CN102559827A - 一种培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，通过黄浆水的收集、除杂，pH调整，添加培养物、灭菌，菌种的活化、培养种子，发酵培养，菌体破壁，类胡萝卜素萃取，干品制备获得。本发明利用豆腐等豆制品加工制作过程中副产物黄浆水来培养细菌发酵生产天然类胡萝卜素，实现了黄浆水的废物利用，提高了资源利用效率，并降低了豆制品加工企业对环境造成的污染，有利于保护环境，每升黄浆水发酵液可得类胡萝卜素干品229.8mg，优于常规培养发酵提取方法226.2%。本发明先对菌体细胞进行酸热破壁处理，再用乙醇萃取，提取完全、快速，生产工艺流程简单、生产成本低廉，产品无毒性残留、安全性高。
Description
技术领域
本发明属发酵技术领域，涉及一种利用豆制品黄浆水培养耐辐射奇球菌发酵生产天然类胡萝卜素的方法。
背景技术
豆腐是源于中国的传统功能性食品，黄浆水是豆腐等豆制品制作过程中形成的副产物。据研究，黄浆水中固形物的含量在l％以上，其中蛋白质含量约为0.3％、脂肪含量约为0.08％、还原糖含量为0.15％左右，此外，还含有大豆异黄酮、大豆皂苷等多种功能性成分。但是大多数豆制品企业在加工过程中将大量的黄浆水直接排放入下水道、江河，不仅没有充分利用其营养价值，形成了一种浪费，而且将其直接排放，对环境造成了严重污染，不利于环境保护。
类胡萝卜素是一类脂溶性色素，被广泛应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。近年来研究证明，类胡萝卜素不仅有很高的营养价值，而且具有保健功效，具有较高的抗氧化能力，防治血管硬化、抗衰老及抑制癌细胞生长作用。目前，大部分企业使用的类胡萝卜素大多是化学合成产品，合成技术复杂、在合成的产品中少量成分有毒，有致染色体畸变作用，而天然类胡萝卜素则不存在这方面的问题。目前利用发酵法生产天然类胡萝卜素的微生物有霉菌、细菌和酵母菌等。耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)是非致病的革兰氏阳性微球菌，是迄今为止发现的对电离辐射、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂耐受性最强的一类细菌，这种菌具有抗氧化能力的主要原因之一是其能合成一种特有的类胡萝卜素—Deinoxanthin，且含量积累高，其抗氧化活性高于β-类胡萝卜素、番茄红素和虾青素。因此，利用耐辐射奇球菌进行发酵生产天然类胡萝卜素的开发利用具有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的是提供一种耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，该方法是针对豆制品制作副产物黄浆水的大量浪费，污染环境以及耐辐射奇球菌特有高抗氧化能力新型类胡萝卜素Deinoxanthin的开发利用，提供的一种能够实现黄浆水的废物综合利用，生产工艺流程简单、生产成本低廉、容易操作的利用黄浆水培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，所用菌株为耐辐射奇球菌R1，来源于美国典型物保藏中心，保藏号：ATCC No.13939。
本发明方法通过以下技术方案实现：
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中的黄浆水收集后，使用多层纱布过滤或进行离心除去其中的杂质、固形物；
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，调整黄浆水的pH值到6.8—7.3之间；
（3）添加培养物、灭菌：将上述（2）中黄浆水添加质量体积百分浓度为0.5-1%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用高温高压灭菌法（121℃，30分钟）灭菌后灌装到发酵瓶中作为黄浆水培养基（Soy whey containing glucose,简写SWG）发酵培养；
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌R1划线接种于种子培养基TGY（0.5%蛋白胨tryptone、0.1%葡萄糖glucose、0.3%酵母提取物yeast extract、1.5%琼脂）固体培养基上，28℃中培养36h，挑取单菌落接种于液体种子培养基TGY（不含琼脂）中，30℃，220rpm/min培养至对数生长期，其OD600值1.0；所用菌株为耐辐射奇球菌R1，来源于美国典型物保藏中心，保藏号：ATCC No.13939；
（5）发酵培养：将上述（4）中活化的液体种子接入上述（3）中以黄浆水配制成的培养基（SWG）进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5；
（6）菌体细胞破壁：取出（5）中菌体发酵液离心去上清，收集沉淀菌体，水洗湿菌体除去残留发酵液，之后加入物料体积比1：3的1.3M盐酸，100℃沸水中加热2min后迅速冷却进行破壁，之后离心，沉淀菌体细胞水洗2次离心去上清，除去残留盐酸，收集菌体细胞；破壁剂盐酸离心收集后可回收重复使用；
（7）类胡萝卜素萃取：在（6）中的菌体细胞中加入物料质量/体积比为1：5的预冷有机溶剂乙醇，冰浴下5min萃取类胡萝卜素，离心收集上清，提取3次至菌体变白；
（8）类胡萝卜素干品制备：将（7）中的类胡萝卜素提取液于真空离心浓缩干燥，干粉即为类胡萝卜素干品。
本发明利用了豆制品黄浆水培养耐辐射奇球菌发酵生产天然类胡萝卜素物质，为综合利用豆制品黄浆水开发了一种新的用途，实现废物充分利用，从而提高豆制品企业经济效益，又减少环境污染，生产的天然类胡萝卜素可用于食品和饲料添加剂中使用。本发明的有益效果是：（1）本发明首先选择了豆腐等豆制品加工制作过程中副产物黄浆水来培养耐辐射奇球菌发酵生产天然类胡萝卜素，开创了豆制品黄浆水利用的新途径，实现了废物利用，变废为宝，提高了资源利用效率。（2）本发明利用了豆腐等豆制品加工制作过程中环境排放物黄浆水作为细菌培养基发酵生产类胡萝卜素，减轻了环境压力，降低了豆制品加工企业对环境造成的污染，有利于保护环境。（3）本发明把豆制品黄浆水与产天然类胡萝卜素原核生物—耐辐射奇球菌进行了有效结合，菌株繁殖快，生产周期短，菌体破碎较容易等特点，每升黄浆水发酵液可得新型天然类胡萝卜素Deinoxanthin干品229.8mg，充分利用了微生物发酵生产类胡萝卜素的高效、方便、易实现工业化的特点。（4）本发明对菌体细胞先进行酸热破壁处理，之后乙醇萃取的方法，效率大大提高，菌体细胞中类胡萝卜素提取率高，且产品没有毒性残留、安全性高，破壁剂盐酸离心收集后可回收重复使用。（5）本发明具有生产工艺流程简单、生产成本低廉、容易操作的优点，适合于大规模的生产。
附图说明
图1为本发明方法的工艺流程图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述，但本发明并不受这些内容所限制。
实施例1
以黄浆水、1%葡萄糖、0.1%硫酸镁、弱酸性pH6.8的培养基发酵培养，酸热破壁、乙醇提取为例
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中黄浆水收集后，常温下5000rpm离心20分钟除去其中的杂质与固形物。
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，用2.0mol/L的NaOH调整黄浆水的pH值到6.8。
（3）黄浆水的灭菌：将上述（2）中黄浆水添加1%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用高温高压灭菌法，121℃，30分钟，灭菌后灌装到发酵瓶中作为培养基（SWG）发酵培养。
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌划线接种于种子培养基，0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖、1.5%琼脂固体培养基（TGY）上，恒温箱中培养48h，挑取单菌落接种于液体种子培养基TGY（不含琼脂）中，30℃，220rpm/min培养至对数生长期，OD600值1.0；
（5）发酵培养：将上述（4）中活化的液体种子以体积比2%接种量接入上述（3）中以黄浆水配制成的培养基（SWG）进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5；
（6）菌体细胞破壁：取出（5）中菌体发酵液，6500rpm离心5min，去上清，湿菌体水洗2次除去残留发酵液，之后加入物料体积比1：3的1.3M盐酸，100℃加热2min后迅速冷却进行破壁，之后6500rpm离心5min去上清，菌体细胞水洗2次离心除去残留盐酸，收集沉淀菌体细胞。
（7）类胡萝卜素萃取：在（6）中的菌体细胞中加入物料比1：5的预冷有机溶剂乙醇，冰浴下5min萃取类胡萝卜素，7000rpm离心10min，收集上清，提取多次直至菌体变白，合并提取液。
（8）类胡萝卜素干品制备：将（7）中的类胡萝卜素提取液于30℃真空离心浓缩干燥 ，可得类胡萝卜素干粉。
本实施例中每升黄浆水发酵液可生产得天然类胡萝卜素干粉229.8mg，而对照常规培养基（TGY）155.2 mg，产量提高了48.1%。
实施例2
以黄浆水、0.5%葡萄糖、0.1%硫酸镁、弱碱性pH7.3的培养基发酵培养，酸热破壁、乙醇提取为例
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中黄浆水收集后，常温下5000rpm离心20分钟除去其中的杂质与固形物。
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，用2.0mol/L的NaOH调整黄浆水的pH值到7.3。
（3）黄浆水的灭菌：将上述（2）中黄浆水添加0.5%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用高温高压灭菌法，121℃，30分钟，灭菌后灌装到发酵瓶中作为培养基（SWG）发酵培养。
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌划线接种于种子培养基，0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖、1.5%琼脂固体培养基（TGY）上，恒温箱中培养48h，挑取单菌落接种于液体种子培养基TGY（不含琼脂）中，30℃，220rpm/min培养至对数生长期，OD600值1.0；
（5）发酵培养：将上述（4）中活化的液体种子以体积比2%接种量接入上述（3）中以黄浆水配制成的培养基（SWG）进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5；
（6）菌体细胞破壁：取出（5）中菌体发酵液，6500rpm离心5min，去上清，湿菌体水洗2次除去残留发酵液，之后加入物料体积比1：3的1.3M盐酸，100℃加热2min后迅速冷却进行破壁，之后6500rpm离心5min去上清，菌体细胞水洗2次离心除去残留盐酸，收集沉淀菌体细胞。
（7）类胡萝卜素萃取：在（6）中的菌体细胞中加入物料比1：5的预冷有机溶剂乙醇，冰浴下5min萃取类胡萝卜素，7000rpm离心10min，收集上清，提取多次直至菌体变白，合并提取液。
（8）类胡萝卜素干品制备：将（7）中的类胡萝卜素提取液于30℃真空离心浓缩干燥 ，可得类胡萝卜素干粉。
本实施例中每升黄浆水发酵液可生产得类胡萝卜素181.0mg，而对照常规培养基（TGY）148.5 mg，产量提高了21.9%。
实施例3：
以黄浆水、1%葡萄糖、0.1%硫酸镁、弱酸性pH6.8的培养基发酵培养，酸热破壁、丙酮/甲醇提取为例
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中黄浆水收集后，常温下5000rpm离心20分钟除去其中的杂质与固形物。
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，用2.0mol/L的NaOH调整黄浆水的pH值到7.3。
（3）黄浆水的灭菌：将上述（2）中黄浆水添加1%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用高温高压灭菌法，121℃，30分钟，灭菌后去灌装到发酵瓶中作为培养基（SWG）发酵培养。
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌划线接种于种子培养基，0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖、1.5%琼脂固体培养基（TGY）上，恒温箱中培养48h，挑取单菌落接种于液体种子培养基TGY（不含琼脂）中，30℃，220rpm/min培养至对数生长期，OD600值1.0；
（5）发酵培养：将上述（4）中活化的液体种子以体积比2%接种量接入上述（3）中以黄浆水配制成的培养基（SWG）进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5；
（6）菌体细胞破壁：取出（5）中菌体发酵液，6500rpm离心5min，去上清，湿菌体水洗2次除去残留发酵液，之后加入物料体积比1：3的1.3M盐酸， 100℃沸水加热2min后迅速冷却进行破壁，之后6500rpm离心5min去上清，菌体细胞水洗2次离心除去残留盐酸，收集沉淀菌体细胞。
（7）类胡萝卜素萃取：在（6）中的菌体细胞中加入物料比1：5的预冷有机溶剂丙酮/甲醇（V：V=7：2），冰浴下5min萃取类胡萝卜素，7000rpm离心10min，收集上清，提取多次直至菌体变白，合并提取液。
（8）类胡萝卜素干品制备：将（7）中的类胡萝卜素提取液于30℃真空离心浓缩干燥 ，可得类胡萝卜素干粉。
本实施例中每升黄浆水发酵液可生产得类胡萝卜素干粉233.3 mg，相比同等条件下乙醇提取229.8mg，效果稍好但差别不大，乙醇提取产品安全性高，即使少量残留也不会造成残留毒性，更具应用价值。
实施例4
以黄浆水、1%葡萄糖、0.1%硫酸镁、弱酸性pH6.8的培养基发酵培养，丙酮甲醇低温直接萃取为例
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中黄浆水收集后，常温下5000rpm离心20分钟除去其中的杂质与固形物。
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，用2.0mol/L的NaOH调整黄浆水的pH值到6.8。
（3）黄浆水的灭菌：将上述（2）中黄浆水添加1%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用高温高压灭菌法，121℃，30分钟，灭菌后灌装到发酵瓶中作为培养基（SWG）发酵培养。
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌划线接种于种子培养基，0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖、1.5%琼脂固体培养基（TGY）上，恒温箱中培养48h，挑取单菌落接种于液体种子培养基TGY（不含琼脂）中，30℃，220rpm/min培养至对数生长期，OD600值1.0；
（5）发酵培养：将上述（4）中活化的液体种子以体积比2%接种量接入上述（3）中以黄浆水配制成的培养基（SWG）进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5；
（6）类胡萝卜素萃取：取出（5）中菌体发酵液，6500rpm离心5min，去上清，湿菌体水洗2次除去残留发酵液，之后加入物料比1：5的预冷有机溶剂丙酮/甲醇（V：V=7：2），冰浴下摇床上放置40分钟，萃取类胡萝卜素，7000rpm离心10min，收集上清，提取多次，合并提取液。
（7）类胡萝卜素干品制备：将（6）中的类胡萝卜素提取液于30℃真空离心浓缩干燥 ，可得类胡萝卜素干粉。
本实施例中每升黄浆水发酵液可提取生产得类胡萝卜素86.8mg，较酸热破壁后乙醇提取的产量229.8 mg大大降低。
实施例5 耐辐射奇球菌发酵生产天然类胡萝卜素的工艺对比试验
选择耐辐射奇球菌的常规培养发酵提取方法与本发明进行对比试验，与本方法的主要区别是，常规培养方法同样经历配制培养基、培养基灭菌、菌种的活化、种子的培养、发酵培养、类胡萝卜素萃取、干品制备过程，其发酵培养基为TGY，成分0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖，pH7.0，其主要原料为商品材料，价格昂贵，类胡萝卜素萃取中直接选用有机溶剂丙酮：甲醇（V：V=7：2）低温摇床上直接萃取类胡萝卜素，萃取时间长，需要重复3次以上，每次需要40分钟，或者选用有机溶剂甲醇、氯仿进行二次萃取进行。结果参见表1。
表1
| 方法 | Deinoxanthin产量（mg/L） | 提取时间（min） |
| 常规培养发酵提取方法 | 70.5 | 120 |
| 本发明 | 229.8 | 20 |
结果显示，本发明方法选用的黄浆水则为豆制品加工后的副产物，属废物的回收开发利用，且提取方法中萃取时间短，破壁萃取整个过程仅需要20分钟，选用乙醇进行萃取没有毒性残留，应用本方法培养发酵耐辐射奇球菌每升发酵液可生产天然类胡萝卜素229.8mg，而常规培养发酵提取方法每升发酵液仅生产类胡萝卜素70.5mg,本方法类胡萝卜素产量提高了226.2%，且大大节省时间成本，产品安全性高。
Claims (4)
1.一种培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，其特征在于通过以下步骤实现：
（1）黄浆水的收集、除杂：将豆腐等豆制品制作过程中的黄浆水收集后，使用多层纱布过滤或进行离心除去其中的杂质、固形物；
（2）黄浆水的pH调整：黄浆水自身酸性强，调整黄浆水的pH值为6.8-7.3；
（3）添加培养物、灭菌：将上述（2）中黄浆水添加质量体积百比为0.5-1%的葡萄糖、0.1%硫酸镁，采用121℃、30分钟高温高压灭菌法灭菌，然后灌装到发酵瓶中作为黄浆水培养基发酵培养；
（4）菌种的活化、种子培养：将耐辐射奇球菌R1划线接种于种子培养基TGY固体培养基上，28℃中培养36h，挑取单菌落接种于不含琼脂的液体种子培养基TGY中，30℃、220rpm/min培养至对数生长期；
（5）发酵培养：将步骤（4）中的液体种子接入步骤（3）中以黄浆水配制成的培养基进行发酵培养，30-32℃培养48h，至菌群稳定期；
（6）菌体细胞破壁：取出步骤（5）中菌体发酵液离心去上清，收集沉淀菌体，水洗湿菌体除去残留发酵液，加入物料体积比1：3的1.3M盐酸，100℃沸水中加热2min后迅速冷却进行细胞破壁，离心，沉淀菌体细胞水洗2次离心去上清，除去残留盐酸，收集菌体细胞；
（7）类胡萝卜素萃取：在步骤（6）的菌体细胞中加入物料质量/体积比为1：5的预冷有机溶剂乙醇，冰浴下5min萃取类胡萝卜素，离心收集上清，提取3次至菌体变白；
（8）类胡萝卜素干品制备：将步骤（7）中的类胡萝卜素提取液于真空离心浓缩干燥，干粉即为类胡萝卜素干品。
2.根据权利要求1所述的一种培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤（4）所述的菌种活化、种子培养至对数生长期，其OD600值1.0；种子培养基TGY由0.5%蛋白胨、0.1%葡萄糖、0.3%酵母提取物、1.5%琼脂组成。
3.根据权利要求1所述的一种培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤（5）所述的发酵培养至菌群稳定期，其OD600值8.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的一种培养耐辐射奇球菌生产天然类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤（6）细胞破壁后离心，盐酸回收后重复使用。
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