CN112094798A - 提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基及其应用 - Google Patents

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CN112094798A CN202011000559.6A CN202011000559A CN112094798A CN 112094798 A CN112094798 A CN 112094798A CN 202011000559 A CN202011000559 A CN 202011000559A CN 112094798 A CN112094798 A CN 112094798A
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Abstract

本申请涉及微生物培养的技术领域，提供了一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基及其应用。所述培养基包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L，采用了添加高浓度硅酸盐的培养基，降低了细胞聚集程度，保证在培养过程中，平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提高平滑菱形藻细胞的比表面积，进而提高发酵过程中藻细胞与环境交换介质等传质传热效率，以获得更高的岩藻黄素和EPA产量，促进岩藻黄素的广泛使用。

Description

提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基及其应用
技术领域
本申请属于微生物培养的技术领域，尤其涉及一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基及其应用。
背景技术
岩藻黄素(fucoxanthin)也被称为褐藻黄素、岩藻黄质，是类胡萝卜素中叶黄素类的一种天然色素，占大约700种天然出现的类胡萝卜素总量的10％以上，颜色呈淡黄至褐色，为褐藻、硅藻、金藻及黄绿藻所含有的色素。广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中。具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥、神经细胞保护，增加体内的ARA(花生四烯酸)和EPA(二十二碳六烯酸)的含量等药理作用，可作为药物、护肤美容产品以及保健品市场上得以广泛应用。
平滑菱形藻是一种单细胞藻类，属于硅藻门，羽纹硅藻纲，双菱藻目，菱形藻属，具有异养发酵培养的能力。平滑菱形藻中岩藻黄素的含量高，可以稳定实现连续工业化生产，能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物，较大型海藻来源的岩藻黄素更安全。但是目前利用对平滑菱形藻的培养生产岩藻黄素的产量非常低，生产成本高，不利于规模化生产，因此限制了岩藻黄素的广泛使用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基及其应用，旨在解决现有技术中平滑菱形藻的培养生产岩藻黄素的产量低且生产成本高的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L。
第二方面，本申请提供一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，包括如下步骤：
根据所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基并进行灭菌处理，得到无菌培养基；
提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将所述种子液按照体积比为5％～20％的接种量接种至所述无菌培养基中进行摇床培养，得到发酵液；
对所述发酵液进行提取，得到所述岩藻黄素。
本申请第一方面提供的一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，所述培养基包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L，由于硅元素是硅藻生长所需的营养元素之一，采用了添加高浓度硅酸盐的培养基，降低了细胞聚集程度，保证在培养过程中，平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提高平滑菱形藻细胞的比表面积，进而提高发酵过程中藻细胞与环境交换介质等传质传热效率，以获得更高的岩藻黄素和EPA产量。因此，采用该含有高浓度硅酸盐的培养基进行平滑菱形藻培养，不仅不会对平滑菱形藻细胞造成胁迫，而且能够大量提高岩藻黄素以及EPA的产量，促进岩藻黄素的广泛使用。
本申请第二方面提供的一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，该方法以含有浓度为800～3000mg/L的硅酸盐的培养基进行培养，采用高浓度硅酸盐含量的培养基进行平滑菱形藻培养，在培养过程中，使平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提供了藻细胞的比表面积，促进发酵过程中与环境交换介质的效率，进而提高岩藻黄素和EPA的产量。该培养方法能够大量提高岩藻黄素以及EPA的产量，操作简单，同时也能缩短生产周期，提高生产产率及生产效率，有效降低生产成本，有利于规模化生产，提高了岩藻黄素的广泛使用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的实施例2、对比例1和对比例2的生物量比生长速率的比值的分析图。
图2是本申请实施例提供的实施例2、对比例1和对比例2的岩藻黄素的含量的分析图。
图3是本申请实施例提供的实施例2、对比例1和对比例2的EPA的含量的分析图。
图4是本申请实施例提供的实施例2和对比例1、对比例3、对比例4发酵过程中细胞的聚集程度情况分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L。
在自然界中，硅元素是硅藻生长所需的营养元素之一，海洋中可溶性硅平均浓度约为36μM(约等于浓度10mg/L的九水硅酸钠),在大洋深水中达100～200μM(约等于浓度为28.4-56.8mg/L的九水硅酸钠)，且基于部分硅藻在添加极高浓度硅的培养基中生长会受到抑制，在现有技术中，平滑菱形藻培养中硅浓度通常为0～120mg/L。
本申请第一方面提供的一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L，采用了添加高浓度硅酸盐的培养基，降低了细胞聚集程度，保证在培养过程中，平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提高平滑菱形藻细胞的比表面积，进而提高发酵过程中藻细胞与环境交换介质等传质传热效率，以获得更高的岩藻黄素和EPA产量。因此，采用该含有高浓度硅酸盐的培养基进行平滑菱形藻培养，不仅不会对平滑菱形藻细胞造成胁迫，而且能够大量提高岩藻黄素以及EPA的产量，促进岩藻黄素的广泛使用。
优选的，培养基包括硅酸盐，且硅酸盐的浓度为800～1200mg/L；控制硅酸盐的浓度为800～1200mg/L，使硅酸盐与基础培养基的各组分协同作用，进而保证采用添加该浓度的硅酸盐的培养基进行培养的过程中，平滑菱形藻细胞生长优异，得到的细胞均为单细胞，较好地提高了单细胞的比表面积，大幅促进了发酵过程中藻细胞与环境交换介质等传质传热效率，能够获得更高的岩藻黄素和EPA产量。
优选的，硅酸盐选自硅酸钠、硅酸钾、硅酸氨中的至少一种。选择不同种类的硅酸盐进行添加，只要保证硅酸盐在培养基中的浓度达到要求即可，且所选的硅酸盐避免在培养基中引入杂质离子。
在一些实施例中，硅酸盐选自硅酸钠，硅酸钠的化学式为Na2O·nSiO2(n为1.5～2)，是一种可溶性的无机硅酸盐，采用硅酸钠溶液作为硅酸盐添加至培养基中，可保证培养基中的硅含量，有利于平滑菱形藻的生长。在本发明具体实施例中，硅酸钠选自固体硅酸钠或液体硅酸钠。
在一些实施例中，硅酸盐选自硅酸钾，硅酸钾是无色或微黄色半透明至透明玻璃状物，溶解性较强，采用硅酸钾作为硅酸盐添加至培养基中，可保证培养基中的硅含量，有利于平滑菱形藻的生长。
在一些实施例中，硅酸盐选自硅酸氨，硅酸氨的性质比较不稳定，易发生分解。在本发明优选实施例中，当选择硅酸氨时，可选择硅酸钠或硅酸钾协同作用，提高作用效果。
优选的，基础培养基包括如下浓度的各组分：NaCl 10～15g/L；MgSO4·7H2O 2.18～2.5g/L；CaCl2·2H2O 0.27～0.3g/L；KH2PO4 0.045～0.05g/L；K2HPO4 0.0054～0.0060g/L；FeCl3·6H2O 2.17～2.2mg/L；KCl 0.54～0.6mg/L；ZnCl 0.281～0.285mg/L；CoCl2·6H2O 0.011～0.015mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024～0.030mg/L；H3BO3 30.56～30.60g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278～0.280mg/L；NaNO3 2～2.5g/L；H2SO4 8.92～8.95μg/L；Tris缓冲液0.892～0.895g/L；维生素B12(15～15.5)×10-5g/L；生物素(25～25.5)×10-5g/L；有机氮源1～1.5g/L；有机碳源5～20g/L。提供基础培养基除了包括高浓度硅酸盐含量，还含有以上添加量的各营养组分，使平滑菱形藻在生长过程中营养充足，使各营养物质与硅酸盐协同作用，在高浓度硅酸盐的作用下，保证平滑菱形藻为单细胞生长，提高细胞个比表面积，促进平滑菱形藻细胞与培养基中各营养组分的交换速率，以提高岩藻黄素和EPA的产量。
进一步优选的，基础培养基包括如下浓度的各组分：NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；有机氮源1g/L；有机碳源5g/L。
优选的，在培养基中，有机氮源选自胰蛋白胨、酵母粉、酵母提取物、尿素、氨基酸中的至少一种，选择胰蛋白胨、酵母粉、酵母提取物、尿素、氨基酸中的至少一种作为有机氮源，能够提高微生物的发酵速率，促进微生物对氮源的吸收，同时提高微生物的发酵效果，促进岩藻黄素的生产。在本发明实施例中，有机氮源选自胰蛋白胨。
优选的，在培养基中，有机碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖中的至少一种，选择葡萄糖、果糖、蔗糖中的至少一种作为有机碳源，能够提高微生物的发酵速率，促进微生物对氮源的吸收，同时提高微生物的生长效果，促进岩藻黄素的生产。在本发明实施例中，有机碳源选自葡萄糖。
在本发明具体实施例中，基础培养基包括如下浓度的各组分：NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L。
优选的，控制培养基的pH值为8.5～9.5，控制培养基的pH为碱性条件，更有利于平滑菱形藻进行发酵生长，能够促进发酵效率，提高平滑菱形藻对培养基各营养组分的吸收，进而提高岩藻黄素的产量。
本申请第二方面提供一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，包括如下步骤：
S01.根据提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基并进行灭菌处理，得到无菌培养基；
S02.提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为5％～20％的接种量接种至无菌培养基中，进行摇床培养，得到发酵液；
S03.对发酵液进行提取，得到岩藻黄素。
本申请第二方面提供的一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，该方法以含有浓度为800～3000mg/L的硅酸盐用于培养平滑菱形藻的培养基进行培养，采用高浓度硅酸盐含量的培养基进行平滑菱形藻培养，在培养过程中，使平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提供了藻细胞的比表面积，促进发酵过程中与环境交换介质的效率，进而提高岩藻黄素和EPA的产量。该培养方法能够大量提高岩藻黄素以及EPA的产量，操作简单，同时也能缩短生产周期，提高生产产率及生产效率，有效降低生产成本，有利于规模化生产，提高了岩藻黄素的广泛使用。
在步骤S01中，提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基的具体添加组分，各组分的添加量如上文，为了节约篇幅，此处不再进行赘述。
进一步，配置培养基并进行灭菌处理的步骤中，将配置好的培养基于121℃条件下灭菌处理20～25分钟，得到无菌培养基，以进行后续发酵试验。
在步骤S02中，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液的步骤中，将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液。培养3～7天后得到的种子液中，平滑菱形藻细胞处于对数生长期，细胞生长速度较快，进行接种之后可快速生长。
进一步，将种子液按照体积比为5％～20％的接种量接种至无菌培养基中，进行摇床培养，得到发酵液。控制种子液按照体积比为5％～20％的接种量进行接种，可以保证平滑菱形藻的生长优异，使得到的藻细胞生长为单细胞，不会出现聚集现象，提供了藻细胞的比表面积，促进发酵过程中与环境交换介质的效率，进而提高岩藻黄素和EPA的产量。同时能够较好地控制培养周期，提高生产效率。若接种量过少，则平滑菱形藻细胞生长量过少，不利于获得产量多的岩藻黄素；若接种量过量，则会导致培养基的营养不足，使平滑菱形藻在生长过程中缺乏营养物质，影响细胞的生长以及岩藻黄素的产生。
优选的，进行摇床培养的步骤中，摇床培养的条件如下：培养温度为20～25℃，培养周期为3～11天，摇床转速为200～250转/分钟。
进一步优选的，在培养过程中可选择光照条件进行培养或选择避光条件进行培养。
在一些实施中，进行床培养的步骤中，摇床培养的条件如下：在光照条件下，控制培养温度为20～25℃，摇床转速为200～250转/分钟，培养3～11天。
在一些实施例中，进行床培养的步骤中，摇床培养的条件如下：避光条件下，控制培养温度为20～25℃，摇床转速为200～250转/分钟，培养3～11天。
在步骤S03中，对发酵液进行提取，得到岩藻黄素。优选的，采用甲醇溶液在常规的提取条件下对发酵液进行提取，得到岩藻黄素。
优选的，采用高效液相色谱(HPLC)对提取得到的岩藻黄素进行检测。在检测过程中，色谱分离采用Alliancee 2695分离模块(Waters，美国)，配置2998二极管阵列检测器(Waters，美国)和反相C18柱(250mm×4.6mm,5μm,Waters，美国)。流动相由(A)甲醇:异丙醇＝68:32(v/v)和(B)乙腈:甲醇:水＝84:2:14(v/v/v)组成。梯度洗脱程序为：0～15min，0-100％A；15-41分钟，100％A；41-42分钟，0-100％B；42-45分钟，100％B；流速为0.8mL min-1，注射体积10mol/L。类胡萝卜素的色谱峰在450nm处检测到。
优选的，对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA，并采用GC-MS对EPA进行检测。检测过程中，气相色谱-质谱(GC-MS)，配备db-蜡毛细管柱(30m×0.25mm×0.25浊度m)(Agilent,CA,USA)。采用十七烷酸(C17:0,Sigma-Aldrich)作为内标。以氦气为载气，流速为1.2mL/min。离子温度为200℃，界面温度为240℃。样品以分流比为19:1的方式，在45℃的烤箱温度下进行注射，注射体积为1μL。以15℃min-1的速率将烤箱温度提高到150℃，然后以6℃min-1的速率将烤箱温度提高到240℃，并保持8分钟。。
优选的，平滑菱形藻选自平滑菱形藻UTEX 2047、平滑菱形藻CCMP 559、平滑菱形藻CCMP 1092、平滑菱形藻O-7中的至少一种。本申请提供的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法可广泛应用于各个种类的平滑菱形藻。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠800mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为15％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为20℃，摇床转速为250转/分钟，培养3天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
实施例2
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠960mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为18％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
实施例3
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钾1000mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO40.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为10％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
实施例4
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠和硅酸氨的混合物1200mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B1215×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为15％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为25℃，摇床转速为250转/分钟，培养7天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
实施例5
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钾2000mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO40.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为20％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为25℃，摇床转速为200转/分钟，培养10天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
实施例6
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钾和硅酸氨的混合溶液3000mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl0.281mg/L；CoCl2·6H2O 0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B1215×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3～7天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为20％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为25℃，摇床转速为250转/分钟，培养10天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
对比例1
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠0mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为18％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
对比例2
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠64mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为18％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
对比例3
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠240mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为18％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
对比例4
一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法
该方法包括如下步骤：
根据的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基，其中培养基包括：硅酸钠480mg/L；NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO4 0.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；胰蛋白胨1g/L；葡萄糖5g/L；调节培养基pH为8.5，并于121℃进行灭菌处理20分钟，得到无菌培养基；
将活化的平滑菱形藻置于无菌的种子培养基中进行培养3天，形成种子液，提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将种子液按照体积比为18％的接种量接种至无菌培养基中，在避光条件下，控制培养温度为23℃，摇床转速为250转/分钟，培养5天进行摇床培养，得到发酵液；
对发酵液进行提取，得到岩藻黄素；并对发酵液进行干燥甲酯化处理，得到EPA。
性能测试：
对实施例2、对比例1和对比例2进行测试分析，主要测试生物量比生长速率的比值、岩藻黄素含量、EPA含量，以及分析实施例2和对比例1、对比例3、对比例4发酵过程中细胞的聚集程度情况。
结果分析：
对实施例2、对比例1和对比例2的生物量比生长速率的比值、岩藻黄素含量、EPA含量进行分析。如图1所示，对比例1的生物量比生长速率的比值为0，对比例2的生物量比生长速率的比值为0.4d-1，实施例2的生物量比生长速率的比值为0.75d-1，可见，实施例2采用浓度为960mg/L的硅酸钠溶液添加至培养基中，可以提高平滑菱形藻发酵过程中的生物量。
如图2所示，进一步分析实施例2、对比例1和对比例2的岩藻黄素的含量。对比例1的岩藻黄素的产量约为9mg/L，岩藻黄素占细胞干重的百分含量为0.1％；对比例2的岩藻黄素的产量约为10mg/L，岩藻黄素占细胞干重的百分含量为0.5％；实施例2的岩藻黄素的产量约为18mg/L，岩藻黄素占细胞干重的百分含量为1.75％；可见，实施例2采用浓度为960mg/L的硅酸钠溶液添加至培养基中，可以大幅提高岩藻黄素的产量。
如图3所示，进一步分析实施例2、对比例1和对比例2的EPA的含量。对比例1的EPA的产量约为25mg/L，EPA占细胞干重的百分含量为0.1％；对比例2的EPA的产量约为25mg/L，EPA占细胞干重的百分含量为0.8％；实施例2的EPA的产量约为60mg/L，岩藻黄素占细胞干重的百分含量为3.5％；可见，实施例2采用浓度为960mg/L的硅酸钠溶液添加至培养基中，可以大幅提高EPA的产量。
进一步分析分析实施例2和对比例1、对比例3、对比例4发酵过程中细胞的聚集程度情况，如图4所示，图4A和图4B为对比例1发酵过程中细胞的聚集程度情况，可见平滑菱形藻细胞之间聚集程度密集，形成堆叠状；图4C和图4D为对比例3发酵过程中细胞的聚集程度情况，可见平滑菱形藻细胞之间聚集程度密集，形成块状堆叠；图4E和图4F为对比例4发酵过程中细胞的聚集程度情况，可见平滑菱形藻细胞之间聚集程度密集，形成块状堆叠；图4G和图4H为实施例2发酵过程中细胞的聚集程度情况，可见平滑菱形藻细胞之间无明显聚集情况，由图4H可以明确看出各细胞之间为单细胞状态。
综上，采用高浓度硅酸盐含量的培养基进行平滑菱形藻培养，在培养过程中，使平滑菱形藻的细胞均为单细胞生长，不会出现聚集现象，提供了藻细胞的比表面积，促进发酵过程中与环境交换介质的效率，进而提高岩藻黄素和EPA的产量。该培养方法能够大量提高岩藻黄素以及EPA的产量，操作简单，同时也能缩短生产周期，提高生产产率及生产效率，有效降低生产成本，有利于规模化生产，提高了岩藻黄素的广泛使用。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，包括用于培养平滑菱形藻的基础培养基，还包括硅酸盐，且所述硅酸盐溶解于所述基础培养基中，且所述硅酸盐的浓度为800～3000mg/L。
2.根据权利要求1所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述硅酸盐的浓度为800～1200mg/L。
3.根据权利要求1所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述硅酸盐选自硅酸钠、硅酸钾、硅酸氨中的至少一种。
4.根据权利要求1～3任一所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括如下浓度的各组分：
NaCl 10～15g/L；MgSO4·7H2O 2.18～2.5g/L；CaCl2·2H2O 0.27～0.3g/L；KH2PO40.045～0.05g/L；K2HPO4 0.0054～0.0060g/L；FeCl3·6H2O 2.17～2.2mg/L；KCl 0.54～0.6mg/L；ZnCl 0.281～0.285mg/L；CoCl2·6H2O 0.011～0.015mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024～0.030mg/L；H3BO3 30.56～30.60g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278～0.280mg/L；NaNO3 2～2.5g/L；H2SO4 8.92～8.95μg/L；Tris缓冲液0.892～0.895g/L；维生素B12(15～15.5)×10- 5g/L；生物素(25～25.5)×10-5g/L；有机氮源1～1.5g/L；有机碳源5～20g/L。
5.根据权利要求4所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述培养基包括如下浓度的各组分：
NaCl 10g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.27g/L；KH2PO4 0.045g/L；K2HPO40.0054g/L；FeCl3·6H2O 2.17mg/L；KCl 0.54mg/L；ZnCl 0.281mg/L；CoCl2·6H2O0.011mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L；H3BO3 30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.278mg/L；NaNO3 2g/L；H2SO4 8.92μg/L；Tris缓冲液0.892g/L；维生素B12 15×10-5g/L；生物素25×10-5g/L；有机氮源1g/L；有机碳源5g/L。
6.根据权利要求5所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述有机氮源选自胰蛋白胨、酵母粉、酵母提取物、尿素、氨基酸中的至少一种；和/或，
所述有机碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖中的至少一种。
7.根据权利要求1～3任一所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为8.5～9.5。
8.一种提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
根据权利要求1～7任一所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的培养基配置培养基并进行灭菌处理，得到无菌培养基；
提供平滑菱形藻进行活化处理得到的种子液，将所述种子液按照体积比为5％～20％的接种量接种至所述无菌培养基中，进行摇床培养，得到发酵液；
对所述发酵液进行提取，得到所述岩藻黄素。
9.根据权利要求8所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，其特征在于，进行摇床培养的步骤中，所述摇床培养的条件如下：培养温度为20～25℃，培养周期为3～11天，摇床转速为200～250转/分钟。
10.根据权利要求8所述的提高平滑菱形藻中岩藻黄素产量的方法，其特征在于，所述平滑菱形藻选自平滑菱形藻UTEX 2047、平滑菱形藻CCMP 559、平滑菱形藻CCMP 1092、平滑菱形藻O-7中的至少一种。
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