CN103145828A - 一种利拉鲁肽的全固相合成方法 - Google Patents
一种利拉鲁肽的全固相合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103145828A CN103145828A CN2012105337597A CN201210533759A CN103145828A CN 103145828 A CN103145828 A CN 103145828A CN 2012105337597 A CN2012105337597 A CN 2012105337597A CN 201210533759 A CN201210533759 A CN 201210533759A CN 103145828 A CN103145828 A CN 103145828A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resin
- solution
- reactor
- fmoc
- draining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 title abstract description 8
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 title abstract description 8
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 title abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 86
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims abstract description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 18
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 claims abstract description 11
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 205
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 205
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 72
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 4
- GOPWHXPXSPIIQZ-FQEVSTJZSA-N (4s)-4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)OC(C)(C)C)C3=CC=CC=C3C2=C1 GOPWHXPXSPIIQZ-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 3
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 32
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- -1 ion salt Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 252
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 84
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 73
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 69
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 67
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 63
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 62
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 33
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 32
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 31
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 3
- CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 2
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-(prop-2-enoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OCC=C)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 2
- DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N (2s,3s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 description 1
- MGHMWKZOLAAOTD-DEOSSOPVSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 MGHMWKZOLAAOTD-DEOSSOPVSA-N 0.000 description 1
- ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N 0.000 description 1
- UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxo-5-(tritylamino)pentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC(=O)NC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N 0.000 description 1
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
本发明公开了一种利拉鲁肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，经过微波反应技术的处理，缩短了反应时间，提高了缩合效率。侧链修饰采用新颖ivDde侧链保护的赖氨酸，进行侧链修饰合成，期间采用20%哌啶脱Fmoc保护，直至直链多肽合成完毕。其次采用水合肼脱ivDde保护后，进行侧链修饰反应。得到的在固相载体上的全保护利拉鲁肽通过三氟醋酸的处理得到利拉鲁肽粗品，并经过C18柱的纯化冻干，得到纯品利拉鲁肽，经过强阴离子转盐并冻干后得到醋酸利拉鲁肽醋酸盐。本发明操作简单，合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法，特别涉及一种利拉鲁肽的全固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽(Liraglutide)，是通过基因重组技术，利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，具有降低血糖、减轻体重、促进胰岛细胞再生以及心血管系统保护等多种效应，临床应用前景广阔。
现有的利拉鲁肽生产方法及缺陷如下：
1、基因工程法，由于利拉鲁肽是一个具有支链修饰的非天然活性多肽，所以生产技术难度极大，设备要求高，大规模生产风险大，成本高，不利于工业化生产。
2、固液合成法，需经过片段固相合成、全保护切割、全保护片段纯化、片段缩合等几个不同的阶段，生产周期长。同时由于片段是全保护多肽，非常疏水，所以大大的增加了纯化的难度。这就给大规模生产带来了周期长，成本高的问题。
3、CN102286092A的发明报道的Fmoc-Lys(Alloc)-OH方法，由于所采用的是先液相合成支链化合物(Palmitoyl-Glu-OtBu)，同样也需要进行反复纯化的问题。选择Fmoc-Lys(Alloc)-OH作为侧链修饰用保护氨基酸的方法所带来的弊端，在脱Alloc保护时对生产设备和生产环境带来了更高的要求以及更长的生产周期，主要表现在以下几个方面：1)由于脱Alloc保护基要用到的四三苯基膦钯对空气、光、热等非常敏感，反应要求在无空气、避光的条件下才能有效的进行。2)要求对保护肽树脂在高真空的条件下40℃加热干燥4小时。3)试剂四三苯基膦钯价格昂贵，所需反应时间长(2小时)，并且需要在氩气的保护下进行。4)由于反应是在封闭的状态下进行，取样困难，不利于中控，对大规模工业化生产带来了很大的风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的全固相合成方法，操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，利于利拉鲁肽的大规模生产。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利拉鲁肽的全固相合成方法，包括如下步骤：
(1)以2-Cl-Tr树脂为固相载体，与Fmoc-Gly-OH缩合反应获得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt树脂；(Fmoc-Gly-OH的摩尔数：树脂取代度=2:1)
(2)通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次缩合具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(ivDde)-OH，每次缩合反应30-35min后，再在微波条件下反应处理；
(3)脱除赖氨酸侧链保护基ivDde；
(4)通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上连接棕榈酸；
(5)裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
(6)纯化，冻干，转盐，冻干，得到利拉鲁肽醋酸盐。
本发明线性肽(直链肽)部分采用特有的小配比(即缩合反应时，保护的氨基酸的摩尔数：树脂取代度=2:1，而传统的方法是3:1或者5:1，甚至高达10:1，反应时间1至2小时，甚至反应过夜。本发明的方法是保护的氨基酸的摩尔数：树脂取代度=2:1，反应30-35分钟再用微波照射15-20秒，反应即可完成)微波反应技术的Fmoc固相合成方法，以2-Cl-Trt Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂。侧链修饰采用新颖ivDde侧链保护的赖氨酸。纯化采用制备型反相高效液相色谱法以及本公司特有的转盐技术。本发明提供的固相合成方法操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，利于利拉鲁肽的大规模生产。
本发明采用的小配比微波反应技术极大地提高了反应效率，提高了产品的纯度。
本发明采用的Fmoc-Lys(ivDde)-OH作为侧链修饰的保护氨基酸可以在同一个反应器里无需做任何特殊的处理即可完成整个合成，而脱ivDde保护基的反应时间更是只需短短的几分钟即可完成。反应条件温和。取样方便，易于中控。同样本发明采用了强阴离子转盐的工艺，对最终的产品用醋酸进行转盐，彻底清除了三氟醋酸对生物体的毒性。本方法操作简单，合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于大规模生产。
作为优选，步骤(2)中，缩合反应时，具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸用量为：氨基酸的摩尔数：树脂取代度=2:1；微波条件下反应具体为：微波输出功率130w-195w，反应15-20s。
作为优选，步骤(3)采用水合肼溶液脱除ivDde，水合肼溶液用量为3-4倍树脂体积，水合肼溶液体积配比为：水合肼：DMF=1:15-20。
作为优选，步骤(6)所述转盐具体为：将50-60mg冻干的利拉鲁肽粗肽溶解在6-7ml体积分数为0.1-0.2%的醋酸水溶液中，然后加入到250-300mg强阴离子树脂中，磁力搅拌器上室温下反应1-1.5小时，过滤，收集滤液，树脂用1-2ml体积分数为0.1-0.2%醋酸水溶液洗涤2次，收集洗脱液，与滤液合并。
本发明的有益效果是：操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，利于利拉鲁肽的大规模生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
下面以1g 2-Cl-Trt树脂为例，来具体说明本发明的操作流程。
1、实验原料
2-Cl-Trt-resin、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、
Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-ValOH、Fmoc-Trp(Boc)OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)rOH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、
Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ile-OH、palmitic acid。
2、实验试剂
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、哌啶、二氯甲烷(DIC)、无水乙醚、二异丙基乙胺(DIEA)、乙酸酐、Boc酸酐、水合肼、三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、茴香硫醚、苯酚、茚三酮(5g/100ml)、苯酚(20g/150ml)、无水乙醇、甲醇、次氯酸钠、超纯水、无水CaCl2。
试剂的配制
脱保护试剂——哌啶：DMF=1:4(v/v)【实验前预先配好】
检测试剂A——20g苯酚溶解于150ml无水乙醇中【实验前预先配好，棕色滴瓶，避光】
检测试剂B——5g茚三酮溶解于100ml无水乙醇中【实验前预先配好，棕色滴瓶，避光】
封头试剂——甲醇：DIEA=1:1(v/v)【现用现配】
切割试剂——TFA：EDT：水：茴香硫醚：苯酚=87.5ml：2.5ml：5ml：5ml：5g【现用现配】
3、操作规程(1g树脂)
3.1树脂的称量及溶胀
称取1g 2-Cl-Trt树脂，加入至多肽合成反应器中，用量筒准确量取50ml DCM加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀40min。
3.2肽链的起始及延伸
3.2.1Fmoc-Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.1.1洗涤：将浸泡树脂无水DCM抽干，用30mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺)，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的摇床上摇动1min,重复操作3次，抽干；同理，用DCM洗涤树脂1次；最后用循环水式真空泵(SHZ-DⅢ上海羌强仪器有限公司)将溶液抽干。
3.2.1.2小配比缩合反应：(树脂取代度：Fmoc-氨基酸的摩尔数=1:2)将118.92mgFmoc-Gly-OH和122mgHOBT放于10ml离心管中，加3mlDCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s-1min，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1.5h。
3.2.1.3封头：配制甲醇：DIEA=1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
3.2.1.4洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30mL DMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作4次。再用15mlDCM洗3次，每次1min。然后用甲醇洗3次，每次1min，最后抽干20min，至树脂为颗粒状。称取出部分树脂，留作取代度测定。
3.2.2Fmoc-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.2.1脱Fmoc：用量筒量取30mL 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.2.2洗涤：将用于脱保护的20%哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30mLDMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.2.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.2.4缩合：将称取的583.9mg Fmoc-Arg-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF(因氨基酸的缩合反应采用微波反应法，故采用DMF，而不用DCM，以防DCM在微波反应器中发生爆炸)将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，放入到微波反应器(LWMC=201型微电脑微波化学反应器，南京旋光科技有限公司)中反应，微波功率为20％微波反应器额定输出功率650W，20％即130w)微波时间20s。
3.2.2.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.2.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30mL DMF，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作4次。
3.2.3Fmoc-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.3.1脱Fmoc:向抽干的反应器中加30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的摇床上摇20min
3.2.3.2洗涤：将用于脱Fmoc的20%哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反应器中加30mlDMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.3.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.3.3.4缩合：将118.92mg Fmoc-Gly-OH和122mgHOBT放10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.3.3.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.3.3.6洗涤：将反应液抽干，向抽干的反应器中加30mlDMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作4次。
3.2.4Fmoc-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.4.1脱Fmoc：向抽干的反应器中加30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的摇床上摇20min.
3.2.4.2洗涤：将用于脱Fmoc的20%哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反应器中加30mlDMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.4.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.4.4缩合：将583.9mg Fmoc-Arg-OH和122mgHOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.4.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.4.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作4次
3.2.5Fmoc-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.5.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.5.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.5.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.5.4缩合：将称取的305.46mgFmoc-Val-OH和122mgHOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.5.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.5.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.6Fmoc-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.6.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.6.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操作5次
3.2.6.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.6.4缩合：将称取的318.06mg Fmoc-Leu-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.6.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.6.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。将反应器两端用保鲜膜封好，放于通风橱内。
3.2.7Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.7.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.7.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操作5次
3.2.7.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.7.4缩合：将称取的473.94mg Fmoc-Trp-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.7.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.7.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.8Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.8.1脱Fmoc:向抽干的反应器中加入30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的摇床上摇20min。
3.2.8.2洗涤：将用于脱Fmoc的哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反应器中加入30mlDMF，置于30r/min的摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.8.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.8.4缩合：将280.17mg Fmoc-Ala-OH和122mg HOBT加入到10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC活化20s，混匀。将混合液加入到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.8.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.8.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.9Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.9.1脱Fmoc:向抽干的反应器中加入30ml20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的摇床上摇20min。
3.2.9.2洗涤：将用于脱Fmoc的哌啶/DMF溶液抽干，向抽干的反应器中加入30mlDMF，置于30r/min的摇床上摇1min.，用真空泵将溶液抽干，重复操作5次。
3.2.9.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.9.4缩合：将318.06mg Fmoc-Ile-OH和122mg HOBT加入到10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC活化20s，混匀。将混合液加入到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.9.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.9.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.10Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.10.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.10.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.10.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.10.4缩合：将称取的348.66mg Fmoc-Phe-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.10.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.10.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.11Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.11.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.11.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.11.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.11.4缩合：将称取的382.923mg Fmoc-Glu(OtBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.11.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.11.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.12Fmoc-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.12.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.12.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.12.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.12.4缩合：将称取的479.358mg Fmoc-Lys(Dde)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.12.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.12.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.13Fmoc-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.13.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.13.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.13.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.13.4缩合：将称取的280.17mg Fmoc-Ala-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.13.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.13.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.14Fmoc-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.14.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.14.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.14.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.14.4缩合：将称取的280.17mg Fmoc-Ala-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.14.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.14.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.15Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.15.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.15.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.15.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.15.4缩合：将称取的549.63mg Fmoc-Gln(Trt)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.15.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.15.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.16Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.16.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.16.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.16.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.16.4缩合：将称取的118.92mg Fmoc-Gly-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.16.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.16.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.17Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.17.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.17.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.17.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.17.4缩合：将称取的382.923mg Fmoc-Glu(OtBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.17.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.17.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.18Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.18.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.18.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.18.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.18.4缩合：将称取的318.06mg Fmoc-Leu-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.18.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.18.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.19Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.19.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.19.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.19.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.19.4缩合：将称取的413.55mg Fmoc-Tyr(tBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.19.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.19.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.20Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.20.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.20.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.20.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.20.4缩合：将称取的345.06mg Fmoc-Ser(tBu)--OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.20.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.20.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.21Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.21.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.21.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.21.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.21.4缩合：将称取的345.06mg Fmoc-Ser(tBu)--OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.21.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.21.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.22Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.22.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.22.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.22.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.22.4缩合：将称取的305.46mg Fmoc-Val-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.22.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.22.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.23Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.23.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.23.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.23.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.23.4缩合：将称取的303.66mg Fmoc-Asp(OtBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.23.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.23.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.24Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.24.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.24.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.24.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.24.4缩合：将称取的345.06mg Fmoc-Ser(tBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.24.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.24.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.25Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.25.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.25.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.25.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.25.4缩合：将称取的357.75mg Fmoc-Thr(tBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.25.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.25.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.26Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.26.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.26.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.26.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.26.4缩合：将称取的348.66mg Fmoc-Phe-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.26.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.26.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.27Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.27.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.27.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.27.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.27.4缩合：将称取的357.75mg Fmoc-Thr(tBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.27.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.27.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.28Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.28.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.28.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。
3.2.28.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.28.4缩合：将称取的118.92mg Fmoc-Gly-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.28.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.28.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.29Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.29.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.29.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次
3.2.29.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.29.4缩合：将称取的382.923mg Fmoc-Glu(OtBu)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.29.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.29.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.30Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.30.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.30.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次
3.2.30.3检测：用取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.30.4缩合：将称取的280.17mg Fmoc-Ala-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.30.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.30.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.2.31Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg-Gly-Arg--Gly-2-Cl-Trt-Resin的制备
3.2.31.1脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。
3.2.31.2洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次
3.2.31.3检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。
3.2.31.4缩合：将称取的557.73mg Fmoc-His(Trt)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应30min后，微波20s(与3.2.2.4微波条件相同)。
3.2.31.5检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂呈无色。
3.2.31.6洗涤：将反应液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干。重复操作4次。
3.3多肽侧链的连接
3.3.1连接侧链前的脱保护
多肽连接至最后一个氨基酸缩合成功后，洗涤4次后，按上所述进行氨基酸脱保护——脱保护洗涤——脱保护检测(脱Fmoc：用量筒量取30ml 20%哌啶/DMF溶液，加入到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇20min。洗涤：将用于脱保护的哌啶/DMF溶液抽干，再向抽干的反应器中加入30ml DMF溶液，置30r/min的脱色摇床上摇1min。用真空泵将溶液抽干，重复操5次。检测：取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴，置于100℃加热20S，树脂显色。)，检测为阳性，则进行下一步反应。
3.3.2接Boc酸酐(用于保护N-端氨基)
Boc酸酐按照树脂取代度的三倍物质的量(即摩尔量)计，DIEA:DCM=1:4溶液3ml，混合均匀，加入到反应器中，反应直至树脂检测无色，即Boc已连接上。
3.3.3脱ivDde
Boc接上后用DMF洗4遍后脱ivDde，按照水合肼：DMF=1:15配置溶液16ml，溶液分3次脱Dde，每次震荡反应5min，用DMF洗涤3次；第3次混合溶液脱ivDde时，DMF洗涤5次，树脂检测有色，说明ivDde已被成功脱下，可进行侧链连接。
3.3.4侧链氨基酸的连接
脱ivDde完成后，按下述缩合方法，投入侧链氨基酸Fmoc-Glu-OtBu，洗检、脱保护、洗检，树脂有色；再投入棕榈酸(树脂取代度的3倍量计算加入量)进行连接反应，树脂检测无色，确认连接成功后，用DMF洗5次，抽干反应器。
缩合方法：按树脂取代度的两倍量称量所需的氨基酸及HOBT的质量，加入3mlDMF使之完全溶解，并加入相应体积的DIC，迅速混匀后(约30s-1min)，加入至合成反应器中，中速震摇50min(若室温低于25℃，将反应器置于恒温震荡箱中，温度控制在25-30℃)。缩合时间快到时，取10-20颗树脂，置于15ml玻璃试管中，分别加入两滴检测试剂A、B，轻轻震摇使检测试剂与树脂充分接触后，置于100℃加热60s。树脂呈现无色或淡黄透明等树脂自身的颜色，视为缩合反应成功。鉴于无游离氨基存在的树脂为无色的半透明状态，通常，有显色反应的缩合步骤，都视为缩合不完全，采用微波处理，如检测仍有颜色则选择重新投料(氨基酸：HBTU：DIEA=1：1:1)，直至反应完全；如树脂完全无色，则视为缩合反应成功，进行下一步骤操作。检测无颜色后，用DMF洗涤4次，每次30ml，置于脱色摇床上摇动1min，抽干。
3.3.5树脂的干燥
向抽干的反应器中加入40mlDCM溶液，置于脱色摇床上摇动3min，用真空水泵将DCM抽掉，重复操作4次。
最后一次抽干时，保持真空条件干燥至树脂呈颗粒状，等待切割。
3.4多肽从树脂上的切割
3.4.1配置切割试剂
20ml配方为:17.5mlTFA+1ml茴香硫醚+1ml水+0.5mlEDT+1g苯酚，置于棕色试剂瓶中。
3.4.2沉降的准备
无水乙醚置于-20℃低温预冷【预冷时间≥2h】。乙醚用量为1ml切割试剂8ml乙醚沉降。
3.4.3多肽的切割
向反应器中加入20ml切割试剂，置于摇床摇动90min，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，向反应器中再加入备用的洗涤用切割试剂，离心，3000r/min，3min，离心沉淀去上清，重复操作3次得到多肽粗产品。
3.5取代度的测定
取4份干燥的2-Cl-Trt树脂作平行样，每份5mg.
称量干燥的Fmoc-AA-Resin 5(W)mg于10ml离心管中。然后，加入5(X)ml 20%哌啶/DMF脱保护20min。用移液枪取1ml 20%哌啶/DMF，加甲醇稀释至10ml，做为空白对照。Absblank在301nm测定。归零后，取1(Y)ml 20%哌啶/DMF脱保护液用甲醇稀释至10(Z)ml。各取2.5ml稀释后的脱保护液和2.5ml稀释后的20%哌啶/DMF溶液于2个石英比色皿中，用空白调零后，在301nm处测定吸光度值，记为Abs301nm。重复测定4次。计算公式如下：
结果如下：
| NO. | Mresin(mg) | Abs301nm | SD(mmol/g) |
| 1 | 5.1 | 0.210 | 0.291 |
| 2 | 5.1 | 0.207 | 0.287 |
| 3 | 5.0 | 0.205 | 0.285 |
| 4 | 5.0 | 0.210 | 0.291 |
SD平均值=0.2885mmol/g。
4、利拉鲁肽粗品的纯化
4.1液相具体配置
4.1.1分析型HPLC(日本岛津公司)
仪器组成：LC-20AT
SIL-20A
SPD-20A
CTO-20A
DGU-20A5
分析柱：Inertsil ODS-SP，5μm，4.6I.D.×250[mm](日本岛津公司)
4.1.2制备型HPLC(北京创新通恒)
仪器组成：LC-3000型高效液相色谱仪
LC-3000泵×2
LC-3000检测器
LC-3000混合池
制备柱：Daisogel C18，10μm，20mmI.D.×250[mm](Daiso co.Ltd)
4.2分析型HPLC分析
(1)HPLC分析条件
流动相：A：0.1%TFA/水 B：0.1%TFA/乙腈
波长：214nm
流速：1ml/min
分析梯度
| Time/min | B.cone% |
| 0.01 | 30 |
| 25.00 | 95 |
| 28.00 | 100 |
| 35.00 | 100 |
| 40.00 | 30 |
| 50.00 | Stop |
(2)记录HPLC分析图谱
4.3粗品纯化
4.3.1流动相配制
流动相A：0.1%乙酸/水 4L
流动相B：0.1%乙酸/乙腈 4L
4.3.2开机平衡基线
4.6.2.1流速：9ml/min
流动相：80%乙腈/水
时间：10min
4.6.2.2流速9ml/min
流动相：30%乙腈/水
时间：10min
4.3.3取样溶解
由于室温较低，溶剂低温会影响样品的溶解效果，因此，本次制备中溶解样品所用的乙腈，乙酸，水均先28℃水浴处理。
以100mg冻干后的多肽粗产品为例，加入预热的冰乙酸约1ml，用吸管或玻璃棒等搅拌均匀使均相分散后，加入约5ml预热的纯乙腈，再次混匀，加入预热后的水10ml，迅速用0.2μm滤膜(有机相，Φ1cm，Φ2.5cm)过滤，过滤后的液体用水相稀释至25ml体积，迅速上样制备。
4.3.4上样
流速：9ml/min B泵上样
上样结束后，30%平衡4min
4.3.5制备梯度
波长：214nm
流速：9ml/min
程序：
| Time/min | B.cone% |
| 0.00 | 30 |
| 5.00 | 30 |
| 15.00 | 50 |
| 25.00 | 54 |
| 125.00 | 65 |
| 135.00 | 70 |
4.3.6制备后停泵
出峰结束，质谱确认主峰为目标产物后，可以停止制备程序，并用9ml/min，90%B相冲洗10min；9ml/min，100%B冲洗15min；停泵。
4.4制备后分析
流动相：A：0.1%TFA/水
B：0.1%TFA/乙腈
波长：214nm
流速：1ml/min
分析程序：
| Time/min | B.cone% |
| 0.01 | 30 |
| 25.00 | 95 |
| 28.00 | 100 |
| 35.00 | 100 |
| 40.00 | 30 |
| 50.00 | Stop |
合并峰形集中各管的样品溶液，进行图谱分析。
4.5纯品冻干、转盐
分析后，确认合格的产品合并冻干。
开启冷冻干燥机，首先，制冷至-50℃，开启真空泵，真空度下降到20左右，开始悬挂冻干瓶。
合管的样品液冻干后，进行QC图谱分析。
转盐：称取250mg的强阴离子交换树脂(阴离子交换树脂,交换当量≥3mg当量/克干树脂,水分：40%-50％，出厂型式：氯型，厂家：天津市巴斯夫化工有限公司)于一沙芯漏斗内，用去离子水浸泡并洗涤3次。再用10%的醋酸水溶液洗涤3次，1%的醋酸水溶液洗涤3次。
将50mg冻干后的多肽溶解在6ml 0.1%的醋酸水溶液中，随后加入到强阴离子树脂中，将其置于磁力搅拌器上室温反应1小时，过滤，收集滤液，用1ml 0.1%的醋酸水溶液洗涤2次，合并溶液，冻干。
4.6转盐后纯品冻干
分析后，确认合格的产品合并冻干。
开启冷冻干燥机，首先，制冷至-50℃，开启真空泵，真空度下降到20左右，开始悬挂冻干瓶。
合管的样品液冻干后，进行QC图谱分析。
4.7收率计算
称量、记录制备所得的达到要求纯度的样品量，计算其收率。通过本发明的方法，利拉鲁肽的最终收率在28%左右，纯度：>98%。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (4)
1.一种利拉鲁肽的全固相合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）以2-Cl-Trt树脂为固相载体，与Fmoc-Gly-OH缩合反应获得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt树脂；
（2）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次缩合具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys（ivDde)-OH，每次缩合反应30-35min后，再在微波条件下反应处理；
（3）脱除赖氨酸侧链保护基ivDde；
（4）通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上连接棕榈酸；
（5）裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
（6）纯化，冻干，转盐，冻干，得到利拉鲁肽醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的全固相合成方法，其特征在于：步骤（2）中，缩合反应时，具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸用量为：氨基酸的摩尔数：树脂取代度=2:1；微波条件下反应具体为：微波输出功率130w-195w，反应15-20s。
3.根据权利要求1或2所述的一种利拉鲁肽的全固相合成方法，其特征在于：步骤（3）采用水合肼溶液脱除ivDde，水合肼溶液用量为3-4倍树脂体积，水合肼溶液体积配比为：水合肼：DMF=1:15-20。
4.根据权利要求1或2所述的一种利拉鲁肽的全固相合成方法，其特征在于：步骤（6）所述转盐具体为：将50-60mg冻干的利拉鲁肽粗肽溶解在6-7ml体积分数为0.1-0.2%的醋酸水溶液中，然后加入到250-300mg强阴离子树脂中，磁力搅拌器上室温下反应1-1.5小时，过滤，收集滤液，树脂用1-2ml体积分数为0.1-0.2%醋酸水溶液洗涤2次，收集洗脱液，与滤液合并。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210533759.7A CN103145828B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 一种利拉鲁肽的全固相合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210533759.7A CN103145828B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 一种利拉鲁肽的全固相合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103145828A true CN103145828A (zh) | 2013-06-12 |
| CN103145828B CN103145828B (zh) | 2014-08-13 |
Family
ID=48544192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210533759.7A Expired - Fee Related CN103145828B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 一种利拉鲁肽的全固相合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103145828B (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103288951A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-09-11 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种利拉鲁肽的制备方法 |
| CN103304660A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-09-18 | 上海昂博生物技术有限公司 | 一种利拉鲁肽的合成方法 |
| CN103421088A (zh) * | 2013-08-15 | 2013-12-04 | 广东八加一医药有限公司 | 单核细胞移动抑制因子的固相合成方法 |
| WO2016046753A1 (en) | 2014-09-23 | 2016-03-31 | Novetide, Ltd. | Synthesis of glp-1 peptides |
| WO2016067271A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Auro Peptides Ltd | A process for the preparation of liraglutide |
| CN106397573A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-02-15 | 合肥国肽生物科技有限公司 | 一种利拉鲁肽的固相合成方法 |
| CN106478806A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-08 | 合肥国肽生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽的固相合成方法 |
| CN106633084A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-05-10 | 中国药科大学 | 一种用于构建囊泡的具有肿瘤部位酶敏感特性的高分子材料的全固相合成方法 |
| WO2017162650A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Bachem Holding Ag | Method for preparing glucagon-like peptides |
| CN108976296A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-12-11 | 安徽省国平药业有限公司 | 一种利拉鲁肽的合成方法 |
| WO2019069274A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A GLUCAGON-LIKE PEPTIDE |
| WO2021007701A1 (en) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Shanghai Space Peptides Pharmaceutical Co., Ltd. | A method for preparing liraglutide via a solid phase peptide synthesis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286092A (zh) * | 2011-09-14 | 2011-12-21 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 利拉鲁肽的固相合成方法 |
| CN102584982A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-18 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法 |
-
2012
- 2012-12-12 CN CN201210533759.7A patent/CN103145828B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286092A (zh) * | 2011-09-14 | 2011-12-21 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 利拉鲁肽的固相合成方法 |
| CN102584982A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-18 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 姜和等: "Fmoc法肽合成中正交保护赖氨酸的研究进展", 《重庆理工大学学报（自然科学）》, vol. 25, no. 4, 15 April 2011 (2011-04-15) * |
| 李文曲等: "末端N-Ivdde保护的氨基酸的合成", 《合成化学》, vol. 17, no. 2, 20 April 2009 (2009-04-20) * |
| 李鹏等: "2氯三苯甲基树脂的制备机器在多肽固相合成中的应用", 《过程工程学报》, vol. 9, no. 3, 15 June 2009 (2009-06-15) * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103288951A (zh) * | 2013-06-19 | 2013-09-11 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种利拉鲁肽的制备方法 |
| CN103304660A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-09-18 | 上海昂博生物技术有限公司 | 一种利拉鲁肽的合成方法 |
| CN103304660B (zh) * | 2013-07-12 | 2016-08-10 | 上海昂博生物技术有限公司 | 一种利拉鲁肽的合成方法 |
| CN103421088A (zh) * | 2013-08-15 | 2013-12-04 | 广东八加一医药有限公司 | 单核细胞移动抑制因子的固相合成方法 |
| WO2016046753A1 (en) | 2014-09-23 | 2016-03-31 | Novetide, Ltd. | Synthesis of glp-1 peptides |
| WO2016067271A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Auro Peptides Ltd | A process for the preparation of liraglutide |
| WO2017162650A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Bachem Holding Ag | Method for preparing glucagon-like peptides |
| US11117946B2 (en) | 2016-03-23 | 2021-09-14 | Bachem Holding Ag | Method for preparing glucagon-like peptides |
| CN106633084A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-05-10 | 中国药科大学 | 一种用于构建囊泡的具有肿瘤部位酶敏感特性的高分子材料的全固相合成方法 |
| CN106478806A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-08 | 合肥国肽生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽的固相合成方法 |
| CN106397573A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-02-15 | 合肥国肽生物科技有限公司 | 一种利拉鲁肽的固相合成方法 |
| CN106478806B (zh) * | 2016-10-24 | 2019-08-30 | 合肥国肽生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽的固相合成方法 |
| WO2019069274A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A GLUCAGON-LIKE PEPTIDE |
| CN108976296A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-12-11 | 安徽省国平药业有限公司 | 一种利拉鲁肽的合成方法 |
| WO2021007701A1 (en) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Shanghai Space Peptides Pharmaceutical Co., Ltd. | A method for preparing liraglutide via a solid phase peptide synthesis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103145828B (zh) | 2014-08-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103145828B (zh) | 一种利拉鲁肽的全固相合成方法 | |
| CN102286092B (zh) | 利拉鲁肽的固相合成方法 | |
| CN102875655B (zh) | 一种合成利那洛肽的方法 | |
| CN104017064B (zh) | 一种制备特立帕肽的方法 | |
| CN108359006A (zh) | 一种索玛鲁肽的制备方法 | |
| CN108676087B (zh) | 一种索玛鲁肽的合成方法 | |
| CN104031127B (zh) | 一种固液结合制备比伐卢定的方法 | |
| CN109456402A (zh) | 一种索玛鲁肽的合成方法 | |
| CN103435687B (zh) | 一种卡贝缩宫素的纯化方法 | |
| CN113880936B (zh) | 一种阿巴帕肽的固相合成方法 | |
| CN104530218A (zh) | 一种特立帕肽的固相合成方法 | |
| CN101357938B (zh) | 固相多肽合成Exenatide的制备方法 | |
| CN103333239A (zh) | 固相合成胰高血糖素 | |
| CN107573408A (zh) | 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法 | |
| CN103880945B (zh) | 制备高纯度胸腺法新的方法 | |
| CN103992389B (zh) | 一种固环合成去氨加压素的方法 | |
| CN104211777A (zh) | 一种皮卡那肽的制备方法 | |
| CN105418736A (zh) | 一种固液结合制备特利加压素的方法 | |
| CN107501408A (zh) | 一种特立帕肽的制备方法 | |
| CN106478805A (zh) | 一种glp-1衍生物的制备方法 | |
| CN104177491B (zh) | 一种替莫瑞林的制备方法 | |
| CN103214550A (zh) | 多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺 | |
| CN105037496A (zh) | 一种依替巴肽的制备方法 | |
| CN106008674A (zh) | 一种制备利那洛肽的方法 | |
| CN106478779A (zh) | 一种卡贝缩宫素的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NINGBO REAL DATA MEDICAL RESARCH INC. Free format text: FORMER OWNER: NINGBO SHENGTAI BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150202 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 315201 NINGBO, ZHEJIANG PROVINCE TO: 315000 NINGBO, ZHEJIANG PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150202 Address after: Beilun District of Zhejiang city in Ningbo Province, 315000 West Road No. 483 building block A2-1 Tylin Patentee after: Ningbo Ruida pharmaceutical science and Technology Co Ltd Address before: West Street in the official Zhejiang city of Ningbo province Zhenhai District 315201 Village No. 777 Patentee before: Ningbo Shengtai Biomedical Technology Co., Ltd. |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160504 Address after: 212000 Jiangsu city of Zhenjiang province Dantu high tech Industrial Zone No. 168 Leng Yu Lu Gaochuang building room 423 Patentee after: Zhenjiang Shengtai Biological Medical Technology Co., Ltd. Address before: Beilun District of Zhejiang city in Ningbo Province, 315000 West Road No. 483 building block A2-1 Tylin Patentee before: Ningbo Ruida pharmaceutical science and Technology Co Ltd |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181105 Address after: 315000 Tianlin block 483, minzhou West Road, Beilun District, Ningbo, Zhejiang, A2-1 Patentee after: Ningbo Ruida pharmaceutical science and Technology Co Ltd Address before: 212000 room 423, Gao Chuang building, 168 cold road, Dantu hi tech park, Zhenjiang, Jiangsu. Patentee before: Zhenjiang Shengtai Biological Medical Technology Co., Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140813 Termination date: 20201212 |