CN103112955A - 耐辐射奇球菌r1对孔雀石绿废水进行降解与脱色的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了耐辐射奇球菌R1对孔雀石绿废水进行降解与脱色的方法，属微生物环境应用技术领域。方法包括：（1）种子液的培养；（2）发酵液的培养；（3）染料废水脱色等步骤工艺。本发明提供了耐辐射奇球菌R1的一种新的应用领域，其对孔雀石绿染料废水的脱色效率高，染料浓度100mg/L时，0.5h的脱色率达到99％以上，染料浓度500mg/L时，2h的脱色率达到95%；并对脱色降解产物进行分析明确了降解途径，经发光菌急性毒性实验表明该降解产物的毒性比降解前明显降低。本发明可在相关染色企业及研究机构中推广应用。

Description

耐辐射奇球菌R1对孔雀石绿废水进行降解与脱色的方法

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及应用耐辐射奇球菌R1降解与脱色三甲苯烷类染料孔雀石绿的方法。

技术背景

孔雀石绿属于三甲苯烷类染料，为蓝绿色有金属闪光的结晶，呈弱碱性，易溶于水，广泛用于真丝、羊毛、皮革、麻制品、陶瓷制品、棉布等的染色，并因其对鱼体寄生虫和鱼卵中霉菌等杀灭效果非常显著而在水产养殖上已被广泛应用。但已有研究表明孔雀石绿具有高残留、高生物毒性和致癌、致畸、致突变等的毒副作用，可在鱼体内长时间残留，并且在较低浓度时对哺乳动物细胞都是高毒性的，会威胁人体健康, 造成潜在的环境危害。鉴于其生物毒性和致癌性，孔雀石绿在2002年已被全世界禁止使用,但一些地区的环境中仍存在孔雀石绿。因此，对孔雀石绿等三苯基甲烷类染料进行脱色降解研究，对于治理染料污染仍具有重要的理论意义和实用价值。

目前，对染料脱色降解主要是利用化学脱色剂的化学混凝法和利用活性污泥的生物脱色法。与化学方法相比，微生物处理方法是环境友好型的染料废水处理方法。上世纪80年代开始，利用微生物对染料废水进行降解已逐渐发展成为实用的水处理技术。许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的对孔雀石绿具有脱色作用的微生物主要为真菌和细菌。但从实用性考虑，目前有关脱色菌的研究报道还存在有效率不高、降解产物及降解途径不明确等的问题。张丽芳等从土壤中分离、纯化获得一株真菌毛霉，在孔雀石绿浓度为50mg/L时具有较好的脱色能力。（张丽芳, 孙玉凤. 真菌M2对染料脱色的研究. 沈阳理工大学学报. 2006，25（6）：83-87.）李妮等分离到一株无色杆菌属的菌株，孔雀石绿初始浓度小于50 mg/L时有最佳脱色率，在最适条件下脱色8 h，孔雀石绿脱色率达到90%以上。孔雀石绿在脱色过程中被降解，生成了其他代谢产物。（李妮等.一株无色杆菌属菌株对孔雀石绿的脱色降解. 应用与环境生物学报. 2009，15(4):529-533.）专利号为200710030875.6的中国发明专利公开了“黄金短杆菌AN3及其降解孔雀石绿的染料的应用”，黄金短杆菌AN3对浓度为50 mg/L的孔雀石绿8h的去除率为61.4％，16h内的去除率为97.3％，主要以去苯环脱毒的方式降解孔雀石绿。

耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans (DR)是一种红色的、非流动性、不产生孢子的球形细菌。DR是地球最耐辐射的生物之一，是目前研究DNA损伤与修复较为理想的模式生物，故对DR的研究大多集中在辐射的损伤和修复方面。本发明以耐辐射奇球菌R1为降解菌株，研究了不同条件下对孔雀石绿的脱色率，并对降解产物进行了分析，同时对脱色降解后产物的毒性效应进行分析。

发明内容

本发明目的是，针对已有脱色菌研究所存在效率不高、降解产物及降解途径不明确等的缺陷，提供一种对孔雀石绿染料废水脱色降解途径明确、脱色降解效率高、产物毒性较降解前明显降低的方法。

本发明目的通过如下技术方案来实现：

耐辐射奇球菌R1对孔雀石绿废水进行降解与脱色的方法，该方法按以下步骤进行：

（1）种子液的培养：用接种环挑取一环斜面保存的耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）R1菌种转接到50mL的种子培养基中，在30℃、摇床转速180r/min条件下，培养16h得种子培养液；所述种子培养基的组分为：酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L，pH自然，121℃灭菌20 min，冷却；

（2）发酵液的培养：取种子培养液20-40mL接种到400mL发酵培养基中，发酵培养基组分同种子培养基，于30℃、转速180r/min条件下培养16-20 h至发酵液湿菌体量为7.8-8.5g/L时止；

（3）染料废水脱色：在上述培养结束的发酵菌液中加入染料，使染料终浓度为50-500mg/L成为模拟染料废水，调节pH5-9，放入摇床，转速180r/min，25-55℃，脱色0.5-3h；脱色结束后混合液离心10min，转速10000r/min，上清液即为最终脱色液。

本发明的有益效果是：

一、提供了耐辐射奇球菌R1的一种新的应用领域，且扩宽了降解染料的菌种范围。

二、耐辐射奇球菌R1对孔雀石绿染料废水的脱色效率高，在染料浓度100mg/L时，0.5h的脱色率达到99％以上，在染料浓度500mg/L时，2h的脱色率达到95%（见实施例3）。

三、本发明对脱色降解产物做了分析，明确了本发明对孔雀石绿染料废水的降解途径为脱苯环，生成氨基苯酚类和二苯甲酮类物质（图3）；经发光菌急性毒性实验表明降解产物的毒性比降解前明显降低（见试验例2）。

附图说明

图1 孔雀石绿脱色降解产物的气相谱图

其中，a为孔雀石绿；b,c为降解产物

图2 孔雀石绿标准品的气相谱图

其中，a为孔雀石绿

图3 孔雀石绿的降解途径示意图

其中，a为孔雀石绿；b,c为降解产物

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

对实施例所涉材料与方法的说明：

耐辐射奇球菌R1：由浙江大学原子核农业科学研究所华跃进教授赠送，该菌种已于2010年在《生物工程学报》第26卷10期1451−1455页发表，文章名称为“耐辐射奇球菌类胡萝卜素C3’,4'-脱氢酶底物特异性”；该菌种现已在浙江省农业科学院园艺研究所食用菌实验室繁殖并保存，公众可自本专利申请日起20年内向浙江省农业科学院园艺研究所食用菌实验室获取；

孔雀石绿：分析纯，含量≥98％，天津博迪化工股份有限公司生产；

脱色率的计算方法：孔雀石绿的特征性吸收波峰为617nm，脱色率就是通过紫外-可见光扫描式分光光度仪测试在最大吸收波峰处峰值的降低情况来进行计算的。上清液在617nm处测吸光度。脱色率的计算公式为：

脱色率(％ ) ＝ 100(A-B)/A

其中A是未经脱色的617nm 吸光度，B为脱色后的617nm 吸光度。

降解产物的测定方法：采用Agilent 7890C/5973N GC/MS分析测定，色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30m×0.32mm ×0.25μm)。质谱检测器(MSD)采用EI电离源(70eV)，离子源温度为230℃。载气 (He) 流量为1.0mL/min，进样量1μL，进样口温度为250℃，采用不分流模式。色谱柱采用升温程序。升温程序如下：50℃保持1min，然后以10℃/min的速率升温到270℃，然后保持7min。产物的鉴定采用GC/MS中配备的Nist-08标准谱图库，匹配度大于90%。

发光菌急性毒性实验：根据国家标准方法BG/T 1544-1995，采用发光菌为指示生物，对脱色液进行15min急性毒性实验，采用DXY-2型发光监细菌监测仪测定发光度，由下式计算发光菌发光强度的相对抑制率（I％）：

I％＝（1-样品发光度/对照发光度）×100％

实施例1：

（1）种子液的培养：用接种环挑取一环斜面保存的耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）R1菌种转接到50mL的种子培养基中，在30℃、摇床转速180r/min条件下，培养16h得种子培养液；所述种子培养基的组分为：酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L，pH自然，121℃灭菌20 min，冷却；

（2）发酵液的培养：取种子培养液40mL接种到400mL发酵培养基中，发酵培养基的组分、制备工艺同种子培养基，于30℃、转速180r/min条件下培养20 h，按上述条件得到的发酵液湿菌体量为8.5g/L；

（3）染料废水脱色：在上述培养结束的发酵菌液中加入孔雀石绿染料，使染料终浓度为200mg/L成为模拟染料废水，pH6.8（自然），放入摇床，转速180r/min，25-55℃，脱色0.5h；

（4）脱色率的测定：将脱色液分别离心10min，转速10000 r/min，收集上清液，测定脱色率，结果在25至55℃不同的脱色温度，在同样脱色0.5h工艺条件下，取得了88.0％至97.2％的不同脱色率，其中以45℃的最高，达到97.2％的脱色率（见表1）。

表1 不同脱色温度对脱色率的影响

温度（℃）	25	30	35	40	45	50	55
								脱色率（％）	88.0	90.6	92.6	94.0	97.2	96.1	94.2

实施例2：

（1）种子液的培养：用接种环挑取一环斜面保存的耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）R1菌种转接到50mL的种子培养基中，30℃，摇床转速180r/min，培养16h得种子培养液；所述种子培养基的组分、制备工艺同于实施例1；

（2）发酵液的培养：取种子培养液30mL接种到400mL发酵培养基中，于30℃，摇床转速180r/min，培养18 h；所述的发酵培养基组成同种子培养基；按上述条件得到的发酵液湿菌体量为8.0g/L；

（3）染料废水脱色：在上述发酵菌液中加入孔雀石绿染料，并使染料终浓度为200mg/L成为模拟染料废水，调节pH5-9，放入摇床，转速180r/min，45℃，脱色0.5h；

（4）脱色率的测定：将上述脱色液分别离心10min，转速10000 r/min，收集上清液，测定脱色率，结果在5至9的不同PH，在同样45℃、脱色0.5h工艺条件下，取得了16.6％至96.2％的不同脱色率，其中以PH6.8（自然）的最高，达到96.2％的脱色率（见表2）。

表2 不同脱色pH对脱色率的影响

pH	5	6	6.8（自然）	7.5	8	9
							脱色率（％）	76.0	76.5	96.2	55.2	33.5	16.6

实施例3：

（1）种子液的培养：用接种环挑取一环斜面保存的耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）R1菌种转接到50mL的种子培养基中，30℃，摇床转速180r/min，培养16h得种子培养液；所述种子培养基的组分、制备工艺同于实施例1；

（2）发酵液的培养：取种子培养液20mL接种到400mL发酵培养基中，于30℃，摇床转速180r/min，培养16 h；所述的发酵培养基组成同种子培养基；按上述条件得到的发酵液湿菌体量为7.8g/L。

（3）染料废水脱色：在上述发酵菌液中加入孔雀石绿染料，并使染料终浓度为50-500mg/L成为模拟染料废水，pH自然（6.8），放入摇床，转速180r/min，45℃，脱色0.5-3h；

（4）脱色率的测定：将上述脱色液离心10min，转速10000 r/min，收集上清液，测定脱色率，结果50-500mg/L的不同染料浓度、0.5至3h的不同脱色时间，在同样45℃、PH6.8工艺条件下，取得了76.5％至100％的不同脱色率（见表3）。

表3 不同脱色时间、染料浓度对脱色率的影响

试验例1：

将实施例3中，染料浓度为100mg/L，脱色0.5h后得到的脱色上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取2次，萃取液用无水硫酸钠脱水，旋转蒸发至2 mL，进GC/MS分析测定。

图1为孔雀石绿标准品的气相谱图，图2为孔雀石绿的降解产物的谱图，产物的鉴定采用GC/MS中配备的Nist-08标准谱图库，匹配度大于90%，确定b，c为孔雀石绿的降解产物，其结构如图3所示。

试验例2：

将实施例3中，染料浓度为100mg/L，脱色0h（未脱色），0.5h，1h后得到的脱色上清液，进行15min发光菌急性毒性分析。物质的毒性越大对发光菌的抑制率越高，表4说明，脱色降解产物的毒性比降解前明显降低。

表4 脱色液对发光菌毒性分析

脱色时间（h）	0	0.5	1
				抑制率I（％）	95.3	26.5	24.5

Claims (1)

1.耐辐射奇球菌R1对孔雀石绿废水进行降解与脱色的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）种子液的培养：用接种环挑取一环斜面保存的耐辐射奇球菌R1菌种转接到50mL的种子培养基中，在30℃、摇床转速180r/min条件下，培养16h得种子培养液；所述种子培养基的组分为：酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L，pH自然，121℃灭菌20 min，冷却；

（2）发酵液的培养：取种子培养液20-40mL接种到400mL发酵培养基中，发酵培养基组分同种子培养基，于30℃、转速180r/min条件下培养16-20 h至发酵液湿菌体量为7.8-8.5g/L时止；

（3）染料废水脱色：在上述培养结束的发酵菌液中加入染料，使染料终浓度为50-500mg/L成为模拟染料废水，调节pH5-9，放入摇床，转速180r/min，25-55℃，脱色0.5-3h；脱色结束后混合液离心10min，转速10000r/min，上清液即为最终脱色液。

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