色变淡为止,分别合并多次萃取的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压浓缩,冷冻干燥分别得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位;
步骤①中所述的温浸提取反复多次,至提取液颜色变淡为止。
5.根据权利要求1或2或3所述的雪莲提取物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:①将干燥、粉碎的雪莲用10-15倍量、体积浓度为0.01-95%的乙醇溶液在20-70℃下温浸提取,过滤、浓缩至浸膏状;②用10-15倍量、温度为30-90℃的热水溶解上述浸膏状物,冷却、过滤除去脂溶性成分得提取液;③将提取液缓慢流过经乙醇洗脱处理过的大孔树脂柱;④ 先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂柱,再用体积浓度为10-95%的乙醇溶液冲洗大孔树脂柱,收集乙醇洗脱液、减压浓缩、真空干燥得雪莲提取物;
步骤①中所述的温浸提取可反复多次;
步骤③中,提取液流过聚酰胺柱后,用蒸馏水冲洗聚酰胺柱,并将洗脱液与所述母液混合后,再上所述大孔树脂柱。
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