CN103131029A - 一种胶原蛋白共价交联水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种胶原蛋白共价交联水凝胶及其制备方法。可注射性水凝胶普遍存在使用后出现红肿、瘤状肿块、吸收过快等问题，无法使用或者无法完全满足美容祛皱的需要。本发明利用Schiffbase和Acetalization反应原理，将质量分数分别为2.0%-5.0%、2.0%-4.0%、1.0%-5.0%的双醛淀粉溶液、胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按体积比为（1-4）：（1-3）：（1-3）混合搅拌，得到共价交联水凝胶。本发明制备的胶原蛋白水凝胶在4~40℃范围内能够形成性能稳定的凝胶，凝胶形成时间2-3分钟，机械性能良好，免疫排异反应较弱，且降解时间明显延长，可达12个月左右，应用于皮肤凹陷、伤口创伤、皱纹（鱼尾纹、抬头纹、眉间纹等）更加安全有效。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种胶原蛋白共价交联水凝胶及其制备方法。
背景技术
随着生物、非生物材料和组织工程学的发展，可注射性水凝胶已成为生物医学领域可注射型材料中最重要的类型之一。目前医疗美容行业中所使用的一些填充祛皱产品，普遍存在使用后出现红肿、瘤状肿块、吸收过快等问题，无法使用或者无法完全满足美容祛皱的需要。即使是经国家药监局批准的双美胶原和伊维兰，虽然效果良好，也仍存在的红肿、过敏、降解时间过快等情况。提高生物稳定性和生物相容性是制备用于组织填充水凝胶的两个关键技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种机械性能良好、生物相容性优异、有效填充时间≥12个月的胶原蛋白共价交联水凝胶及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为2.0%-4.0%的胶原蛋白溶液；
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为1.0%-5.0%的壳聚糖溶液；
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为2.0%~5.0%的双醛淀粉溶液；
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按（1-3）：（1-3）的体积比在室温下混合，并搅拌10-30分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为（1-4）：（1-3）：（1-3），将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
步骤一中，所述的胶原蛋白为动物胶原蛋白或类人胶原蛋白。
步骤二中，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80%-95%，壳聚糖的分子量为1×105-5×105 道尔顿。
步骤二中，所述的稀酸溶液选自稀盐酸、稀醋酸或稀乳酸，质量分数为0.5%-1.0%。
步骤三中，所述的双醛淀粉分子量为1.0×106-5.0×106，醛基含量为30%-40%。
如所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法制得的胶原蛋白共价交联水凝胶。
本发明具有以下优点：
本发明制备的胶原蛋白水凝胶在4-40℃范围内能够形成性能稳定的凝胶，凝胶形成时间2-3分钟，机械性能良好，免疫排异反应较弱，且降解时间明显延长，可达12个月左右，对于面部填充更加实用，且更加安全有效。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
大量文献已经报道，提高水凝胶稳定性的方法是使其形成共价交联的网格体系，因为共价键是一个不可逆的化学键。因此，本发明利用Schiff base和Acetalization反应原理，采用双醛淀粉（主要反应基团–CHO）将胶原蛋白和壳聚糖（主要反应基团–NH2、–OH）进行共价交联，从而提高凝胶体系的生物稳定性；体系中加入胶原蛋白和壳聚糖主要改善凝胶的生物相容性。虽然很多含有醛基的化合物（戊二醛、乙二醛）在作为交联剂使用时是具有毒性的。但是大量实验证明，当双醛淀粉的醛基含量低于50%，在整个体系中的浓度（质量比）小于2.0%时是完全无毒的。同时在制备生物医用材料时，制备原料和降解产物必须是无毒的或者说必须具备良好的生物相容性，胶原蛋白和壳聚糖由于具有独特的生物学功能，在生物医用材料中已经得到了广泛的应用。鉴于以上事实，本发明以双醛淀粉为交联剂，将胶原蛋白和壳聚糖进行共价交联，有效的改善了水凝胶的生物稳定性和生物相容性，故本发明的水凝胶应用于皮肤凹陷、伤口创伤、皱纹的填充更加安全有效。
本发明所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法由以下步骤实现：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为2.0%-4.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为动物胶原蛋白或类人胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为1.0%-5.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为80%-95%，壳聚糖的分子量为1×105-5×105 道尔顿；
稀酸溶液选自稀盐酸、稀醋酸或稀乳酸，质量分数为0.5-1.0%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为2.0%-5.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为1.0×106-5.0×106，醛基含量为30%-40%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按（1-3）：（1-3）的体积比在室温下混合，并搅拌10-30分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为（1-4）：（1-3）：（1-3），将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟（一旦加入双醛淀粉，凝胶形成速度较快，需要在较短的时间内，使体系混合均匀），使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
以下为本发明的具体实施例：
实施例一：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为2.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为动物胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为1.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为80%，壳聚糖的分子量为1×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀盐酸，质量分数为0.5%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为2.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为1.0×106，醛基含量为30%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按1： 3的体积比在室温下混合，并搅拌10分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为1：1：3，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g，25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50-70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：3.5 分钟，压缩率34.5%，压缩载荷18.7KPa;
注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周变化较大，第8周到第12 周有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤轻微隆起，24 周时材料还有一定量未完全降解； SEM染色分析：1 周时小鼠皮下有极轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
实施例二：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为2.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为类人胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为2.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为85%，壳聚糖的分子量为2×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀盐酸，质量分数为0.5%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为3.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为2.0×106，醛基含量为30%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按1：2的体积比在室温下混合，并搅拌15分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为2：1：2，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g，25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL 后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50―70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：3.0 分钟, 压缩率38.4%，压缩载荷19.6KPa; 注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周变化较大，第8周到第12 周没有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤隆起程度较高，24 周时材料还有约四分之一量未完全降解； SEM 染色分析：1 周时小鼠皮下有轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
实施例三:
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为3.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为动物胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为3.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为85%，壳聚糖的分子量为3×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀醋酸，质量分数为0.5%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为3.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为3.0×106，醛基含量为35%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按1：1的体积比在室温下混合，并搅拌20分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为2：1：1，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃ 下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g，25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL 后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50-70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：2.5 分钟, 压缩率41.5%，压缩载荷20.1KPa; 注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周没有较大变化，第8周到第12 周没有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤隆起程度较大，24 周时材料还有进三分之一未完全降解； SEM 染色分析：1 周时小鼠皮下有轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
实施例四：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为3.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为类人胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为4.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为90%，壳聚糖的分子量为4×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀醋酸，质量分数为1.0%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为4.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为4.0×106，醛基含量为35%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按3：2的体积比在室温下混合，并搅拌25分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为3：3：2，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃ 下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g，25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL 后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50-70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：3.0. 分钟, 压缩率41.6.5%，压缩载荷21.3KPa; 注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周没有较大变化，第8周到第12 周没有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤隆起程度较大，24 周时材料还有进三分之一未完全降解； SEM染色分析：1 周时小鼠皮下有轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
实施例五：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为4.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为动物胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为5.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为90%，壳聚糖的分子量为5×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀乳酸，质量分数为1.0%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为4.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为5.0×106，醛基含量为40%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按2：1的体积比在室温下混合，并搅拌30分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为3：2：1，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃ 下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g， 25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL 后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm ×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50-70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：2.0分钟, 压缩率43.3%，压缩载荷21.3KPa; 注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周没有较大变化，第8周到第12 周没有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤隆起程度较大，24 周时材料还有进二分之一未完全降解； SEM染色分析：1 周时小鼠皮下有轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
实施例六：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为4.0%的胶原蛋白溶液；
其中，胶原蛋白为类人胶原蛋白。
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为5.0%的壳聚糖溶液；
壳聚糖的脱乙酰度为95%，壳聚糖的分子量为5×105 道尔顿；
稀酸溶液选取稀乳酸，质量分数为1.0%。
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为5.0%的双醛淀粉溶液；
双醛淀粉分子量为5.0×106，醛基含量为40%。
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按3：1的体积比在室温下混合，并搅拌30分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为4：3：1，将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
本例水凝胶材料经过如下试验：
在1ml的注射器中按上述步骤直接制备所需凝胶，将注射器倒置，液体不再流动则视为凝胶形成，并记录凝胶形成时间，测定压缩率以及压缩载荷。放于4℃ 下备用。选优良的昆明小鼠50只，雄性，体重25-30g，25只为实验组，25只为阴性对照组，试验前一周常规饲养，待小鼠适应新环境后，提前一天用脱毛剂对小鼠背部脱毛备皮，注射时常规麻醉，使用碘伏进行皮肤消毒，75%酒精脱碘，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻提小鼠皮肤，右手持注射器，将针头与皮肤呈30°角刺入皮下，确保不刺入肌肉，注射0.2mL后缓慢拔出针头，然后用手指稍压针刺部位片刻，以防止凝胶外漏。于1周、2周、8周、12周和24周试验组和阴性对照组分别处死5 只小鼠，将注射凝胶部位皮肤连同材料一起取下，先做大体观察并记录试验结果，用刀片切成宽为1.0cm×1.0cm的小块，立即用2.5%戊二醛固定，固定完成后做成切片（50-70nm），透射电镜（SEM）观察做病理分析。
本次实验结果：
注射后形凝胶时间：2.0 分钟, 压缩率47.6%，压缩载荷21.9KPa; 注射部位标本大体观察结果：1 周时注射部位皮肤基本恢复正常，与阴性对照组无显著差异，2 周、8周、12 周和24 周时注射部位与阴性对照组外观无异，注射部位形成的凝胶隆起逐渐变小，其中第2 周到第8 周没有较大变化，第8周到第12 周没有较为显著的变化，第12 周到第24 周注射部位隆起下降程度不明显，可见注射处皮肤隆起程度较大，24 周时材料还有进二分之一未完全降解； SEM染色分析：1 周时小鼠皮下有轻微的炎症，材料植入处皮肤有少量的炎细胞浸润，处于急性炎症的恢复晚期；2 周时与阴性对照组相比极轻微炎症几乎消除，8周、12 周和24 周材料周围细胞种类和形态正常，与阴性对照组无显著差异。试验组1 周和2 周时材料和组织界面明显，8周、12 周和24 周材料和组织界面模糊，材料降解过程较为缓慢。
结论：本例水凝胶材料体外成凝胶速度较快，注射后小鼠皮下急性炎症期短，不引起慢性炎症，生物相容性好，材料降解时间大于24 周，可满足临床应用需求，是一种较为理想的临床修复材料。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为2.0%-4.0%的胶原蛋白溶液；
步骤二：将壳聚糖用稀酸溶液溶解成质量分数为1.0%-5.0%的壳聚糖溶液；
步骤三：将双醛淀粉用注射用水溶解成质量分数为2.0%~5.0%的双醛淀粉溶液；
步骤四：将胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液按（1-3）：（1-3）的体积比在室温下混合，并搅拌10-30分钟使之混合均匀，并同时将pH值调整至7.5；
步骤五：按照双醛淀粉溶液：胶原蛋白溶液：壳聚糖溶液的体积比为（1-4）：（1-3）：（1-3），将双醛淀粉溶液加入步骤四中的混合溶液中，并快速搅拌1分钟，使之形成质地均匀的共价交联水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤一中，所述的胶原蛋白为动物胶原蛋白或类人胶原蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤二中，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80%-95%，壳聚糖的分子量为1×105-5×105 道尔顿。
4.根据权利要求3所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤二中，所述的稀酸溶液选自稀盐酸、稀醋酸或稀乳酸，质量分数为0.5%-1.0%。
5.根据权利要求4所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤三中，所述的双醛淀粉分子量为1.0×106-5.0×106，醛基含量为30%-40%。
6.如权利要求5所述的一种胶原蛋白共价交联水凝胶的制备方法制得的胶原蛋白共价交联水凝胶。
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